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        姜黃素通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制晶狀體上皮細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究*

        2016-03-13 09:03:04包秀麗劉婷婷張海濤張利民
        天津中醫(yī)藥 2016年12期
        關(guān)鍵詞:素組姜黃晶狀體

        包秀麗,劉婷婷,張海濤,張利民

        (內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院眼科,呼和浩特 010050)

        姜黃素通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制晶狀體上皮細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究*

        包秀麗,劉婷婷,張海濤,張利民

        (內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院眼科,呼和浩特 010050)

        [目的]探討姜黃素通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞(LECs)增殖的影響及其可能的作用機(jī)制,為晶狀體后囊膜混濁(PCO)的臨床治療提供新的靶點(diǎn)。[方法]人LECs系SRA 01/04細(xì)胞為研究對(duì)象,實(shí)驗(yàn)分為3組:Wnt3a組,姜黃素組和對(duì)照組。Wnt3a組采用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染技術(shù)將Wnt3a cDNA表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入人SRA 01/04細(xì)胞中,構(gòu)建PCO的細(xì)胞模型。姜黃素組在轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt3a cDNA表達(dá)載體48 h后加入20 μmol/L姜黃素,對(duì)照組轉(zhuǎn)染pcDNA3-HA表達(dá)載體。采用Western blot技術(shù)驗(yàn)證載體在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的表達(dá),CKK-8實(shí)驗(yàn)檢測姜黃素對(duì)SRA 01/04細(xì)胞增殖能力的影響,采用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測Wnt3a過表達(dá)后增生細(xì)胞核抗原(PCNA)蛋白表達(dá)的變化;Western blot法檢測Wnt3a過表達(dá)對(duì)Wnt/β-catenin下游信號(hào)分子cyclin D1和c-Myc蛋白表達(dá)的影響;應(yīng)用免疫熒光法檢測Wnt3a過表達(dá)后β-catenin表達(dá)的定位變化。[結(jié)果]Western blot檢測證實(shí),轉(zhuǎn)染pcDNA3-HA表達(dá)載體后,SRA 01/04細(xì)胞內(nèi)Wnt3a蛋白表達(dá)明顯升高。CKK-8檢測表明,姜黃素組SRA 01/04細(xì)胞的增殖率明顯低于Wnt3a組(t=2.782,P=0.049)。姜黃組SRA 01/04細(xì)胞PCNA蛋白表達(dá)陽性率為 23.6%±4.0%,明顯低于Wnt3a組的43.4%±5.4%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.951,P=0.018)。轉(zhuǎn)染后48 h,β-catenin蛋白密集分布于Wnt3a組細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中,而在對(duì)照組僅出現(xiàn)于細(xì)胞之中,姜黃素組β-catenin蛋白主要分布于細(xì)胞核中,少量分布于細(xì)胞質(zhì)中。Western blot檢測姜黃素組Wnt/β-catenin信號(hào)通路靶蛋白Cyclin D1和c-Myc蛋白表達(dá)明顯低于Wnt3a組。[結(jié)論]在SRA 01/04細(xì)胞中,姜黃素抑制Wnt3a過表達(dá)誘導(dǎo)的Wnt/β-catenin信號(hào)通路活化,下游靶蛋白Cyclin D1和c-Myc表達(dá)下調(diào),抑制人LECs的增生。

        姜黃素;Wnt3a;晶狀體上皮細(xì)胞;Wnt/β-catenin信號(hào)通路;細(xì)胞增殖;后囊膜混濁

        后囊膜混濁(PCO)是白內(nèi)障囊外摘除術(shù)后最常見的并發(fā)癥,大約有20%~40%的患者術(shù)后2~5 a會(huì)發(fā)生PCO。目前的研究認(rèn)為PCO的發(fā)生主要是由于手術(shù)后殘余的晶狀體上皮細(xì)胞(LECs)增殖、遷移、發(fā)生上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,與沉積的膠原一起形成了晶狀體囊袋內(nèi)的纖維斑塊[1]。姜黃素是姜黃的主要活性成分,近年來有研究發(fā)現(xiàn)姜黃素具有抑制腫瘤細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)移和抗炎作用。本實(shí)驗(yàn)在體外研究探討了姜黃素對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞系HLE B-3細(xì)胞增殖的影響及其作用的信號(hào)通路,為今后PCO的防治提供部分實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑 SRA 01/04細(xì)胞株(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫);姜黃素(美國Sigma公司);右旋-纈氨酸基礎(chǔ)培養(yǎng)液(DMEM)培養(yǎng)基、胎牛血清購自(美國 Gibco公司);CCK-8試劑盒購自日本DOJINDO公司;甲基四唑藍(lán)(MTT,美國 Sigma公司);脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司);小鼠抗人單克隆PCNA抗體、羊抗小鼠二抗(北京中杉公司);BCA蛋白定量試劑盒(Pierce公司);小鼠抗人β-catenin單克隆抗體、兔抗人cyclin D1單克隆抗體、兔抗人c-myc單克隆抗體、羊抗兔/小鼠二抗、小鼠抗人β-actin(Santa cruz公司)化學(xué)發(fā)光ECL法(Millipore公司);羊抗小鼠IgG Alexa Flour488(Invitrogen公司)。

        1.2 儀器及試劑 VD-650-U型超凈工作臺(tái)(上海楚度儀器設(shè)備有限公司);MCO-175型CO2培養(yǎng)箱(日本三洋集團(tuán));UV-1800 PC型紫外-可見分光光度計(jì)(廣州科曉科學(xué)儀器有限公司);BS-300型全自動(dòng)生化分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司);Model-680型酶標(biāo)儀(美國BIO-RAD公司);FACS Aria型流式細(xì)胞儀(美國BD公司);DYY-11型多用電泳儀、JY-SCZ2電泳槽(北京六一儀器廠);倒置顯微鏡(日本Olympus IMT-413);共聚焦顯微鏡(德國Leica)。

        1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及實(shí)驗(yàn)分組 將SRA 01/04細(xì)胞株放人含10%胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液中,置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為3組:Wnt3a組,姜黃素組,對(duì)照組。轉(zhuǎn)染前l(fā) d,將對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞以每孔4×105的濃度接種于6孔板內(nèi),加入不含抗生素的DMEM(含15%胎牛血清)2 mL進(jìn)行培養(yǎng)。Wnt3a組將4 μg構(gòu)建的Wnt3a cDNA表達(dá)載體[1]和10 μL脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000分別用250 μL DMEM稀釋,輕柔混勻,室溫下孵育5 min,再將兩者混合孵育20 min,加入6孔板的培養(yǎng)液中。姜黃素組在細(xì)胞轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt3a cDNA表達(dá)載體后48 h加入20 μmol/L姜黃素,為保證培養(yǎng)液中姜黃素的濃度,每24 h加入10 μmol/L姜黃素,加入姜黃素48 h后收集細(xì)胞做進(jìn)一步分析測定,將pcDNA3-HA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染作為對(duì)照組。

        1.4 CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞增殖能力用細(xì)胞增殖-毒性檢測試劑盒(CCK8,購自東仁化學(xué)有限公司)檢測。將Wnt3a組,姜黃素組和對(duì)照組細(xì)胞胰酶消化后接種至5個(gè)96孔板中,接種密度為2 000個(gè)/孔,每種細(xì)胞每板種18個(gè)復(fù)孔,分別培養(yǎng)不同時(shí)間(1、2、3、4、5 d)后,每孔加5 g/L的CCK8溶液10 μL,37℃孵育3 h后,酶標(biāo)儀檢測450 nm處的OD值,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

        1.5 細(xì)胞免疫化學(xué) 將pcDNA3-HA/SRA 01/04及Wnt3a/SRA 01/04細(xì)胞以5×104/mL提前鋪于含有蓋玻片的12孔盤中,4%多聚甲醛(PFA)固定10 min,磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗,加入小鼠抗人單克隆PCNA抗體4℃孵育過夜,PBS沖洗,用羊抗小鼠二抗室溫孵育30 min,二氨基聯(lián)苯胺法(DAB)顯色,蘇木素復(fù)染,脫水,封片。于400×光學(xué)顯微鏡視野下計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)比例,每片計(jì)數(shù)10個(gè)視野,以陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)代表蛋白表達(dá)陽性率。

        1.6 Western blotting 在細(xì)胞中加入1×SDS細(xì)胞裂解液,獲取細(xì)胞蛋白,BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度后,取35 μg樣品進(jìn)行SDS-PAGE,電泳完畢后,應(yīng)用電轉(zhuǎn)儀將樣品轉(zhuǎn)移至PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉1 h,分別加入一抗:小鼠抗人Wnt3a單克隆抗體(1∶1 000)、兔抗人cyclin D1單克隆抗體(1∶1 000)和兔抗人c-myc單克隆抗體(1∶1 000)4℃孵育過夜,洗膜后加入相應(yīng)羊抗兔/小鼠二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h,洗膜后化學(xué)發(fā)光ECL法顯影,暗室曝光。以小鼠抗人β-actin(1∶5 000)作為內(nèi)參陽性對(duì)照。

        1.7 免疫熒光 將 pcDNA3-HA/SRA 01/04及Wnt3a/SRA 01/04細(xì)胞以5×104/mL提前鋪于含有蓋玻片的12孔盤中,4%多聚甲醛(PFA)固定10 min,PBS沖洗,50 mmol/L氯化銨焠滅游離PFA10 min;PBS沖洗,0.5%sponin室溫處理10 min;PBS沖洗,3%BSA封閉室溫1 h;PBS沖洗,加入小鼠抗人βcatenin單克隆抗體(1∶50)4℃孵育過夜,PBS洗3次,加入羊抗小鼠IgG Alexa Flour488(1∶200)避光室溫1 h;PBS洗3次,加入4,6-二乙?;?2-苯基吲哚酸鹽(DAPI)染核,避光室溫10 min;PBS洗2次,將蓋玻片移至載玻片上,用抗熒光衰減封片劑mowoil封片,共聚焦顯微鏡觀察、拍照。

        1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 結(jié)果應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理系統(tǒng)進(jìn)行定理。本研究測量指標(biāo)的數(shù)據(jù)資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示,組間的差異比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn),采用雙尾檢測法,以P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)使SRA 01/04細(xì)胞中Wnt3a過表達(dá) 收集經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染48 h后的SRA 01/04細(xì)胞蛋白,Western blot檢測證實(shí),與轉(zhuǎn)染pcDNA3-HA的SRA 01/04細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt3a cDNA表達(dá)載體的SRA 01/04細(xì)胞內(nèi)Wnt3a蛋白表達(dá)明顯升高,提示在SRA 01/04細(xì)胞中外源性Wnt3a基因得到了表達(dá)。見圖1。

        2.2 姜黃素抑制SRA 01/04細(xì)胞增殖 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示,Wnt3a組OD值明顯高于對(duì)照組及姜黃素組(F=7.219,P=0.016),證明SRA 01/04細(xì)胞轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt3a cDNA表達(dá)載體后細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng),組間兩兩比較姜黃素組OD值明顯低于Wnt3a組(t=2.782,P=0.049),表明姜黃素抑制SRA 01/04細(xì)胞增殖。見圖2。

        2.3 姜黃素抑制SRA 01/04細(xì)胞核內(nèi)PCNA的表達(dá) 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測結(jié)果顯示PCNA表達(dá)于SRA 01/04細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi),呈棕黃色,PCNA在姜黃素組和對(duì)照組的SRA 01/04細(xì)胞中表達(dá)陽性率較Wnt3a組低(23.6%±4.0%,6.0%±1.6%vs 43.4%± 5.4%,F(xiàn)=22.15,P=0.000 1),而在Wnt3a組中SRA 01/04細(xì)胞中表達(dá)陽性率較姜黃素組明顯增加(43.4%±5.4%vs 23.6%±4.0%,t=2.951,P=0.018)。提示姜黃素能夠抑制SRA 01/04細(xì)胞增殖。見圖3。

        圖1 pcDNA3-HA/SRA 01/04及Wnt3a/SRA 01/04細(xì)胞中Wnt3a蛋白的表達(dá)Fig.1 Expression of Wnt3a protein in pcDNA3-HA/SRA 01/04 and Wnt3a/SRA 01/04 cells

        圖1pcDNA3-HA/SRA 01/04及Wnt3a/SRA 01/04細(xì)胞中Wnt3a蛋白的表達(dá)

        Fig.1 Expression of Wnt3a protein in pcDNA3-HA/SRA 01/04 and Wnt3a/SRA 01/04 cells

        圖2 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞在第1,2,3,4,5天的細(xì)胞增殖能力Fig.2 CCK8 assay was conducted to detect the proliferation ability of cells in 1,2,3,4,and 5 d,respectively

        圖2 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞在第1,2,3,4,5天的細(xì)胞增殖能力

        Fig.2 CCK8 assay was conducted to detect the proliferation ability of cells in 1,2,3,4,and 5 d,respectively

        圖3 PCNA在各組細(xì)胞中的表達(dá)Fig.3 Expression of PCNA in each group

        2.4 姜黃素抑制β-catenin由胞漿轉(zhuǎn)入胞核 免疫熒光檢測卻發(fā)現(xiàn)β-catenin蛋白在Wnt3a組中SRA 01/04細(xì)胞胞漿和細(xì)胞核內(nèi)大量積聚,而在對(duì)照細(xì)胞中卻只分布在胞漿中,提示W(wǎng)nt3a過表達(dá)引起細(xì)胞內(nèi)的核轉(zhuǎn)錄激動(dòng)因子β-catenin積聚并轉(zhuǎn)入細(xì)胞核中,Wnt/β-catenin信號(hào)通路活化。而姜黃素組中β-catenin蛋白大部分分布于胞漿中,細(xì)胞核內(nèi)只有少量β-catenin蛋白,說明姜黃素能夠抑制Wnt/βcatenin信號(hào)通路的核轉(zhuǎn)移。見圖4。

        圖4 β-catenin在各組細(xì)胞中的表達(dá)Fig.4 Expression of β-catenin in each group

        2.5 姜黃素下調(diào)Wnt/β-catenin信號(hào)通路靶蛋白Cyclin D1和c-Myc表達(dá) Western blotting檢測結(jié)果顯示,Wnt3a組的SRA 01/04細(xì)胞中Cyclin D1和c-Myc蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯增加,而姜黃素組細(xì)胞中Cyclin D1和c-Myc蛋白表達(dá)明顯減弱,表明Wnt/β-catenin信號(hào)通路活化后,可引起Cyclin D1和c-Myc的表達(dá)增加,而姜黃素能夠抑制Wnt/βcatenin信號(hào)通路的核內(nèi)靶基因Cyclin D1和c-Myc的表達(dá)。見圖5。

        3 討論

        姜黃素是姜黃中提取的一種植物多酚,也是姜黃藥理作用的主要活性成分。中醫(yī)認(rèn)為姜黃能行氣、散風(fēng)活血、通經(jīng)止痛,近年的研究證明姜黃具有防癌抗癌、抗纖維化、抗炎、抗氧化、清除自由基以及促進(jìn)凋亡等作用[2-3]。已有研究發(fā)現(xiàn),姜黃素能有效抑制EGF誘導(dǎo)的LEC增殖[4],而姜黃素-羥甲基-β-環(huán)糊精能夠抑制兔眼PCO的發(fā)生,但其發(fā)生機(jī)制尚不清楚[5]。研究發(fā)現(xiàn),姜黃素能夠通過調(diào)節(jié)P53、PTEN、Caspase-3、Hedgehog及NF-κB等信號(hào)通路活性,發(fā)揮腫瘤抑制作用細(xì)胞及誘導(dǎo)凋亡[6-7],還可能通過下調(diào)Wnt/β-catenin通路抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖[8]。

        圖5 c-Myc和CyclingD1在各組細(xì)胞中的表達(dá)Fig.5 Expression of c-Myc and CyclingD1 in each group

        筆者前期的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號(hào)通路與晶狀體上皮細(xì)胞的增殖密切相關(guān),β-catenin是經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中關(guān)鍵的信號(hào)蛋白,Wnt3a誘導(dǎo)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路活化,促進(jìn)β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積聚并轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核中,激活核內(nèi)靶基因的轉(zhuǎn)錄[1]。其中,cyclin D1和c-Myc基因是Wnt/β-catenin信號(hào)通路重要的核內(nèi)靶基因,也是細(xì)胞增殖的重要調(diào)控因子,其上調(diào)能夠促進(jìn)細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)換,促進(jìn)處于休眠狀態(tài)的細(xì)胞進(jìn)入分裂期,從而影響細(xì)胞周期,從而促進(jìn)晶狀體上皮細(xì)胞增殖[9]。姜黃素還可以通過下調(diào)的β-catenin和c-Myc的表達(dá)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖[8]。通過Western blot和免疫熒光技術(shù)檢測β-catenin蛋白的表達(dá),觀察到在轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt3a cDNA后的SRA01/04細(xì)胞內(nèi)存在β-catenin的核內(nèi)積聚,證明轉(zhuǎn)染后產(chǎn)生Wnt3a目的蛋白,并分泌到細(xì)胞外,與相關(guān)的膜受體結(jié)合并使細(xì)胞內(nèi)的βcatenin轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi),活化Wnt/β-catenin信號(hào)通路,而姜黃素能夠抑制Wnt3a誘導(dǎo)的β-catenin核轉(zhuǎn)染,從而抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活化。

        CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示姜黃素抑制SRA 01/04細(xì)胞的增殖。Kim TD等[10]發(fā)現(xiàn)姜黃素可以通過減弱Wnt信號(hào)通路及細(xì)胞間黏附,使HCT-116細(xì)胞停滯于G2/M期并使其凋亡。應(yīng)用cDNA芯片的方法分析調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)的基因表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)姜黃素誘導(dǎo)細(xì)胞阻滯于G0/G1和/或G2/M期,從而抑制細(xì)胞增殖[11-12]。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測還發(fā)現(xiàn),Wnt/βcatenin信號(hào)通路活化后SRA 01/04細(xì)胞核內(nèi)PCNA蛋白呈現(xiàn)高表達(dá),PCNA是真核細(xì)胞DNA合成時(shí)所必需的一種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)酸性核蛋白,其在細(xì)胞核中陽性表達(dá)的程度與細(xì)胞增殖活性密切相關(guān)[13]。

        本研究發(fā)現(xiàn)姜黃素通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路下調(diào)SRA 01/04細(xì)胞中cyclin D1和c-Myc蛋白表達(dá)。一些研究已表明姜黃素能夠通過下調(diào)cyclin D1和c-Myc的表達(dá),降低分裂期細(xì)胞的比例,從而抑制細(xì)胞增殖[12,14]。在對(duì)姜黃素抑制腫瘤和心血管保護(hù)作用機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠調(diào)節(jié)某些基因表達(dá)和相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)通路,基因芯片技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)c-Myc是姜黃素治療的重要靶基因。Myc是轉(zhuǎn)錄因子螺旋-環(huán)-亮氨酸拉鏈家族的成員之一,能夠形成MYC-MAX復(fù)合物,Myc是一種腫瘤基因蛋白產(chǎn)物,參與腫瘤細(xì)胞增殖、分化和凋亡[15]。10 nmol的姜黃素可以將Myc mRNA的表達(dá)下調(diào)60%,還有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)姜黃素治療后僅有21.95%的細(xì)胞表達(dá)Myc基因[15-16],而體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證明姜黃素通過下調(diào)c-Myc基因表達(dá)抑制細(xì)胞增殖[17]。姜黃素可以下調(diào)cyclin D1和p21抑制從而非小細(xì)胞性肺癌的腫瘤干細(xì)胞的增殖,還可以降低髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞的β-catenin和其靶基因cyclin D1的表達(dá),使細(xì)胞周期停滯于G2/M期,抑制腫瘤的增殖[18]。這一結(jié)果與其他體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似[19]。

        本研究結(jié)果表明 Wnt3a通過抑制 Wnt/βcatenin信號(hào)通路下調(diào)cyclin D1和c-Myc的表達(dá),進(jìn)而發(fā)揮抑制人晶狀體上皮細(xì)胞增殖作用。由于PCO的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多階段逐步演變的過程,手術(shù)后殘余的晶狀體上皮細(xì)胞的異常增殖是PCO早期階段重要的病理變化之一,提示姜黃素可作為PCO基因治療或預(yù)防的新靶點(diǎn)。

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        Curcumin regulation of human lens epithelail cell proliferation through Wnt/β-catenin signaling pathway

        BAO Xiu-li,LIU Ting-ting,ZHANG Hai-tao,ZHANG Li-min
        (Department of Ophthalmology,The Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University,Hohhot 010050,China)

        [Objective]To investigate the effects of curcumin on proliferation of human lens epithelial cells(LECs)and its mechanism and to provide a new gene target in the prevention and treatment of PCO.[Methods]The research objects were the human LECs SRA 01/ 04.The experiment was divided into three groups:Wnt3a group,curcumin group and control group.In Wnt3a group,human Wnt3a cDNA expressing vector targeted human LECs was constructed to PCO model.In curcumin group,curcumin of 20 μmol/L was added after 48 hs of transfection.pcDNA3-HA expression vector was used as the control group.The expression of Wnt3a was identified by Western blot assay after transfected.The growth and proliferation of SRA 01/04 cells were detected by CCK-8 test.The expression and localization of proliferating cell nuclear antigen (PCNA)were analyzed by immunocytochemistry for the exploration of the mechanism of curcumin to proliferation of LECs.The expressions of cyclin D1and c-Myc in the cells were detected by Western blot assay.β-Catenin expression was localized using immunofluorescence assay.[Results]The expression of Wnt3a was verified in the Wnt3a transfected group compared with the control group.CCK-8 test indicated that the cell proliferating rate was significantly difference between the curcumin group and Wnt3a group(t=2.782,P=0.049).The positive expression rate of PCNA protein in SRA 01/04 was 23.6%±4.0%in the curcumin group and 43.4%±5.4%in the Wnt3a group with a significant difference between them (t=2.951,P=0.018).After 48 hours of treatment with curcumin,the immunofluorescence was stronger in cell nucleus,and the expressions of cyclin D1 and c-Myc proteins were elevated in SRA 01/04 cells in wnt3a group,but he immunofluorescence was stronger in cytoplasm,and the expressions of cyclin D1 and c-Myc proteins were less in SRA 01/04 cells in curcumin group and controls.[Conclusion]Curcumin depressed the Wnt/β-catenin signaling pathway and downregulates the expression of a subset of target genes,including cyclin D1 and c-Myc,which plays an important role in inhibiting the proliferation of human LECs.

        curcumin;Wnt3a;lens epithelial cell;Wnt/β-catenin signaling pathway;cell proliferation;posterior capsular opacification

        R285.5

        A

        1672-1519(2016)12-0745-05

        2016-08-26)

        (本文編輯:馬 英,于春泉)

        10.11656/j.issn.1672-1519.2016.12.11

        國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81360145)。

        包秀麗(1975-),女,醫(yī)學(xué)博士,主任醫(yī)師,主要從事白內(nèi)障的臨床和基礎(chǔ)研究。

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