程炳娟，劉戈力，李寧，楊箐巖，鄭榮秀

?

特發(fā)性矮小生長激素受體外顯子3基因多態(tài)性與生長激素軸的關(guān)系

程炳娟1，劉戈力2△，李寧3，楊箐巖2，鄭榮秀2

摘要：目的探討生長激素受體（GHR）外顯子3基因型與特發(fā)性矮小（ISS）患者生長激素-胰島素樣生長因子-胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白（GH-IGFs-IGFBPs）軸的關(guān)系。方法選取108例ISS兒童，提取外周血DNA并采用多重PCR法進(jìn)行GHR外顯子3基因分型，根據(jù)基因型結(jié)果分為GHRfl組和GHRd3組。測量2組身高、體質(zhì)量，并計(jì)算體質(zhì)指數(shù)（BMI）及BMI標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)分（SDS）；測定空腹胰島素樣生長因子(IGF)-1、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白（IGFBP）-3，計(jì)算IGF-1 SDS、IGFBP3 SDS；同時(shí)進(jìn)行生長激素激發(fā)試驗(yàn)，測定血清GH峰值。108例中選取55例自愿接受重組人生長激素[rhGH，0.15 IU/（kg·d）]治療3個(gè)月，分析基因型與rhGH治療后IGF-1水平的關(guān)系。結(jié)果108例ISS中GHRfl 63例，GHRd3 45例。2組間BMI、IGF-1、IGFBP3、GH峰值以及IGF-1 SDS、IGFBP3 SDS差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P > 0.05)；多元逐步回歸分析示年齡、IGFBP3、lg（BMI）、lg（GH峰值）是lgIGF-1的影響因素（均P < 0.05）；55例接受rhGH治療ISS中GHRd3組（34例）IGF-1和IGF-1 SDS治療前后差值（△IGF-1,△IGF-1 SDS）高于GHRfl組（21例）。結(jié)論ISS兒童GHR外顯子3基因多態(tài)性可能與IGF-1及IGFBP3水平無關(guān)，與GH敏感性有關(guān)。

關(guān)鍵詞：特發(fā)性矮小；受體,促生長素；基因多態(tài)性；胰島素樣生長因子-1；胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-3；體質(zhì)指數(shù)

GH）和生長激素受體（growthhormone receptor，

GHR）結(jié)合信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中因子的基因多態(tài)性有關(guān)。GH與GHR結(jié)合后可通過JAK2/STAT5信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活胰島素樣生長因子基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)線性生長和代謝[1]。由于GHR基因外顯子3全長型（GHR exon 3 full-length，GHRfl）內(nèi)在的長末端重復(fù)序列重組，導(dǎo)致GHR基因外顯子3存在多態(tài)性[2]。

這種常見的多態(tài)性導(dǎo)致GHR細(xì)胞外區(qū)域23個(gè)殘基和糖基化位點(diǎn)的丟失，由此造成的GHR基因3缺失型（GHR exon 3 -deleted，GHRd3）多態(tài)性不會(huì)影響

GH與GHR結(jié)合，而是與異常的生長激素-胰島素樣生長因子-胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白（GHIGFs-IGFBPs）軸有關(guān)[3]。有研究認(rèn)為GHR基因多態(tài)性可影響血清胰島素樣生長因子-1( insulin-like growth factor -1，IGF-1)水平，從而影響生長軸的功能，可能是部分ISS發(fā)病的危險(xiǎn)因素[4]。本文主要探究特發(fā)性矮小兒童GHR外顯子3基因多態(tài)性與

IGF-1、IGFBP3及GH敏感性的關(guān)系。

1　對象與方法

1.1研究對象選取2014年6月—2015年6月在天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院兒科內(nèi)分泌門診就診的108例ISS兒童。男61例，女47例，年齡3～15歲,中位年齡8.2歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）身高低于同年齡同性別正常兒童標(biāo)準(zhǔn)身高2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差或第3百分位數(shù)。（2）GH激發(fā)試驗(yàn)中，GH峰值>7.0mg/L[5]。（3）血常規(guī)、甲狀腺功能、肝腎功能、血糖、胰島素、電解質(zhì)檢查均無異常。（4）出生體質(zhì)量及身長在正常范圍內(nèi)。（5）排除其他遺傳代謝病、染色體異常、先天性骨骼異常和慢性疾病。（6）頭顱下丘腦垂體區(qū)未見異常。108例ISS兒童中，55例愿意接受重組人生長激素（rhGH）治療，其中男29例，女26例，年齡3～14歲，中位年齡9歲。

1.2主要試劑及儀器全基因組DNA快速提取試劑盒（離心柱型）、PCRmasterMix、擴(kuò)增引物均購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；IGF-1、IGFBP3、GH配套試劑及immulite 2000化學(xué)發(fā)光免疫分析儀均購自SIMENS公司；鹽酸可樂定（75 μg/片）購自常州制藥廠有限公司；溴吡斯的明（60mg/片）購自上海三維長江制藥廠；rhGH（30 IU/支）購自長春金賽藥業(yè)有限責(zé)任公司。

1.3方法

1.3.1GHR外顯子3基因多態(tài)性檢測收集108例ISS兒童全血標(biāo)本，提取淋巴細(xì)胞中DNA。根據(jù)參考文獻(xiàn)[2]采用多重PCR法檢測GHR外顯子3基因多態(tài)性。PCR上游引物G1：5′-TGTGCTGGTCTGTTGGTCTG-3′；下游引物G2：5′-AGTCGTTCCTGGGACAGAGA- 3′；G3：5′- CCTGGATTAA?CACTTTGCAGACTC-3′。PCR反應(yīng)體系：2×Mastermix 25 μL，上、下游引物（10 μmoL）各2 μL，模板DNA 5 μL，補(bǔ)蒸餾水至總體積50 μL。反應(yīng)條件：94℃5min；94℃30 s，60℃30 s，72℃90 s；72℃延長7min，35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離并判定其基因型。GHR外顯子3存在fl/fl（無外顯子3缺失的純合子），fl/d3（有一條染色體缺失外顯子3的雜合子）以及d3/d3（2條染色體都缺失外顯子3的純合子）3種基因型。GHR fl和GHR d3長度分別為935 bp和532 bp。為避免假性純合子GHR d3，每個(gè)d3/d3基因型進(jìn)行第2次PCR確保實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性[6]。

1.3.2臨床及生化指標(biāo)測定測量108例ISS兒童身高和體質(zhì)量，計(jì)算體質(zhì)指數(shù)（BMI），為消除性別及年齡的影響，同時(shí)BMI標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)分（SDS）[7-8]?？崭谷≈庹徐o脈血1次，測定IGF-1和IGFBP3水平，并根據(jù)同性別、同年齡健康兒童參考值計(jì)算IGF-1 SDS[9]、IGFBP3 SDS[10]，剩余樣本用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3生長激素激發(fā)試驗(yàn)108例患兒口服相應(yīng)劑量的溴吡斯的明（1mg/kg，最大量60mg）和鹽酸可樂定（4 μg/kg，最大量150 μg），分別于給藥后30min，60min，90min各取1次血，測定其GH水平，取最高值作為GH峰值。

1.3.4rhGH治療后IGF-1水平測定55例自愿接受rhGH治療的患兒每晚睡前皮下0.15 IU/（kg·d）注射1次，3個(gè)月后空腹取血測定IGF-1，并計(jì)算IGF-1差值（△IGF-1）及IGF-1差值SDS (△IGF-1 SDS)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有資料均通過Shapiro-Wilk test進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，正態(tài)分布計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；偏態(tài)分布資料采用M(P25，P75)表示，組間比較采用Mann-Whit?ney U檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用例（%）表示，Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)采用卡方檢驗(yàn)，回歸分析采用多重線性回歸分析。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1基因多態(tài)性結(jié)果GHR基因外顯子3基因多態(tài)性結(jié)果見圖1。108例患者中，基因型fl/fl、fl/d3、d3/d3分別為63、38、7例，符合Hardy-Weinberg平衡（χ2=0.170，P > 0.05），提示本研究所選擇人群代表性較好，能代表ISS人群一般情況。

Fig.1　Agarose gel electrophoresis of GHR exon 3圖1　GHR外顯子3瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2臨床生化指標(biāo)比較將108例患兒按照基因型分為GHRfl組（63例）和GHRd3組（45例）。2組間年齡、性別、BMI、GH峰值、IGF-1、IGFBP3差別均無統(tǒng)計(jì)意義；將BMI、IGF-1、IGFBP3轉(zhuǎn)換為SDS后，差異同樣無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

Tab.1　Comparison of clinical and biochemical parameters between two groups表1　各組間臨床和生化指標(biāo)的比較

2.3IGF-1、IGFBP3值的多元逐步回歸分析將非正態(tài)分布的IGF-1、GH峰值、BMI數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)g轉(zhuǎn)換為正態(tài)分布，以年齡、lgGH峰值、lgBMI、IGFBP3、GHR外顯子3基因型為自變量，lgIGF-1為因變量進(jìn)行逐步多元回歸分析。結(jié)果顯示年齡、IGFBP3、 lgGH峰值、lgBMI是IGF-1的影響因素，GHR外顯子3基因型因素被排除，見表2。以年齡、lgGH峰值、lgBMI、lgIGF-1、GHR外顯子3基因型為自變量，IGFBP3為因變量進(jìn)行逐步多元回歸分析，結(jié)果顯示只有年齡和IGF-1是IGFBP3的影響因素，見表3。

Tab.2　Multiple stepwise regression analysis of influencing factors of IGF-1 level in children of ISS表2　ISS患兒IGF-1水平影響因素的多重逐步回歸分析

Tab.3　Multiple stepwise regression analysis of influencing fctors of IGFBP3 level in children of ISS表3　ISS患兒IGFBP3水平影響因素的多重逐步回歸分析

2.4GH治療后IGF-1水平變化55例ISS患者基因型fl/fl、fl/d3、d3/d3分別為34、18、3例，符合Hardy- Weinberg平衡（χ2=0.08，P > 0.05），分為GHRfl組（34例）和GHRd3組（21例）。2組間年齡、性別、基礎(chǔ)IGF-1及IGF-1 SDS差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)rhGH治療后，GHRd3組△IGF-1、△IGF-1 SDS高于GHRfl組（P < 0.05），見表4。

Tab.4　IGF-1 response to GH treatment in two groups表4　2組間IGF-1對rhGH治療反應(yīng)

3　討論

GH-IGFs-IGFBPs軸是調(diào)節(jié)兒童生長發(fā)育中最重要的神經(jīng)內(nèi)分泌軸。GH的促生長作用由IGF系統(tǒng)介導(dǎo)，它包括IGFs、IGFBPs、IGF受體及通過GH直接作用的IGF獨(dú)立效應(yīng)。IGF-1的生物學(xué)作用廣泛，可促進(jìn)細(xì)胞的生長、分化、成熟，并可抑制細(xì)胞凋亡，介導(dǎo)GH對機(jī)體的促生長作用[11]。IGFBP3是人體內(nèi)IGF-1主要載體蛋白，受IGF-1水平的調(diào)控。IGFBP3與IGF-1結(jié)合后，能夠維持IGF-1水平恒定，兩者可作為評估生長失調(diào)的指標(biāo)。本研究中筆者評估了可能與GHRd3基因型有關(guān)的GH軸相關(guān)因子及臨床指標(biāo)，以及rhGH治療后IGF-1的水平變化。發(fā)現(xiàn)GHRfl組基礎(chǔ)IGF-1 SDS、IGFBP3 SDS 與GHRd3組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與Ballerini等[4]研究結(jié)果一致，表明GHR外顯子3基因多態(tài)性對基礎(chǔ)IGF-1、IGFBP3生成無影響。多重逐步回歸分析也同樣顯示GHR外顯子3基因型不是基礎(chǔ)IGF-1、IGFBP3生成的影響因素。

有報(bào)道指出42% ISS患兒BMI低于正常，且低BMI ISS表現(xiàn)為一定程度的IGF-1抵抗[12-13]。本研究顯示BMI是IGF-1影響因素之一，考慮BMI與IGF-1抵抗可能存在關(guān)系。BMI是營養(yǎng)狀況一個(gè)相對的總指標(biāo)，可以解釋GH治療后的IGF-1水平差異[13]。ISS患者的rhGH治療劑量是通過體質(zhì)量計(jì)算的，同時(shí)需將IGF-1水平考慮在內(nèi)。在低BMI ISS患兒中，為了減少以體質(zhì)量為基礎(chǔ)計(jì)算的生長激素劑量的負(fù)性影響，rhGH劑量應(yīng)該根據(jù)體表面積計(jì)算，即使調(diào)整計(jì)算方法，低BMI ISS兒童每日rhGH劑量也會(huì)輕微低于正常BMI ISS兒童的劑量。

本研究中55例ISS兒童經(jīng)3個(gè)月rhGH治療后IGF-1 SDS均有增長，GHRd3組明顯高于GHRfl組，提示對GH不敏感可能是ISS的病因之一。IGF-1是GH作用線性生長的主要調(diào)節(jié)因子，在rhGH治療后IGF-1水平的增加是生長反應(yīng)的一個(gè)標(biāo)志[14]。體外研究表明，轉(zhuǎn)染GHRd3型基因的人胚胎腎細(xì)胞比GHRfl型基因的轉(zhuǎn)錄活性更高[15]。遺傳藥理學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)GHRd3型ISS患者對rhGH治療療效較好[15-16]。另有研究提出在ISS兒童IGF-1激發(fā)試驗(yàn)中，GHRd3基因型患兒IGF-1升高更加明顯，支持GHRd3基因型較GHRfl基因型ISS對GH敏感性高[17]。但Hellgren等[18]發(fā)現(xiàn)ISS患者在rhGH治療初期，GHRfl組與GHRd3組IGF-1 SDS沒有區(qū)別，而GHRfl組中基礎(chǔ)IGFBP3水平低于GHRd3組，且經(jīng)過1年的rhGH治療后，IGF-1 SDS和IGFBP3 SDS的增加在2組中均無明顯差別。本研究只觀察3個(gè)月rhGH治療療效，由于時(shí)間較短，并未對身高作評估分析，仍需長期觀察GH治療后IGF-1變化及身高增長與基因型的關(guān)系。同時(shí)由于本研究樣本量相對較少，今后有待擴(kuò)大樣本深入研究。

參考文獻(xiàn)

[1] David A,hwa V,metherell LA, et al.Evidence for a continuum of genetic, phenotypic, and biochemical abnormalities in children with growthhormone insensitivity[J].Endocr Rev, 2011,32(4):472-497.doi: 10.1210/er.2010-0023.

[2] Pantel J,machinis K, SobriermL, et al.Species-specific alternative splicemimicry at the growthhormone receptor locus revealed by the lineage of retroelements during primate evolution[J].J Biol Chem, 2000,275(25):18664-18669.doi: 10.1074/jbc.M001615200.

[3] El KM,mella P, Rashadm, et al.Growthhormone/IGF-I axis and growthhormone receptormutations in idiopathic short stature[J].Horm Res Paediatr, 2011,76(5):300-306.doi: 10.1159/000330191.

[4] BallerinimG, DomenehM, Scaglia P, et al.Association of serum components of the GH-IGFs-IGFBPs system with GHR-exon 3 polymorphism in normal and idiopathic short stature children[J].Growthhorm IGF Res, 2013,23(6):229- 236.doi: 10.1016/j.ghir.2013.08.003.

[5] Cohen P, Germak J, Rogol AD, et al.Variable degree of growthhor?mone (GH) and insulin-like growth factor (IGF) sensitivity in chil?dren with idiopathic short stature compared with GH-deficient pa?tients: evidence from an IGF-based dosing study of short children [J].J Clin Endocrinolmetab, 2010,95(5):2089-2098.doi: 10.1210/jc.2009-2139.

[6] Audi L, Esteban C, Carrascosa A, et al.Exon 3-deleted/full-length growthhormone receptor polymorphism genotype frequencies in Spanish short small-for-gestational-age (SGA) children and adoles?cents (n=247) and in an adult control population (n=289) show in?creased fl/fl in short SGA[J].J Clin Endocrinolmetab, 2006,91(12): 5038-5043.doi:http://dx.doi.org/10.1210/jc.2006-0828.

[7] Cole TJ, Freeman JV, PreecemA.Bodymass index reference curves for the UK, 1990[J].Arch Dis Child, 1995,73(1):25-29.doi: 10.1136/adc.73.1.25.

[8] Zhang YQ, Lih, Ji CY, et al.Bodymass index growth curves for Chinese children and adolescents 0- 18 years[J].Chin J Pediatr, 2009,47(7):493.[張亞欽，李輝，季成葉，等.中國0一18歲兒童、青少年體塊指數(shù)的生長曲線[J].中華兒科雜志, 2009,47(7):493].

[9] Isojima T, Shimatsu A, Yokoya S, et al.Standardized centile curves and reference intervals of serum insulin-like growth factor-I (IGFI) levels in a normal Japanese population using the LMSmethod[J].Endocr J, 2012,59(9): 771-780.

[10] Guven B, Canm,mungan G, et al.Reference values for serum levels of insulin-like growth factor 1 (IGF-1) and IGF-binding protein 3 (IGFBP-3) in the West Black Sea region of Turkey[J].Scand J Clin Lab Invest, 2013,73(2):135-140.doi: 10.3109/00365513.2012.755739.

[11] Xia JJ, Zheng XY, Li LM, et al.Correlation between atherogenic in?dex of plasma level andmetabolism components in adult growthhor?mone deficiency patients[J].Med J Chin PLA, 2014,39(12):975-980.[夏佳佳，鄭曉雅，李林蔓，等.成人生長激素缺乏癥患者血漿致動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)與代謝組分變化的相關(guān)性分析[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2014, 39 (12):975-980].doi: 10.11855/j.issn.0577-7402.2014.12.10.

[12] Cengiz P, Bas F, Atalar F, et al.Growthhormone/insulin- like growth factor-1 axis as related to bodymass index in patients with idiopathic short stature[J].J Clin Res Pediatr Endocrinol, 2013,5(1): 13-19.doi: 10.4274/Jcrpe.901.

[13] Roman R, Iniguez G, Lammoglia JJ, et al.The IGF-I response to growthhormone is related to bodymass index in short children with normal weight[J].Horm Res, 2009,72(1):10- 14.doi: 10.1159/000224335.

[14] Cohen P, Rogol AD, Weng W, et al.Efficacy of IGF-based growthhormone (GH) dosing in nonGH-deficient (nonGHD) short stature children with low IGF-I is not related to basal IGF-I levels[J].Clin Endocrinol (Oxf), 2013,78(3):405-414.doi: 10.1111/cen.12014.

[15] Dos SC, Essioux L, Teinturier C, et al.A common polymorphism of the growthhormone receptor is associated with increased respon?siveness to growthhormone[J].Nat Genet, 2004,36(7):720-724.doi: 10.1038/ng1379.

[16] Jorge AA, Arnhold IJ.Growthhormone receptor exon 3 isoforms and their implication in growth disorders and treatment[J].Horm Res, 2009,71( Suppl 2):55-63.doi: 10.1159/0001924 38.

[17] ToyoshimamT, Castroneves LA, Costalonga EF, et al.Exon 3-delet?ed genotype of growthhormone receptor (GHRd3) positively influ?ences IGF-1 increase at generation test in children with idiopathic short stature[J].Clin Endocrinol (Oxf), 2007,67(4):500-504.

[18]hellgren G, Glad C A, Jonsson B, et al.The growthhormone recep?tor exon 3- deleted/full- length polymorphism and response to growthhormone therapy in prepubertal idiopathic short children[J].Growthhorm IGF Res, 2015,25(3):127- 135.doi: 10.1016/j.ghir.2015.02.003.

（2015-07-06收稿2015-09-09修回）

（本文編輯胡小寧）

讀者·作者·編者

Association of serum components of GH axis with GHR exon 3 polymorphism in idiopathic short stature children

CHENG Bingjuan1, LIU Geli2△，LI Ning3, YANG Jingyan2, ZHENG Rongxiu2

1 Graduate School of Tianjinmedical University, Tianjin 300070, China; 2 Department of Pediatric, 3 Department of Nuclearmedicine Laboratory, Generalhospital of Tianjinmedical University△Corresponding Author E-mail: liugeli2001@126.com

Abstract：Objective To investigate the possible association of circulating components of GH-IGFs-IGFBPs system with the GHR-exon 3 genotype in idiopathic short stature (ISS) children.Methods Genomic DNA was extracted and isolat?ed from peripheral leukocytes in 108 ISS children.GHR-exon 3 polymorphism was analyzed withmultiplex poly-merase chain reactions (PCR) assay.According to the results of genotype, ISS children were divided into GHRfl group and GHRd3 group.Theheight and weight were recorded in two groups.The bodymass index (BMI) and BMI standard deviation score (SDS) weremeasured.The serum levels of insulin-like growth factor (IGF) -1, IGF-binding protein (IGFBP)-3, IGF-1 SDS and IGFBP3 SDS were calculated.GH stimulation test was used tomeasure the serum GH peak value.Fifty-five ISS chil?dren were treated with recombinehuman GH [0.15 IU/(kg·d)] for threemonths to analyse the association of IGF-1 responsebook=79,ebook=84of GH treatment and genotypes.Results There were 63 GHRfl and 45 GHRd3 in 108 ISS children.There were no signifi?cant differences in BMI, IGF-1, IGFBP3, GH peak, IGF-1 SDS and IGFBP3 SDS between two groups (P > 0.05).Multiple stepwise regression analysis showed that age, IGFBP3, lg (BMI) and lg (GH peak) were influencing factors of lgIGF-1 (P < 0.05).In 55 ISS children treated with rhGH, there were 34 cases of GHRd3.The differences of△IGF-1 and△IGF-1 SDS werehigher in GHRd3 group than those of GHRfl group (n=21).Conclusion The GH sensitivitymay be a risk factor in ISS children, whichmay not be related with GHR polymorphism.

Key words：idiopathic short stature ; receptors, somatotropin; gene polymorphism; insulin-like growth factor 1; IGF-binding protein 3; bodymass index特發(fā)性矮小（idiopathic short stature，ISS）是指身高低于同種族、同年齡、同性別平均身高2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差，且排除其他特殊內(nèi)分泌疾病或器質(zhì)性病變的矮小癥。其病因可能與生長激素（growthhormone，

通訊作者△E-mail:liugeli2001@126.com

作者簡介：程炳娟（1989），女，碩士，主要從事小兒內(nèi)分泌研究

中圖分類號：R179

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI:10.11958/59137

作者單位：1天津醫(yī)科大學(xué)研究生院（郵編300070）；2天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院兒科；3天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院核醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室