嚴(yán)鋼莉　李朝武　聶海嶺　黎逢光　成勇　毛高峰　方煌　魏海燕　謝軍

430012　武漢，解放軍161醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

?

丹參川芎嗪注射液對(duì)Aβ?lián)p傷的PC12細(xì)胞保護(hù)作用及機(jī)制研究

嚴(yán)鋼莉李朝武聶海嶺黎逢光成勇毛高峰方煌魏海燕謝軍

430012武漢，解放軍161醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

【摘要】目的探討丹參川芎嗪注射液對(duì)Aβ?lián)p傷的PC12細(xì)胞可能的保護(hù)作用及機(jī)制。方法將PC12細(xì)胞分為5組：空白對(duì)照組(未加任何處理藥物)、Aβ誘導(dǎo)組(20 μmol/L Aβ處理組)和預(yù)處理組(分別加入濃度為5 ml/L、10 ml/L、20 ml/L的丹參川芎嗪注射液孵育24 h后加20 μmol/L Aβ)，通過(guò)CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，Hoechst 33258染色觀察PC12細(xì)胞核的改變，熒光分光光度計(jì)測(cè)定LDH、SOD、GSH及caspase-3活性水平，免疫組織化學(xué)方法觀察細(xì)胞色素C(Cyt-C)蛋白釋放水平，Western Blot檢測(cè)Bcl-2的表達(dá)水平。結(jié)果丹參川芎嗪注射液(5、10、20 ml/L)預(yù)處理對(duì)Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷有較好的保護(hù)作用，其保護(hù)作用隨著藥物濃度的增加而增強(qiáng)。它能增加Aβ?lián)p傷的PC12細(xì)胞增殖活力，減少Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞核凝聚現(xiàn)象，抑制Aβ?lián)p傷的PC12細(xì)胞LDH釋放，增強(qiáng)SOD和GSH活性，促進(jìn)Cyt-C在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，降低caspase-3活性，促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)。結(jié)論丹參川芎嗪注射液對(duì)Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷具有與線粒體通路相關(guān)的保護(hù)作用，其保護(hù)作用與它抑制細(xì)胞凋亡、抗氧化應(yīng)激、維持線粒體正常功能、抑制caspase-3的激活、促進(jìn)抗凋亡因子Bcl-2的表達(dá)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】丹參川芎嗪注射液AβPC12細(xì)胞凋亡神經(jīng)保護(hù)

阿爾茲海默病(Alzheimer,s disease，AD)是較常見(jiàn)的中老年神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為進(jìn)行性記憶能力下降、認(rèn)知功能障礙和精神行為的異常，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。AD在老年期癡呆中發(fā)病率最高，約占癡呆患者的50%~60%。隨著人口老齡化的加速，AD的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[1]。

尸檢發(fā)現(xiàn)，AD患者腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)大量凋亡、神經(jīng)元細(xì)胞外老年斑沉積和胞內(nèi)神經(jīng)元纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFT)，其主要是由于β-淀粉樣蛋白(β amyloid protein, Aβ)、自由基、興奮性氨基酸、神經(jīng)毒素、Ca2+超載、炎癥等有害因子的共同作用所致[2-3]。因此，國(guó)內(nèi)外均有將Aβ誘導(dǎo)具有神經(jīng)元細(xì)胞特性的PC12細(xì)胞作為病體外AD細(xì)胞模型[4]。

近年國(guó)內(nèi)有報(bào)道證實(shí)川芎嗪、丹參素均具有神經(jīng)保護(hù)作用，可參與神經(jīng)組織修復(fù)。川芎嗪的化學(xué)結(jié)構(gòu)為四甲基吡嗪(TMP)，可透過(guò)血腦屏障，通過(guò)阻滯鈣離子通道、清除氧自由基、影響內(nèi)皮素和NO合成等對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生多種作用，具有擴(kuò)張血管、抑制血小板聚集、改善微循環(huán)、抗脂質(zhì)氧化等作用[5-6]。丹參素可改善腦損傷所致的線粒體氧化磷酸化功能障礙，抑制腦損傷對(duì)線粒體的損害；丹參素還可以穩(wěn)定線粒體膜電位(MMP)，調(diào)節(jié)神經(jīng)元的能量代謝抑制其凋亡[7-8]。

本研究擬以Aβ誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷建立AD細(xì)胞模型，通過(guò)細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等實(shí)驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行深入研究，探討丹參川芎嗪注射液對(duì)Aβ誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的可能保護(hù)作用及機(jī)制，為AD防治提供新的治療途徑。

1材料與方法

1.1試劑

丹參川芎嗪注射液(貴州拜特制藥有限公司，含鹽酸川芎嗪100 mg與丹參素2 mg)；Aβ25-35(美國(guó)Sigma公司)，-20℃保存，使用前7 d用去離子水配置(終濃度1 mmol/L)置于37℃水浴箱孵育；高糖培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清(FBS)(美國(guó)Gibco公司)；AnnexinV-FITC、PI(碘化丙啶)、CCK-8、Hoechst 33258(上海碧云天生物公司)；LDH、SOD、GSH測(cè)試盒、caspase-3試劑盒(上海宸凜生物公司)，Cyt-C抗體、Bc1-2抗體、GAPDH抗體(艾博抗上海貿(mào)易有限公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及處理

PC12細(xì)胞為大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所，使用含10% FBS+100 U/ml青霉素的DMEM 5% CO237℃培養(yǎng)箱孵育。待細(xì)胞在培養(yǎng)皿內(nèi)生長(zhǎng)密度達(dá)單層70%，0.25%胰蛋白酶常規(guī)消化，細(xì)胞傳代培養(yǎng)。按實(shí)驗(yàn)要求確定細(xì)胞的接種密度。PC12細(xì)胞分組如下：(1)空白對(duì)照組未加任何處理藥物；(2)Aβ誘導(dǎo)組加入Aβ 20 μmol/L處理；(3)預(yù)處理組分別加入終濃度為5、10、20 ml/L的丹參川芎嗪注射液孵育24 h后再加入Aβ 20 μmol/L。同批實(shí)驗(yàn)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。所有的實(shí)驗(yàn)在相同的條件下重復(fù)3次。

1.3細(xì)胞增殖活力測(cè)定

CCK-8測(cè)定各組細(xì)胞活力。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1.6×103/孔種植于96孔板。細(xì)胞分組處理后，每孔加入1 ul的CCK-8溶液，37℃下孵育1 h，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀570 nm處測(cè)量每孔的吸光度值。細(xì)胞活力以與空白組相比的百分比表示。

1.4FCM檢測(cè)

PC12細(xì)胞以2.5×105/mL的密度接種于60 mm培養(yǎng)皿，分組處理后收集，1500 r/min離心7 min，棄上清，預(yù)冷的PBS溶液沖洗沉淀2次，將細(xì)胞密度調(diào)整為1×106/mL；70%冰乙醇懸浮細(xì)胞4℃固定過(guò)夜，1500 r/min 4℃離心10 min，PBS沖洗沉淀2次，細(xì)胞重新懸浮于1 mL的結(jié)合緩沖液，加入AnnexinV-FITC 10 μL、PI 5 μL，4℃避光孵育30 min，即刻上機(jī)檢測(cè)。PI用氬離子激發(fā)熒光，激發(fā)光波波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射光波波長(zhǎng)大于630 nm，流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。

1.5細(xì)胞核染色檢測(cè)

PC12細(xì)胞接種于蓋玻片，按分組要求處理，預(yù)冷的PBS漂洗細(xì)胞2次，4%多聚甲醛 4℃包埋45 min，PBS沖洗后加入Hoechst 33258溶液(10 μg/mL)，室溫避光放置5 min，用含抗熒光衰退功能的介質(zhì)包埋，熒光顯微鏡觀察拍照。正常的細(xì)胞核為彌漫且均勻的低強(qiáng)度熒光；凋亡的細(xì)胞核為濃染致密的固縮形態(tài)或者發(fā)出顆粒樣熒光。凋亡率=凋亡細(xì)胞/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.6LDH、SOD、GSH活力測(cè)定

PC12細(xì)胞按1~2×105/孔接種于24孔板中，分組處理后PBS沖洗，1500 r/min離心7 min，收集細(xì)胞，預(yù)冷的PBS沖洗，懸浮于0.5 ml的緩沖液，4℃ 3000 r/min離心17 min。取上層液，使用全自動(dòng)定量酶標(biāo)儀分別在波長(zhǎng)440 nm、550 nm、412 nm處進(jìn)行LDH、SOD及GSH活力測(cè)定，活力值使用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。

1.7caspase-3 酶活性檢測(cè)

按照Caspase-3試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。細(xì)胞分組處理后收集細(xì)胞，懸浮于細(xì)胞裂解緩沖液(25 μL/106個(gè)細(xì)胞)，冰上裂解10 min，4℃ 15000 r/min離心17 min，50 μL上清液、148 μL結(jié)合緩沖液(含DMSO 2 μL、0.1 mM DTT 10 μL)、2 μL DEVD-pNA(caspase-3顯色底物)混合后加入96孔黑板，避光孵育4 h。酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)405 nm處檢測(cè)吸光光度值。

1.8Cyt-C免疫細(xì)胞化學(xué)染色

PC12細(xì)胞常規(guī)爬片、藥物處理后，用預(yù)冷的PBS漂洗細(xì)胞3 min×2次，再次清洗、固定及封閉，加入1∶100的一抗，4℃過(guò)夜。用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的1∶100的二抗室溫孵育30 min，PBS沖洗3 min×3次；加入SABC復(fù)合物37℃孵育15 min，PBS沖洗3 min×3次；DAB顯色后使用蘇木素復(fù)染、乙醇梯度脫水、二甲苯透明，最后封片觀察。光鏡下觀察。

1.9Western blotting

各組細(xì)胞裂解后提取總蛋白，根據(jù)申能博彩BCA法測(cè)定蛋白水平，蛋白進(jìn)行定量后將上樣蛋白配置為每孔70 ug/10 uL。SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜，脫脂牛奶封閉，室溫封閉1 h，加入一抗(1∶500)，4℃過(guò)夜。第2 d加入二抗HRP(1∶500)，室溫1 h，洗滌3次后，使用ABI Veriti顯影、拍照。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1丹參川芎嗪注射液對(duì)Aβ引起的PC12細(xì)胞增殖活力的影響

與未處理的空白組(空白對(duì)照組)PC12細(xì)胞比較，5、10、15、20、25、30 μmol/L劑量組細(xì)胞活力分別下降了19.3%、30.4%、56.5%、26.9%、19.7%(P<0.05)(圖1A)。與Aβ組比較，5、10、20 ml/L丹參川芎嗪注射液預(yù)處理組(預(yù)處理組)細(xì)胞活性分別上升16.2%、30.4%、36.6%(P<0.05)(圖2)。

2.2丹參川芎嗪注射液對(duì)Aβ?lián)p傷的PC12細(xì)胞凋亡率的影響

空白對(duì)照組大多為正?；罴?xì)胞，凋亡細(xì)胞占16.8%；Aβ 15 μmol/L處理后凋亡細(xì)胞增加至56.4%(P<0.05)；丹參川芎嗪注射液(5、10、20 ml/L)預(yù)處理組凋亡細(xì)胞數(shù)目減少，分別為34.0% (P<0.05)、23.2%(P>0.05)和19.2%(P>0.05)。與Aβ誘導(dǎo)組比較，丹參川芎嗪注射液(5、10、20 ml/L)預(yù)處理組凋亡率分別增加22.4%、33.2%、37.2%(P<0.05)(圖2)。

圖1 PC12細(xì)胞活力 A為不同濃度Aβ對(duì)PC12細(xì)胞活力影響;B為不同水平丹參川芎嗪注射液對(duì)Aβ?lián)p傷的PC12細(xì)胞活力影響;與空白對(duì)照組比較,*P<0.05;與Aβ誘導(dǎo)組比較,#P<0.05

圖2 PC12細(xì)胞凋亡率 與空白對(duì)照組比較,*P<0.05,與空白對(duì)照組比較,ΔP>0.05;與Aβ誘導(dǎo)組比較,#P<0.05

2.3丹參川芎嗪注射液對(duì)Aβ?lián)p傷的PC12細(xì)胞核的影響

空白對(duì)照組細(xì)胞保持正?；钚约?xì)胞的細(xì)胞核狀態(tài)(圖3A)；Aβ誘導(dǎo)組中大多數(shù)PC12細(xì)胞發(fā)生凋亡，出現(xiàn)細(xì)胞核凝聚、DNA斷裂 (圖3B)。丹參川芎嗪注射液預(yù)處理組(10 ml/L)PC12細(xì)胞核凝聚現(xiàn)象較Aβ誘導(dǎo)組明顯減弱，即凋亡細(xì)胞減少，活性細(xì)胞數(shù)目增多(圖3C)。

2.4丹參川芎嗪注射液對(duì)Aβ?lián)p傷的PC12細(xì)胞的LDH、GSH、SOD活力的影響

與空白對(duì)照組比較，Aβ誘導(dǎo)組LDH釋放增加，SOD、GSH活性下降，P<0.05；與Aβ誘導(dǎo)組比較，丹參川芎嗪注射液(5、10、20 ml/L)預(yù)處理組LDH釋放減少，而SOD和GSH活性明顯升高，且該改變與丹參川芎嗪注射液水平有關(guān)(P<0.05)(圖4)。

圖3 細(xì)胞核Hoechst33258染色 A為空白對(duì)照組;B為Aβ誘導(dǎo)組;C為10ml/L的丹參川芎嗪注射液孵育24h后加入15μmol/LAβ

圖4 LDH、GSH、SOD活力測(cè)定 與空白對(duì)照組比較,*P<0.05;與Aβ誘導(dǎo)組比較,#P<0.05

2.5丹參川芎嗪注射液對(duì)Aβ?lián)p傷的PC12細(xì)胞Cyt-C免疫活性影響

空白對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)良好，Cyt-C免疫化學(xué)染色呈淡棕黃色，均勻分布于胞質(zhì)及突起內(nèi)；Aβ誘導(dǎo)組部分細(xì)胞變圓、皺縮，Cyt-C在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)增強(qiáng)，呈深棕黃色；相對(duì)于Aβ誘導(dǎo)組，丹參川芎嗪注射液預(yù)處理組Cyt-C在細(xì)胞內(nèi)著色變淺,細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)也有改善(圖5)。

2.6丹參川芎嗪注射液對(duì)Aβ?lián)p傷的PC12細(xì)胞caspase-3活性的影響

與空白對(duì)照組比較，Aβ誘導(dǎo)組、丹參川芎嗪注射液(5、10 ml/L)預(yù)處理組細(xì)胞caspase-3活性升高(P<0.05)，丹參川芎嗪注射液(20 ml/L)預(yù)處理組細(xì)胞caspase-3活性變化不顯著(P>0.05)。與Aβ誘導(dǎo)組比較，丹參川芎嗪注射液(5、10、20 ml/L)預(yù)處理組細(xì)胞caspase-3活性明顯下降(P<0.05)，且下降程度與丹參川芎嗪水平有關(guān)(圖6)。

圖5 Cyt-C免疫組織化學(xué)化染色 A為空白對(duì)照組;B為Aβ誘導(dǎo)組;C為10ml/L的丹參川芎嗪注射液孵育24h后加入15umol/LAβ

圖6 caspase-3活性測(cè)定 與空白對(duì)照組比較,*P<0.05,ΔP>0.05,與Aβ誘導(dǎo)組比較,#P<0.05

2.7丹參川芎嗪注射液對(duì)Aβ?lián)p傷的PC12細(xì)胞Bcl-2的影響

與空白對(duì)照組比較，Aβ誘導(dǎo)組和丹參川芎嗪預(yù)處理組Bcl-2的表達(dá)水平均出現(xiàn)下降(P<0.05)。與Aβ誘導(dǎo)組比較，丹參川芎嗪注射液(5 ml/L)預(yù)處理組Bcl-2的表達(dá)水平差異不明顯(P>0.05)；丹參川芎嗪注射液(10、20 ml/L)預(yù)處理組Bcl-2的表達(dá)水平顯著增加，其增加幅度隨丹參川芎嗪注射液的藥物水平增加而增加(P<0.05)(圖7)。

圖7 各組Bcl-2表達(dá)水平 與空白對(duì)照組比較,*P<0.05;△P>0.05;與Aβ誘導(dǎo)組比較,#P<0.05

3討論

盡管近些年來(lái)生物化學(xué)、分子生物學(xué)、流行病學(xué)、遺傳學(xué)等學(xué)科發(fā)展使我們更進(jìn)一步認(rèn)識(shí)AD，但對(duì)AD的病因和發(fā)病機(jī)理還存在很多不明因素。通常認(rèn)為AD是多基因遺傳疾病，發(fā)病原因與年齡、性別、能量代謝障礙、免疫功能異常、內(nèi)分泌、感染等遺傳和環(huán)境因素有關(guān)。在各種AD發(fā)病學(xué)中β淀粉樣蛋白學(xué)說(shuō)、氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)、神經(jīng)遞質(zhì)代謝障礙學(xué)說(shuō)是AD發(fā)生發(fā)展普遍公認(rèn)的機(jī)制。最近研究提示，Aβ可與N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor, NMDA受體)結(jié)合，從神經(jīng)細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)到胞內(nèi)，再與A單體裝配形成寡聚體Aβ，進(jìn)一步促進(jìn)tau蛋白的過(guò)度磷酸化和神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFT)，引起胞內(nèi)Ca2+超載、線粒體氧化損傷及氧化應(yīng)激[9-11]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)與Aβ誘導(dǎo)組比較，丹參川芎嗪注射液孵育后細(xì)胞增殖活力增加、凋亡減少，表明Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷受到丹參川芎嗪注射液的抑制。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)丹參川芎嗪注射液孵育后受損細(xì)胞的SOD、GSH活性提高，而LDH的釋放減少。該結(jié)果表明丹參川芎嗪注射液的神經(jīng)元保護(hù)作用與細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)聯(lián)，其可以激活細(xì)胞內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)的防御反應(yīng)，清除異常增多的活性氧成分。

很多研究顯示，在神經(jīng)退行性疾病患者的海馬區(qū)存在有caspases蛋白的活化。Caspases為半胱氨酸蛋白酶家族，在啟動(dòng)神經(jīng)元異常凋亡途徑中有重要影響，因此是AD發(fā)病的主要途徑之一[12-13]，其中Caspase-3被認(rèn)為是促進(jìn)細(xì)胞死亡的較為常見(jiàn)的細(xì)胞內(nèi)蛋白酶。內(nèi)源性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體的凋亡途徑亦在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起其關(guān)鍵性作用[14-15]。多種刺激因子如淀粉樣蛋白β、腫瘤壞死因子α、活性氧、化學(xué)治療、DNA損傷劑和輻射等均能損傷線粒體，增加線粒體膜通透性(MOMP)，促進(jìn)因子如Cyt-C、Omi等從線粒體內(nèi)釋放到細(xì)胞液，直接或間接啟動(dòng)Caspases相關(guān)凋亡途徑[16-18]。Bcl-2家族是線粒體凋亡的重要調(diào)控因子。Bcl-2能改變MOMP，減少凋亡促進(jìn)因子的釋放[19]；Bcl-2能降低BAX介導(dǎo)的Cyt-C釋放、抑制Caspase激活、抑制凋亡誘導(dǎo)蛋白(AIF)從線粒體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核[20-21]。同時(shí)Bcl-2還能促進(jìn)氧化應(yīng)激下的DNA修復(fù)[22]。因此，本研究可以認(rèn)為抑制Caspases激活、促進(jìn)凋亡抑制蛋白Bcl-2的高表達(dá)可減少細(xì)胞凋亡，促進(jìn)受損神經(jīng)元細(xì)胞的功能恢復(fù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，Aβ?lián)p傷PC12細(xì)胞后Caspase-3活性明顯增強(qiáng)，細(xì)胞核出現(xiàn)凝聚，Cyt-C表達(dá)增強(qiáng)，而丹參川芎嗪注射液預(yù)處理后Caspase-3活性被顯著抑制，細(xì)胞核凝聚現(xiàn)象改善，Cyt-C表達(dá)減少，凋亡抑制因子Bcl-2的表達(dá)量隨著丹參川芎嗪注射液水平增加而增加。該結(jié)果說(shuō)明丹參川芎嗪注射液預(yù)處理對(duì)PC12細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)作用可能通過(guò)抑制Caspases-3活性、改善MMOP、促進(jìn)Bcl-2表達(dá)等途徑實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，丹參川芎嗪注射液具有強(qiáng)大的抗氧化、抗凋亡活性，對(duì)Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷有著多重的保護(hù)作用，也許可以用來(lái)治療如AD等神經(jīng)變性疾病。

參考文獻(xiàn)

[1]Bames DE,Yaffe K.The projected effect of risk factor reduction on Alzheimer’s disease prevalence[J].Lancet Neurol,2011,10(9):819-828.

[2]Matveev SV,Spielmann HP,Metts BM,et al.A distinct subfraction of Aβ is responsible for the high-affinity Pittsburgh compound B-binding site in Alzheimer’s disease brain[J].J Neurochem,2014,131(3):356-368.

[3]Veerhuis R.Histological and direct evidence for the role of complement in the neuroinflammation of AD[J].Curr Alzheimer Res,2011,8(1):34-58.

[4]Ma B,Meng X,Wang J,et al.Notoginsenoside R1 attenuates amyloid-β-induced damage in neurons by inhibiting reactive Oxygen species and modulating MAPK activation[J].Int Immunopharmacol,2014,22(1):151-159.

[5]溫旭敏,魏濤,白利萍,等.川芎嗪對(duì)H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用研究[J].中國(guó)藥物與臨床,2013,13(1):25-27.

[6]納鑫,汪雪蘭,皮榮標(biāo).川芎嗪對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥理作用及其機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中藥新藥與臨床藥理,2008,19(1):77-80.

[7]殷明偉,王利枝,蔣燕,等.七味中藥對(duì)酒精致PC12細(xì)胞保護(hù)作用的研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2012,23(7):1602-1604.

[8]Meng XF,Zou XJ,Peng B,et al.Inhibition of ethanol-induced toxicity by tanshinone IIA in PC12 cells[J].Acta Pharmacol Sin,2006,27(6):659-664.

[9]Salazar-Weber NL,Smith JP.Copper inhibits NMDA Receptor-lndependent LTP and modulates the Paired-Pulse ratio after LTP in mouse hippocampal slices[J].Int J Alzheimers Dis,2011,2011:864753.

[10]Chohan MO,Iqbal K.From tau to toxicity: emerging roles of NMDA receptor in Alzheimer's disease[J].J Alzheimers Dis,2006,10(1):81-87.

[11]Pohanka M.Alzheimer′s disease and oxidative stress:a review[J].Curr Med Chem,2013,21(3):356-364.

[12]Lee S,Shea TB.Caspase-mediated truncation of tau potentiates aggregation[J].Int J Alzheimers Dis,2012:731063.

[13]Rohn TT,Head E.Caspase activation in Alzheimer's disease: early to rise and late to bed[J].Rev Neurosci,2008,19(6):383-393.

[14]Luo DJ,Feng Q,Wang ZH,et al.Knockdown of phosphotyrosyl phosphatase activator induces apoptosis via mitochondrial pathway and the attenuation by simultaneous tau hyperphosphorylation[J].J Neurochem,2014,130(6):816-825.

[15]Yan MH,Wang X,Zhu X.Mitochondrial defects and oxidative stress in Alzheimer disease and Parkinson disease[J].Free Radic Biol Med,2013,62:90-101.

[16]Krajewski S,Bodrug S,Krajewska M,et al.Immunohistochemical analysis of Mcl-1 protein in human tissues. Differential regulation of Mcl-1 and Bcl-2 protein production suggests a unique role for Mcl-1 in control of programmed cell death in vivo[J].Am J Pathol,1995,146(6):1309-1319.

[17]Naderi J,Somayajulu-Nitu M,Mukerji A,et al.Water-soluble formulation of Coenzyme Q10 inhibits Bax-induced destabilization of mitochondria in mammalian cells[J].Apoptosis,2006,11(8):1359-1369.

[18]Verma YK,Gangenahalli GU,Singh VK,et al.Cell death regulation by B-cell lymphoma protein[J].Apoptosis,2006,11(4):459-471.

[19]Liu J,Li ZS,Wan XJ,et al.Expression and function of apoptosis-related genes Bcl-2/Bax and Fas/Fas L in the course of stress ulcer[J].Zhonghua Yi Xue Za Zhi,2003,83(6):504-509.

[20]Cui S,Sun Y,Liu C.Effect of bushenyisui formula on brain tissue apoptosis and Bcl-2 in beta-amyloid protein-induced Alzheimer's disease rat models[J].Journal of Traditional Chinese Medicine,2012,32(4):646-650.

[21]Onyango I,Khan S,Miller B,et al.Mitochondrial genomic contribution to mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease[J].J Alzheimers Dis,2006,9(2):183-193.

[22]Onyango I,Khan S,Miller B,et al.Mitochondrial genomic contribution to mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease[J].J Alzheimers Dis,2006,9(2):183-193.

(2015-09-07收稿)

【DOI】10.3969/j.issn.1007-0478.2016.01.005

Protective effects and mechanism of salvia and TMP injection on Aβ-induced injury in PC12 cellsYanGangli,LiChaowu,NieHailing,etal.DepartmentofNeurology,TheChinesePLA161thHospital,Wuhan430012

【Abstract】ObjectiveTo observe the possible protective effect and mechanism of Salvia and TMP injection on Aβ-induced injury in PC12 cells.MethodsPC12 cells were divided into five groups: control gruop, Aβ-induced Injury in PC12 cells (Treatment with 20 μmol/L Aβ alone); Pretreatment group ( Pretreatment with 5ml/L, 10ml/L, 20 ml/L Salvia and TMP Injection on Aβ-induced Injury in PC12 cells). Then the cell viability was measured by CKK-8, apoptotic rate was measured by flow cytometry, variation of nucleus was measured by Hoechst33258 dye, and the vitality of LDH, SOD, GSH and caspase-3 were measured by the kits, respectively. Immunohistochemical method was used to observe Cyt-C protein release. And western blot was used to detecting Bcl-2 protein expression.ResultsSalvia and TMP injection (5,10,20 μmol/L) pretreatment can protect the PC12 cells injuried by Aβ which protective effect was increased with higher drug concentration. Salvia and TMP injection can promote cells proliferation, reduces apoptosis and nuclei condensation, inhibit LDH release, increase SOD, GSH activation, decrease caspase-3 activation, help Cyt-C and Bcl-2 generation.ConclusionSalvia and TMP injection have neuroprotective effect of PC12 cells induced by Aβ which was related with anti-oxidative stress, maintenance of mitochondrial function, improvement of the anti-apoptotic factor Bcl-2 and inhibition of caspase-3 activation. Salvia and TMP injection may be used to cure neurodegenerative disease such as AD.

【Key words】Alvia and TMP injectionAβPC12 cellsApoptosisNeuroprotection

【中圖分類(lèi)號(hào)】R741

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1007-0478(2016)01-0015-06

基金項(xiàng)目：湖北省衛(wèi)計(jì)委科研基金資助項(xiàng)目(批準(zhǔn)號(hào)WJ2015MB130)