向光明，劉焰

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慢性低氧肺動(dòng)脈高壓大鼠肺部PPARγ表達(dá)變化的意義

向光明1,2，劉焰1△

摘要：目的探討過(guò)氧化物酶增殖物激活受體γ（PPARγ）在慢性低氧肺動(dòng)脈高壓（HPAH）大鼠模型肺部及血管中的變化及意義。方法雄性SD大鼠40只，隨機(jī)分為正常（NC）組、1周低氧（HC-1w）組、2周低氧（HC-2w）組、3周低氧（HC-3w）組。NC組于常氧條件下飼養(yǎng)于通風(fēng)動(dòng)物籠中3周，其余低氧組動(dòng)物在每日9：00—17：00（8h/d）放入一體化低氧艙（O2體積分?jǐn)?shù)10%）中進(jìn)行低氧處理，時(shí)間分別為1周、2周、3周。右心導(dǎo)管法檢測(cè)平均肺動(dòng)脈壓（mPAP），右心室收縮期末壓力（RVSP）；解剖心臟計(jì)算右心室肥厚指數(shù)RV/(LV+S)。HE染色觀察各組肺部中小動(dòng)脈的形態(tài)學(xué)改變，計(jì)算血管壁厚百分比（WT%），Western blot方法檢測(cè)肺組織中PPARγ蛋白表達(dá)水平。結(jié)果HC各組大鼠mPAP、RVSP、RV/(LV+S)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)均較NC組明顯升高（P < 0.05）。血管形態(tài)學(xué)顯示HC各組相對(duì)于NC組，血管壁明顯增厚，血管腔變狹窄，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)，狹窄和增厚的程度加深。PPARγ在HC各組的表達(dá)與NC組相比均呈明顯下降趨勢(shì)，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)，下降趨勢(shì)更加明顯。結(jié)論P(yáng)PARγ對(duì)慢性低氧肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生和發(fā)展有著重要的意義。

關(guān)鍵詞：高血壓,肺性；缺氧；過(guò)氧化物酶增殖物激活受體γ；大鼠, Sprague-Dawley；低氧性肺動(dòng)脈高壓

因此，PPARγ可能在呼吸系統(tǒng)生理和呼吸系統(tǒng)疾病中扮演重要的角色。本研究觀察PPARγ在慢性低氧肺動(dòng)脈高壓大鼠肺部表達(dá)變化，嘗試闡述其病理機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料健康雄性SD大鼠40只，200～250 g，由三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。低氧艙（OxyCyclermodel A84XOV，美國(guó)Biospherix公司），Nikon&Spot圖像采集處理系統(tǒng)（日本Nikon公司），RM-6280多道智能生理信號(hào)記錄系統(tǒng)（成都儀器廠），兔抗大鼠PPARγ多克隆抗體、兔抗大鼠βactin多克隆抗體、山羊抗兔多克隆抗體（美國(guó)genetex公司），DAB顯色試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.2方法

1.2.1大鼠HPAH模型的建立將40只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，每組10只：正常組（NC），1周低氧（HC-1w）組，2周低氧（HC-2w）組，3周低氧（HC-3w）組。HC各組每天9:00—17:00（8h/d）進(jìn)入一體化低氧艙（O2體積分?jǐn)?shù)10%）中進(jìn)行低氧造模處理，正常組飼養(yǎng)于通風(fēng)常氧動(dòng)物籠內(nèi)。在造模期間，各組大鼠均給予充足的食物和水自由攝取。

1.2.2血流動(dòng)力學(xué)測(cè)定在1周末、2周末分別檢測(cè)HC-1w組、HC-2w組大鼠血流動(dòng)力學(xué)，3周末檢測(cè)HC-3w組和NC組大鼠血流動(dòng)力學(xué)。將大鼠做頸部正中切口，分離皮下組織及肌肉后暴露出右頸外靜脈，使用一直徑1mm聚乙烯塑料微導(dǎo)管內(nèi)裝肝素溶液（生理鹽水＋肝素10 U/mL）緩慢進(jìn)入其中，另外一端連接壓力感受器。注意生理記錄儀壓力波形變化及導(dǎo)管進(jìn)入深度，判斷導(dǎo)管前端位置。導(dǎo)管途經(jīng)上腔靜脈依次進(jìn)入右心房、三尖瓣口、右心室，直至肺動(dòng)脈干，長(zhǎng)度大約進(jìn)入3.5～4.0 cm。待波形穩(wěn)定3～5min后測(cè)量平均肺動(dòng)脈壓（mPAP）及右心室收縮期末壓力（RVSP）。記錄完畢后，處死大鼠，剪取心臟，剪去心房組織，分離出右心室（RV）和左心室+室間隔（LV+S）后濾紙吸干，稱RV和LV+S質(zhì)量，計(jì)算右心室肥厚指數(shù)RV/（LV+S）。

1.2.3肺動(dòng)脈形態(tài)學(xué)指標(biāo)觀察剪取右肺組織塊，甲醛固定，石蠟包埋、連續(xù)切片及HE染色，選取顯色較好，彈力層清晰的直徑小于150 μm中小肺動(dòng)脈(15 μm＜管徑＜150 μm)。于400倍光鏡下觀察形態(tài)變化。圖像采集處理系統(tǒng)分析計(jì)算血管壁厚百分比（WT%），公式：（外彈力膜直徑－內(nèi)彈力膜直徑）/外彈力膜直徑×100%。獲取的大鼠動(dòng)脈圖片采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分組，每組大鼠測(cè)量8～10個(gè)中型肺動(dòng)脈及小型肺動(dòng)脈取其均值。

1.2.4蛋白印跡檢測(cè)PPARγ的表達(dá)變化冰上勻漿肺部組織塊，加裂解液后4℃條件下12 000 r/min離心取上清分裝，BCA蛋白含量測(cè)試盒測(cè)定各組細(xì)胞總蛋白濃度。各組上樣30 μg總蛋白，SDS-PAGE電泳2h后轉(zhuǎn)PVDF膜，5%脫脂奶粉溶液封閉1h，加入1∶400稀釋兔抗大鼠β-actin，1∶200稀釋兔抗大鼠PPARγ，4℃孵育過(guò)夜后TBST溶液洗滌10min×3次，1∶5 000稀釋山羊抗兔二抗，室溫孵育2h TBST液洗滌10min×3次。利用化學(xué)發(fā)光ECL試劑顯影，并曝光掃描拍照，用Quantity One軟件分析各組條帶中PPARγ蛋白的相對(duì)表達(dá)，分析其與內(nèi)參蛋白β-actin的比值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用sigma plot軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)用±s表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較用SNK-q法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較NC組、HC-1w組、HC-2w組、HC-3w組的mPAP、RVSP和RV/(LV+S)依次增高，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P< 0.05），見表1。

Tab.1　Comparison ofmPAP, RVSP and index of right ventricularhypertrophy between four groups表1　各組mPAP、RVSP和右心肥厚指數(shù)比較（n=10,±s）

Tab.1　Comparison ofmPAP, RVSP and index of right ventricularhypertrophy between four groups表1　各組mPAP、RVSP和右心肥厚指數(shù)比較（n=10,±s）

＊P < 0.05，＊＊P < 0.01；a與NC組比較，b與HC-1w組比較，c與HC-2w組比較，P < 0.05；表2同；1mmHg=0.133 kPa

NC組HC-1w組HC-2w組HC-3w組F 16.4±3.1 20.1±2.8a27.4±3.3ab39.1±2.4abc117.415＊＊28.8±2.0 32.9±1.9a39.3±4.5ab47.3±3.8abc61.594＊＊24.1±4.3 29.7±2.9a33.8±4.5ab38.7±3.4abc26.141＊＊

2.2肺動(dòng)脈形態(tài)學(xué)指標(biāo)的變化NC組小動(dòng)脈血管內(nèi)膜光滑完整，血管壁不厚，肌層無(wú)明顯增厚，外膜無(wú)增生及纖維化表現(xiàn)。HC-1w組血管內(nèi)膜開始不光整，血管壁稍增厚，肌層及外膜輕微增生及纖維化。HC-2w較HC-1w組血管重塑程度加深。HC-3w組血管明顯重塑，內(nèi)膜不光滑，管壁增厚，管腔狹窄，肌層及外膜增生明顯，纖維化嚴(yán)重。NC組、HC-1w組、HC-2w組、HC-3w組的WT%依次增高，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）見圖1、表2。

Fig.1　Pulmonary arterymorphological changes in four groups of rats圖1　各組大鼠肺動(dòng)脈形態(tài)學(xué)變化（HE染色，×400）

Tab.2　Comparison of WT% and PPARγ expression between four groups表2　各組WT%和PPARγ蛋白表達(dá)比較（n=10，±s）

Tab.2　Comparison of WT% and PPARγ expression between four groups表2　各組WT%和PPARγ蛋白表達(dá)比較（n=10，±s）

組別NC組HC-1w組HC-2w組HC-3w組F WT% 8.8±0.4 11.6±2.5a13.7±2.7ab15.8±2.2abc19.293＊PPARγ 0.84±0.05 0.71±0.09a0.54±0.08ab0.23±0.04abc34.341＊

2.3各組PPARγ的表達(dá)變化比較NC組、HC-1w組、HC-2w組、HC-3w組的PPARγ表達(dá)依次降低，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)，降低趨勢(shì)更加明顯，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2、圖2。

Fig.2　Expression of PPARγ protein in four groups圖2　各組PPARγ蛋白表達(dá)

3　討論

肺動(dòng)脈高壓（pulmonary arterialhypertension, PAH）并非一個(gè)單獨(dú)的疾病，而是多種原因誘發(fā)引起的一類綜合征，發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。HPAH在肺動(dòng)脈高壓分類中屬第三大類，HPAH的病理變化首先是異常的肺血管收縮（hypoxic pulmonary vaso?constriction,HPV），主要是在低氧環(huán)境中肺部血管不規(guī)則痙攣[4]，但是間斷甚至持續(xù)的HPV無(wú)疑會(huì)極大加重右心負(fù)荷[5]，促進(jìn)產(chǎn)生肺血管重塑（pulmonary ar?tery remodeling,PAR）。持續(xù)的低氧造成血管內(nèi)皮的損傷，各種生長(zhǎng)因子和血管活性物質(zhì)分泌失調(diào)，外加血流動(dòng)力學(xué)紊亂對(duì)血管的物理性沖擊，肺動(dòng)脈各層可出現(xiàn)異常細(xì)胞增殖凋亡及遷移現(xiàn)象[6-7]。肺中小血管處于缺氧環(huán)境加重HPV，反過(guò)來(lái)HPV加重PAR進(jìn)一步加重缺氧，造成惡性循環(huán)，直至右心衰竭乃至全心衰竭，機(jī)體死亡[8-9]。

既往研究證明PPARγ在血管的重塑和增加血管通透性方面有重要作用[10]。PPARγ受體激動(dòng)劑通過(guò)PI3K/Akt/NO信號(hào)通路可顯著改善血管內(nèi)皮依賴性舒張功能。PPARγ的天然配體或者人工合成配體都可與內(nèi)皮上的PPARγ結(jié)合，PPARγ一旦被激活，可抑制一氧化氮合成酶[11]、清道夫受體A基因和血栓素合成酶基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，阻止血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移，減弱內(nèi)皮素的分泌，從一定程度上弱化血管重塑[12]。PPARγ還可以對(duì)單核細(xì)胞趨化蛋白（MCP-l）及其受體CCRZ的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行抑制，減緩巨噬細(xì)胞向血管炎癥部位聚集。同時(shí)抑制白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-8和腫瘤壞死因子（TNF）-α等炎癥因子，全面減輕血管損傷后的炎癥反應(yīng)[13]。PPARγ標(biāo)志性激動(dòng)劑羅格列酮已經(jīng)在PAH動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用，證實(shí)對(duì)HPAH有一定積極療效，且PPARγ阻斷劑GW9662可顯著阻斷羅格列酮的作用，為HPAH的臨床防治提供了新的思路[14]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著低氧時(shí)間延長(zhǎng)，大鼠肺部PPARγ表達(dá)下降，提示PPARγ在HPAH動(dòng)物模型中的表達(dá)和低氧密切相關(guān)，PPARγ的表達(dá)可能是HPAH新的治療靶點(diǎn)。但是PPARγ如何具體地在低氧肺血管重塑中發(fā)揮作用，離體實(shí)驗(yàn)是否有同樣趨勢(shì)，都是以后值得深入研究的問(wèn)題。

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（2015-06-07收稿2015-08-17修回）

（本文編輯李國(guó)琪）

The significance of PPARγ expression in lung tissue of rats withhypoxic pulmonaryhypertension

XIANG Guangming1,2, LIU Yan1△
1 Basicmedical College, Wuhan University, Wuhan 430071, China; 2 Institute of Respiratory Disease, China Three Gorges University, Yichang Central People′shospital△Corresponding Author E-mail:liuyan@whu.edu.cn

Abstract:Objective To investigate the significance of peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)γ expression in the lung tissue of rats with chronichypoxic pulmonaryhypertension (HPAH).Methods Fortymale Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups (n=10 for each group): normal control group (NC),hypoxia control group-one-week (HC-1w),hypoxia control group-two-week (HC-2w) andhypoxia control group-three-week (HC-3w).Normal control group was raised under normal oxygen condition in ventilated animal cage for three weeks.The otherhC groups were placed in a low oxygen chamber (O2concentration of 10%) from 9：00 AM-5:00 PM (8h/d) everyday by one week, two weeks and three weeks.Themean pulmonary arterial pressure (mPAP), right ventricular systolic pressure (RVSP) were detected.The index of right ventricularhypertrophy RV/(LV+S) wasmeasured by dissecting ratheart.Themorphological changes of the small pul?monary arteries were observed byhE staining, and the percentage of vascular wall thickness (WT%) was calculated.The ex?pression level of PPARγ protein was detected by Westren blot assay.Results ThemPAP, RVSP and RV/(LV+S) were sig?nificantlyhigher inhC groups than those of NC group (P<0.05).Themorphology of pulmonary arteries showed vessel wall thickening and vessel lumina stenosis inhC groups compared with that of NC group.The PPARγ expression in lung tissue was significantly lower inhC groups than that of NC group, and the downward trend wasmore obvious with the extension of time.Conclusion PPARγ plays an important role in the occurrence and development of chronichypoxic pulmonaryhyper?tension.

Key words:hypertension, pulmonary; anoxia; PPAR gamma; rats, Sprague-Dawley;hypoxic pulmonary arteryhyper?tensionbook=57,ebook=62低氧性肺動(dòng)脈高壓（hypoxic pulmonary arteryhy?pertension,HPAH）主要病因?yàn)楦咴膊』蚍尾考膊≌T發(fā)的慢性持續(xù)缺氧狀態(tài)。近年來(lái)，隨著空氣污染及霧霾的嚴(yán)重，肺部基礎(chǔ)疾病如慢性阻塞性肺疾?。–OPD）等繼發(fā)性缺氧疾病明顯增加，HPAH發(fā)病率和死亡率有所上升。HPAH患者療效差，成為呼吸內(nèi)科的臨床難點(diǎn)問(wèn)題之一[1]。過(guò)氧化物酶增殖物激活受體（PPAR）是一類包含PPAR-α、β/δ和γ 3種亞型的核轉(zhuǎn)錄因子超家族，為異質(zhì)二聚體，其隸屬于維甲酸X受體[2]。PPARγ在呼吸道上皮、呼吸道平滑肌、肺部血管內(nèi)皮及支氣管黏膜下層均有不同程度的表達(dá)。PPARγ可抑制血管平滑肌增殖，影響血管內(nèi)皮功能及內(nèi)皮素-1（endothelin-1,ET-1）分泌[3]。

通訊作者△E-mail：liuyan@whu.edu.cn

作者簡(jiǎn)介：向光明（1968），男，副主任醫(yī)師，主要從事呼吸衰竭研究

基金項(xiàng)目：湖北省自然科學(xué)基金指導(dǎo)性計(jì)劃項(xiàng)目（2014CFC1037）

中圖分類號(hào)：R563

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI:10.11958/59062

作者單位：1武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（郵編430071）；2三峽大學(xué)呼吸病研究所，宜昌市中心人民醫(yī)院