馬蕊，古能平，陽瓊芳，林勇，劉仲華*

（1.廣西職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530226；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙 410128）

黃金茶提取物對(duì)中波紫外線損傷HaCaT細(xì)胞的保護(hù)作用研究

馬蕊1，古能平1，陽瓊芳1，林勇2，劉仲華2*

（1.廣西職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530226；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙 410128）

為了考察黃金茶提取物防治中波紫外線（UVB）對(duì)人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞損傷作用，采用不同濃度的黃金茶提取物對(duì)HaCaT細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理6 h，采用60 m J·cm2的劑量照射細(xì)胞，以MTT法檢測(cè)細(xì)胞生存率，吸取細(xì)胞上清液檢測(cè)谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶（SOD）和乳酸脫氫酶（LDH）活性以及丙二醛（MDA）含量變化，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化。結(jié)果表明，UVB輻射對(duì)HaCaT細(xì)胞造成嚴(yán)重?fù)p傷，黃金茶提取物可提高UVB照射后HaCaT細(xì)胞的存活率，提高GSH-Px、SOD活性，降低LDH活性和MDA含量，同時(shí)黃金茶提取物能夠降低UVB所引起的細(xì)胞凋亡率升高（P<0.01），還可以減少UVB誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞損傷或凋亡，具有一定的光保護(hù)功能，其作用機(jī)制可能與清除氧自由基和增強(qiáng)抗氧化能力有關(guān)。

黃金茶提取物；中波紫外線；HaCaT細(xì)胞；氧化損傷；凋亡

皮膚光老化現(xiàn)象的產(chǎn)生是由于經(jīng)受長期過度的紫外線輻射，從而刺激皮膚中色基或光敏物質(zhì)增加，引發(fā)自由基大量產(chǎn)生，破壞自身的抗氧化體系，細(xì)胞膜損傷，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物堆積，加速皮膚衰老形成的[1]。甚至自由基的過度產(chǎn)生還可能誘導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)化為嘧啶二聚物，出現(xiàn)DNA鏈斷裂或堿基氧化，誘導(dǎo)細(xì)胞損傷或凋亡，發(fā)生免疫受阻、皮膚癌變等疾病[2-3]。中波紫外線（UVB）照射是導(dǎo)致人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡，造成皮膚癌發(fā)生的主要因素[4]。使用抗氧化劑預(yù)防和減輕UVB照射形成的光損傷已經(jīng)成為當(dāng)今研究熱點(diǎn)。研究證明，茶葉中表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）具有抑制中波紫外線誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞氧化損傷的效果[4]，而黃金茶及黃金茶提取物中含有大量的茶多酚類物質(zhì)，具有抵抗紫外線輻射的作用。本試驗(yàn)研究采用UVB照射建立人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT）體外光損傷模型，考察黃金茶提取物對(duì)紫外線誘導(dǎo)皮膚光老化的防治作用。

1 材料、儀器和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT（由武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心培育）；黃金茶提取物（使用湖南省保靖縣黃金茶）；MEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶和胎牛血清（美國Gibco公司）；PBS粉劑、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）粉和二甲基亞砜（DMSO）（美國Sigma公司）；谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒 （南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

CO2培養(yǎng)箱（美國Nuaire）；倒置顯微鏡（德國Leica）；紫外交聯(lián)儀（英國UVP）；紫外分光光度計(jì)（日本Shimadzu公司）；多功能酶標(biāo)儀（Thermo公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)、模型建立及給藥分組

細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞光損傷模型建立參照林勇[4]等、馬蕊[5-6]等和劉碩[7]等的報(bào)道。給藥劑量如下：正常組、模型組（HaCaT細(xì)胞給予MEM完全培養(yǎng)基培育6 h）；黃金茶給藥組（分別給予含黃金茶提取物的MEM完全培養(yǎng)基培育6 h，藥物濃度分別為

2.5 μg/mL、5.0μg/mL、10μg/mL）。

1.3.2 檢測(cè)方法

MTT法測(cè)定 HaCaT細(xì)胞增殖活性參照文獻(xiàn)[4-7]中的方法進(jìn)行?？寡趸笜?biāo)（GSH-Px、SOD、MDA和LDH含量）以及細(xì)胞凋亡率等測(cè)定方法按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

以SPSS20.0 for windows統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 黃金茶提取物對(duì)UVB照射HaCaT細(xì)胞存活情況的影響

如表1所示，模型組與正常組相比，其細(xì)胞活性較低，具有顯著性差異（P＜0.01）。加入含濃度為2.5~10μg/mL黃金茶提取物的培養(yǎng)基孵育6 h再接受UVB輻射（采用60 mJ·cm2的劑量），均具有提高細(xì)胞存活率的作用，加入濃度為10μg/mL效果較明顯，與模型組有顯著差異（P＜0.01）。

表1 黃金茶提取物對(duì)UVB照射HaCaT細(xì)胞存活情況的影響Table 1 EffectofHuangjin tea on survivalability ofUVB irradiated HaCaT cells

2.2 黃金茶提取物對(duì)UVB輻射 HaCaT細(xì)胞GSH-Px、SOD和MDA含量的影響

抗氧化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果顯示（見表2），經(jīng)UVB照射，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量較正常組顯著升高，而GSH-Px和SOD的活力顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），說明破壞了HaCaT細(xì)胞自身的抗氧化能力。而與模型組相比，經(jīng)6 h黃金茶提取物預(yù)孵育的給藥組其GSH-Px和SOD活力均有提高，而MDA含量下降，呈現(xiàn)出一定的劑量關(guān)系，達(dá)到極顯著水平（P<0.01）。

表2 黃金茶提取物對(duì)UVB照射HaCaT細(xì)胞GSH-Px、SOD和MDA含量的影響Table 2 EffectofHuangjin tea on GSH-Px、SOD and MDA contentofUVB irradiated HaCaT cells

2.3 黃金茶提取物對(duì) UVB輻射 HaCaT細(xì)胞LDH活性的影響

與正常組相比，模型組細(xì)胞培養(yǎng)基中LDH活性明顯升高，二者具有顯著性差異（P<0.01）。黃金茶給藥組與模型組相比，細(xì)胞培養(yǎng)基中LDH活性顯著降低（見表3）。

表3 黃金茶對(duì)UVB照射HaCaT細(xì)胞LDH的影響Table 3 EffectofHuangjin tea on LDH ability ofUVB irradiated HaCaT cells

2.4 黃金茶提取物對(duì)UVB輻射HaCaT細(xì)胞凋亡情況的影響

人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞 （HaCaT）受輻射處理后經(jīng)流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)發(fā)現(xiàn) （見圖1），正常組的正常細(xì)胞占91.42% （見圖1—A），模型組占7 4.03%，黃金茶提取物預(yù)處理的給藥組占80.38%。由此可見，與正常組相比，經(jīng)UVB輻射的模型組HaCaT細(xì)胞存活率下降19.02%，而經(jīng)過10μg/mL黃金茶提取物孵育的HaCaT細(xì)胞存活率下降12.08%，使細(xì)胞存活率提高了6.94%，與表1結(jié)果相符，說明黃金茶可以有效地抵抗紫外輻射損傷。

3 討論

長期紫外線輻射后，機(jī)體會(huì)出現(xiàn)氧化和抗氧化能力失衡，產(chǎn)生對(duì)自身有害的氧自由基，程度不斷加深，皮膚抗氧化系統(tǒng)瓦解[8]，破壞細(xì)胞膜的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，通透性變大，并導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，干擾機(jī)體正常的代謝活動(dòng)，并可能誘發(fā)突變、阻滯細(xì)胞周期活動(dòng)、引起細(xì)胞凋亡、誘發(fā)皮膚癌產(chǎn)生。而機(jī)體本身存在由GSH-Px和SOD等構(gòu)成的抗氧化酶系統(tǒng)，減少氧自由基的產(chǎn)生，防御氧化損傷。但當(dāng)外界不良刺激大量產(chǎn)生，誘發(fā)氧自由基過度產(chǎn)生時(shí)，抗氧化物酶就會(huì)失去活性，導(dǎo)致氧化產(chǎn)物MDA增加，細(xì)胞膜被破壞，出現(xiàn)細(xì)胞損傷或凋亡[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃金茶提取物可以提升GSH-Px、SOD活力，延緩并清除氧自由基的產(chǎn)生，改善脂質(zhì)過氧化損傷程度，降低LDH的活性，維持了細(xì)胞膜的構(gòu)造和功能的完整性。因此，黃金茶提取物可以抑制UVB輻射引起的細(xì)胞氧化損傷和凋亡，有益于人皮膚光老化的保護(hù)。

圖1 黃金茶對(duì)UVB輻射HaCaT細(xì)胞凋亡情況的影響Fig.1 Effect of Huangjin tea on the apoptosis of UVB irradiated HaCaT cells

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Photo-Protection of Huangjin Tea Extracts on HaCaT Cell From Ultraviolet B-Induced Damage

MA Rui1，GU Neng-ping1，YANGQiong-fang1，LIN Yong2，LIU Zhong-hua2*

(1.Guangxi Vocational&Technical College,Nanning 530226,China;
2.Key Lab of Tea Science of Ministry of Education,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China)

In order to investigate the photo-protective effect of Huangjin tea extracts on HaCaT cells damaged from ultraviolet B radiation,sub-confluent HaCaT cellswere incubated for six hourswith different doses of Huangjin tea extracts,and then irradiated with 60 mJ·cm2doses of UVB irradiation.The cell viability was detected by MTT method.The activity of superoxide dismutase (SOD),glutathione peroxidase (GSH-Px)and lactate dehydrogenase (LDH),and the level ofmalondialdehyde(MDA)of supernatantwere detected with colorimetricmethods.Annexin V/ PI double staining was performed to evaluate the change of apoptosis using flow cytometry.Results show the cell viability was inverse correlating with the irradiated dosage.Huangjin tea extracts could enhance the cell viability, SOD and GSH-Px activity of supernatant under UVB irradiation,decrease the activity of LDH and the content of MDA in dose-dependentmanner.Compared with UVB irradiatedmodel group,the apoptosis rate of pretreated HaCaT cell was decreased （P<0.01）.Conclusion Huangjin tea extracts could relieve the oxidation cell damaged and apoptosis from UVB irradiation to HaCaT cells.Huangjin tea extracts had the function of photo-protection by clearing the oxyradical and raising the oxidase activity.

Huangjin tea extracts;Ultraviolet B;HaCaT cell;Oxidative damage;Apoptosis

S571.1；R329.2+5

A

2095-0306（2016）05-0031-04

中國茶葉加工 2016（5）:31-34

2016-07-04

馬蕊（1987-），女，黑龍江黑河人，講師，主要研究方向?yàn)椴枞~加工及植物功能成分化學(xué)。

*通訊作者：larkin-liu@163.com