肖榮，康馬飛，駱梅青，董翠梅，劉秀麗

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重組人白細(xì)胞介素-11對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

肖榮，康馬飛△，駱梅青，董翠梅，劉秀麗

摘要:目的觀察重組人白細(xì)胞介素-11（rhIL-11）對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，并初步探討其影響機(jī)制。方法分別以0、10、20、50、100 μg/L終濃度的rhIL-11作用于A549細(xì)胞，MTT法測定A549細(xì)胞增殖程度；用0、10、40、80 μg/L終濃度的rhIL-11作用于A549細(xì)胞，劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)測定A549細(xì)胞的遷移和侵襲能力；Western blot檢測基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2和MMP-9蛋白水平的表達(dá)。結(jié)果rhIL-11對(duì)A549細(xì)胞增殖能力無影響；rhIL-11作用于A549細(xì)胞后，細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著增強(qiáng)；rhIL-11能顯著上調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)，且表達(dá)隨rhIL-11濃度的增高而增高（P < 0.05）。結(jié)論rhIL-11能夠促進(jìn)A549細(xì)胞的遷移和侵襲，促進(jìn)MMP-2、MMP-9上調(diào)為其可能的機(jī)制之一。

關(guān)鍵詞：白細(xì)胞介素11；癌,非小細(xì)胞肺；細(xì)胞遷移分析；腫瘤侵潤；基質(zhì)金屬蛋白酶2；基質(zhì)金屬蛋白酶9；重組人白細(xì)胞介素11

白細(xì)胞介素（IL）-11屬于IL -6因子家族，是一種由人骨髓基質(zhì)細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞分泌的多功能細(xì)胞因子。重組人白細(xì)胞介素11（rhIL-11）因參與調(diào)控血小板的生成而被臨床用于治療各種原因引起的血小板減少癥，尤其是放化療后的血小板減少。然而，研究發(fā)現(xiàn)，rhIL-11對(duì)胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力有促進(jìn)作用[1]。但rhIL-11對(duì)A549肺腺癌細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲能力的影響尚鮮見報(bào)道。本研究旨在觀察rhIL-11對(duì)人肺腺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞增殖、遷移與侵襲能力的影響，并對(duì)其可能的機(jī)制進(jìn)行探討。

1　材料與方法

1.1主要材料與試劑人非小細(xì)胞肺腺癌細(xì)胞株A549購自中科院上海細(xì)胞保藏中心。細(xì)胞培養(yǎng)基購自美國GIBICO公司。胎牛血清購自Hyclone。細(xì)胞培養(yǎng)板購自廣州杰特生物公司。Transwell小室購自美國BD公司。兔源GAPDH抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9抗體購自萬類生物公司。羊抗兔二抗購自北京中杉金橋有限公司。rhIL-11由齊魯制藥有限公司生產(chǎn)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)人肺腺癌A549細(xì)胞培養(yǎng)于含10%的胎牛血清PRMI1640培養(yǎng)液中，置于37℃，5%CO2飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)。

1.3MTT法檢測rhIL-11對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響取對(duì)數(shù)生長期A549細(xì)胞，制成1.75×104/mL的細(xì)胞懸液，每孔3 500個(gè)接種于96孔板，次日加入不同濃度的rhIL-11，終濃度分別為10、20、50、100 μg/L，對(duì)照組正常培養(yǎng)，每組設(shè)6個(gè)平行孔，37℃培養(yǎng)24、48、72h。以MTT法檢測細(xì)胞增殖水平。

1.4劃痕實(shí)驗(yàn)檢測rhIL-11對(duì)A549細(xì)胞遷移能力的影響用Marker筆在6孔板背后標(biāo)記6條Marker線。取對(duì)數(shù)生長期A549細(xì)胞接種到6孔板中，每孔接約15×104個(gè)細(xì)胞，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24h后細(xì)胞鋪滿開始劃痕實(shí)驗(yàn)。用滅菌的200 μL黃色槍頭在每個(gè)孔中間劃一條痕，PBS洗2遍，去除劃下的細(xì)胞，用正置顯微鏡拍照。換不同濃度的rhIL-11（10、40、80 μg /L）無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，對(duì)照組用無血清培養(yǎng)基代替藥物，每組設(shè)3個(gè)平行。24h后顯微鏡拍照，對(duì)應(yīng)Marker線測量劃痕距離。用Photoshop中的直方圖測量間距大小，表示不同組細(xì)胞發(fā)生遷移的距離。將對(duì)照組遷移距離大小設(shè)為100%，實(shí)驗(yàn)組遷移比例為：（實(shí)驗(yàn)組遷移距離-對(duì)照組遷移距離）/對(duì)照組遷移距離×100%。數(shù)據(jù)分析后作圖。

1.5Transwell實(shí)驗(yàn)檢測rhIL-11對(duì)A549細(xì)胞侵襲能力的影響取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞。終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗1～2遍，再用無血清培養(yǎng)基重懸，徹底去除血清干擾，調(diào)整細(xì)胞密度1×105個(gè)。在孔徑為8 μm Transwell小室里加入制備好的細(xì)胞懸液，同時(shí)加入不同濃度的rhIL-11（10、40、80 μg /L）處理，小室內(nèi)液體總體積為200 μL。24孔板中加入500 μL含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基。將Transwell小室放入24孔板中。將帶有小室的24孔板置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后取出，固定，0.1%結(jié)晶紫染色，正置顯微鏡100倍鏡下拍照，數(shù)據(jù)分析后作圖。

1.6Western blot檢測MMP-2、MMP-9表達(dá)水平A549細(xì)胞用不同濃度的rhIL-11（0、10、40、80 μg /L）處理24h后，用PBS洗3次，收集細(xì)胞并抽提蛋白，12 000 r/min，4℃離心20min，取上清蛋白液，用BCA蛋白定量試劑盒定量。取25 μg蛋白加入5×SDS-PAGE上樣緩沖液，100℃煮沸10min，10% SDS-PAGE電泳分離，260mA轉(zhuǎn)膜90min，5%牛奶室溫封閉1h，TBST洗膜5min×6次，加入MMP-2（1∶500），MMP-9（1∶500）一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜5min×6次，加HPR標(biāo)記二抗（1∶5 000）室溫1h，TBST洗膜5min×6次。以GAPDH為內(nèi)參對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 18.0軟件完成統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析及重復(fù)測量資料的方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1rhIl-11對(duì)A549細(xì)胞增殖的作用不同濃度、不同時(shí)間的rhIL-11組處理后均對(duì)A549細(xì)胞增殖無明顯影響，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

Tab.1　Effects of different times and different concentrations of rhIL-11 on proliferation of A549 cells表1　不同濃度rhIL-11作用不同時(shí)間對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響?。╪=6，±s）

Tab.1　Effects of different times and different concentrations of rhIL-11 on proliferation of A549 cells表1　不同濃度rhIL-11作用不同時(shí)間對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響?。╪=6，±s）

F分組=1.151，F(xiàn)時(shí)間=3.243，F(xiàn)交互=2.469，均P>0.05

組別0 μg/L 10 μg/L 20 μg/L 50 μg/L 100 μg/L 24h 0.48±0.01 0.49±0.01 0.50±0.01 0.51±0.00 0.51±0.01 48h 0.65±0.01 0.64±0.01 0.63±0.02 0.69±0.01 0.71±0.00 72h 0.85±0.01 0.84±0.01 0.82±0.02 0.80±0.00 0.79±0.00

2.2rhIL-11對(duì)A549遷移及侵襲能力有促進(jìn)作用

2.2.1劃痕實(shí)驗(yàn)細(xì)胞劃痕后，用不同濃度0、10、40、80 μg/L rhIL-11處理A549細(xì)胞24h后，100倍倒置顯微鏡鏡下觀察細(xì)胞劃痕愈合情況，見圖1。不同濃度rhIL-11作用24h后A549細(xì)胞的遷移率明顯上升（P < 0.05），見表2。

a、b、c、d分別表示rhIL-11濃度為0、10、40、80 μg/L；上、下圖分別為不同濃度的rhIL-11作用0、24hFig.1　Effects of different concentrations of rhIL-11 onmigration of A549 cells（×100）圖1　不同濃度rhIL-11對(duì)A549細(xì)胞遷移能力的影響（×100）

Tab.2　Effects of different concentrations of rhIL-11 on invasion of A549 cells表2　不同濃度rhIL-11對(duì)A549細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響?。╪=6，±s）

Tab.2　Effects of different concentrations of rhIL-11 on invasion of A549 cells表2　不同濃度rhIL-11對(duì)A549細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響?。╪=6，±s）

＊＊P < 0.01；a與（1）組比較，b與（2）組比較，c與（3）組比較，P < 0.05；表3同

組別0 μg/L組（1）10 μg/L組（2）40 μg/L組（3）80 μg/L組（4）F細(xì)胞遷移率（%）19.94±0.44 24.83±0.54a35.91±0.61ab56.71±0.75abc60.453＊＊侵襲細(xì)胞數(shù)（個(gè)）117.75±15.71 164.39±13.14a192.83±17.44ab293.62±3.13abc236.961＊＊

2.2.2Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)A549細(xì)胞在Transwell小室內(nèi)經(jīng)不同濃度rhIL-11處理24h后，侵襲能力明顯增強(qiáng)，并呈現(xiàn)濃度依賴性（P<0.05），見表2、圖2。

Fig.2　Effects of different concentrations of rhIL-11 on invasion of A549 cells圖2　不同濃度rhIL-11對(duì)A549細(xì)胞侵襲能力的影響（結(jié)晶紫，×100）

2.3rhIL-11對(duì)侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響經(jīng)不同濃度rhIL-11作用24h后，A549細(xì)胞MMP-9和MMP-2表達(dá)均上調(diào)，且呈現(xiàn)濃度依賴性（P＜0.05），見表3、圖3。

3　討論

IL-11是細(xì)胞因子IL-6家族中的一員，與IL-6共用GP130信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體亞單位[2]，是骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌的一種多功能造血調(diào)控因子，對(duì)造血細(xì)胞尤其是巨核細(xì)胞具有重要的調(diào)控作用，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及小腸腺窩絨毛干細(xì)胞等非造血細(xì)胞亦具有明顯的生物活性，在骨髓造血調(diào)控中發(fā)揮重要作用。有研究證明，外源性IL-11可有效地促進(jìn)各種原因所致血小板減少癥的恢復(fù)[3-4]。然而，近期研究顯示，IL-11過表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)[5-7]。

Tab.3　Effects of different concentrations of rhIL-11 on expressions ofmMP-9 andmMP-2 of A549 cells表3　不同濃度rhIL-11對(duì)A549細(xì)胞MMP-9和MMP-2表達(dá)的影響?。╪=6,%,±s）

Tab.3　Effects of different concentrations of rhIL-11 on expressions ofmMP-9 andmMP-2 of A549 cells表3　不同濃度rhIL-11對(duì)A549細(xì)胞MMP-9和MMP-2表達(dá)的影響　（n=6,%,±s）

組別0 μg/L組（1）10 μg/L組（2）40 μg/L組（3）80 μg/L組（4）FmMP-9 24.12±0.00 38.54±0.00a43.71±0.01ab53.04±0.00abc55.471＊＊MMP-2 13.63±0.00 18.92±0.00a24.32±0.00ab28.92±0.00abc28.567＊＊

Fig.3　Effects of different concentrations of rhIL-11 on expressions ofmMP-9 andmMP-2 of A549 cells圖3　不同濃度rhIL-11對(duì)A549細(xì)胞MMP-9和MMP-2表達(dá)的影響

有研究者發(fā)現(xiàn)外源性IL-11對(duì)胃癌細(xì)胞并無明顯促增殖作用，但對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖能力可能有潛在的促進(jìn)作用[8]。本研究結(jié)果則發(fā)現(xiàn)rhIL-11對(duì)A549細(xì)胞的增殖能力無明顯影響。此結(jié)果與上述研究結(jié)果不符，是否與瘤種不同有關(guān)，或者與長時(shí)間、高濃度的rhIL-11作用有關(guān)，有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。本研究結(jié)果表明，外源性IL-11對(duì)A549細(xì)胞的遷移和侵襲能力有促進(jìn)作用，這一作用亦在分子水平上得以證實(shí)，在外源性IL-11的作用下，與腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)量增加，并呈現(xiàn)一定的濃度依賴效應(yīng)。MMP-2 和MMP-9是降解Ⅳ型膠原最主要的酶，Ⅳ型膠原酶對(duì)腫瘤細(xì)胞向外擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移極為重要。國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果證實(shí)，MMP-2和MMP-9與肺癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)[9-10]。腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制非常復(fù)雜，可能通過多條通路實(shí)現(xiàn)，很多與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)的通路的激活都涉及到MMP-2和MMP-9的異常表達(dá)[11-12]。另外，在很多研究中，抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)可明顯抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[13- 15]。本研究顯示rhIL-11對(duì)MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)有顯著的上調(diào)作用，提示外源性IL-11對(duì)肺癌A549細(xì)胞的侵襲和遷移能力有顯著的增強(qiáng)作用。

本研究結(jié)果顯示，外源性IL-11對(duì)A549細(xì)胞的遷移和侵襲能力有顯著的促進(jìn)作用。但臨床上使用rhIL-11是否促使腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移，有待于臨床隨機(jī)對(duì)照研究證實(shí)。

參考文獻(xiàn)

[1] Zhang Z, Zhang J,miao L, et al.Interleukin-11 promotes the prog?ress of gastric carcinoma via abnormally expressed versican[J].Int J Biol Sci,2012,8(3):383-393.doi: 10.7150/ijbs.3579.

[2] Johnstone CN, Chand A, Putoczki TL, et al.Emerging roles for IL-11 signaling in cancer development and progression: Focus on breast cancer[J].Cytokine Growth Factor Rev,2015, pii: S1359-6101(15)00063-5.doi: 10.1016/j.cytogfr.2015.07.015.

[3] Aribi A, Kantarjianh, Koller C, et al.The effect of interleukin 11 on thrombocytopenia associated with tyrosine kinase inhibitor therapy in patients with chronicmyeloid leukemia[J].Cancer, 2008 , 113(6):1338-1343.doi:10.1002/cncr.23718.

[4] SulimanmI, Qayum I, Saeed F.Randomized clinical trial ofhu?man interleukin- 11 in Dengue fever- associated thrombocytopenia [J].J Coll Physicians Surg Pak,2014, 24(3):164-168.doi:03.2014./JCPSP.164168.

[5] Gu D, Fan Q, Zhang X, et al.A role for transcription factor STAT3 signaling in oncogene smoothened-driven carcinogenesis[J].J Biol Chem,2012,287(45):38356-38366.doi:10.10741jbc.M112.377382.

[6]huang G, Yu L, Cooper LJ, et al.Geneticallymodified T cells target?ing interleukin-11 receptor α-chain killhuman osteosarcoma cells and induce the regression of established osteosarcoma lungmetasta?ses[J].Cancer Res, 2012, 72(1):271-281.doi:10.1158/0008-5472.CAN-11-2778.

[7] Pan D,Xu L, Liuh,et al.High expression of interleukin-11 is an in?dependent indicator of poor prognosis in clear-cell renal cell carci? noma[J].Cancer Sci,2015,106(5):592-597.doi:10.1111/cas.12638.

[8] Zhou C, Ji J, Cai Q, et al.MTA2 enhances colony formation and tu?mor growth of gastric cancer cells through IL-11[J].BMC Cancer, 2015,15:343.doi:10.1186/s12885-015-1366-y.

[9] YanghK, Jeong KC, Kim YK, et al.Role ofmatrixmetalloprotein?ase (MMP) 2 andmMP- 9 in soft tissue sarcoma[J].Clin Orthop Surg, 2014, 6(4):443-454.doi:10.455/cios.2014.6.4.443.

[10] Aparnam, Rao L, Kunhikatta V, et al.The role ofmMP- 2 andmMP- 9 as prognosticmarkers in the early stages of tongue squamous cell carcinoma[J].J Oral Patholmed, 2015, 44(5):345-352.doi:10.1111/job.12245.

[11]min KW, Kim DH, Do SI, et al.Expression patterns of stro?malmMP-2 and tumouralmMP-2 and -9 are significant prognos?tic factors in invasive ductal carcinoma of the breast[J].AP?MIS, 2014, 122(12):1196-1206.doi:10.1111/apm.12285.

[12] Lee KR, Lee JS, Kim YR, et al.Polysaccharide from Inonotus obliquus inhibitsmigration and invasion in B16-F10 cells by sup?pressingmMP-2 andmMP-9 via downregulation of NF-κB signal?ing pathway[J].Oncol Rep, 2014, 31(5):2447- 2453.doi:10.382/or.2014.3103.

[13] Ji BC,hsiao YP, Tsai CH, et al.Cantharidin impairs cellmigration and invasion of A375.S2humanmelanoma cells by suppress?ingmMP- 2 and - 9 through PI3K/NF-κB signaling pathways[J].Anticancer Res, 2015, 35(2):729-738.

[14] Shih, Wu Y, Wang Y, et al.Liquiritigenin potentiates the inhibito?ry effects of cisplatin on invasion andmetastasis via downregula?tionmMP-2/9 and PI3 K/AKT signaling pathway in B16F10mela?noma cells andmicemodel[J].Nutr Cancer,2015 ,67(5):761-770.doi:10.1080/01635581.2015.1037962.

[15] LeemM, Chen YY, Liu PY, et al.Pipoxolan inhibits CL1- 5 lung cancer cellsmigration and invasion through inhibition ofmMP-9 andmMP-2[J].Chem Biol Interact, 2015,236:19-30.doi: 10.1016/k.cbi.2015.04.012.

（2015-06-24收稿2015-09-17修回）

（本文編輯李國琪）

Effects of recombinanthuman interleukin 11(rhIL-11) on proliferation,migration and invasion of pulmonary adenocarcinoma A549 cells

XIAO Rong, KANGmafei△, LUOmeiqing, DONG Cuimei, LIU Xiuli
Department ofmedical Oncology, the Affiliatedhospital of Guilinmedical College, Guilin 541001, China
△Corresponding Author E-mail: kmfgl@163.com

Abstract:Objective To observe the effects of recombinanthuman interleukin 11(rhIL-11) on proliferation,migration and invasion of A549 cells, and themechanism thereof.Methods Final concentrations of 0, 10, 20, 50 and 100 μg/L rhIL-11 were added into pulmonary adenocarcinoma A549 cells.The cell proliferation was detected bymTT.The wound-healing, transwellmigration assay were used to validate the capability of themigration and invasion of A549 cells.Matrixmetallopro?teinases (MMP)-2 andmMP-9 protein expressions were revealed by Western blot assay.Results The proliferation of A549 cells was not significantly changed by rhIL-11.The cell capability tomigrate and invade was significantly increased 24h af?ter treatment with rhIL-11 (P < 0.05).The expression levels ofmMP-2 andmMP-9 were significantly un-regulated, and which were increased with the increased concentrations of rhIL-11 (P < 0.05).ConclusionrhIL-11 can promote themigra?tion and invasion of A549 cells, and the up-regulation ofmMP-2 andmMP-9 expressionmight be one of themechanisms.

Key words:interleukin-11; carcinoma, non-small-cell lung; cellmigration assays; neoplasm invasiveness;matrixme?talloproteinase 2;matrixmetalloproteinase 9; rhIL-11

通訊作者△E-mail:kmfgl@163.com

作者簡介：肖榮（1990），女，碩士研究生，主要從事腫瘤的基礎(chǔ)與臨床研究

基金項(xiàng)目：桂林市科技攻關(guān)項(xiàng)目（20150126-1-2）

中圖分類號(hào)：R734.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI:10.11958/51942

作者單位：桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科（郵編541001）