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牛妊娠檢測(cè)的兩種實(shí)驗(yàn)室診斷法

田成武

(黑龍江省雞東縣東海鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站 158212)

本文介紹母牛妊娠檢查的兩種實(shí)驗(yàn)室診斷法，即血漿及乳汁孕酮濃度檢測(cè)法和乳汁硫酸雌酮檢測(cè)法。

1血漿及乳汁孕酮濃度的測(cè)定

此為一種通過檢測(cè)牛血漿孕酮濃度進(jìn)行妊娠診斷的方法。由于妊娠后黃體會(huì)持續(xù)存在，因此在前一次發(fā)情后約21 d采集血樣，孕酮應(yīng)該維持高水平；如果沒有妊娠而已接近或正在發(fā)情，則此時(shí)孕酮水平很低。這種方法是一種十分有效可信的實(shí)驗(yàn)室妊娠診斷方法，但也有其缺點(diǎn)，就是需要采集牛血樣。

研究表明，孕酮可穿過乳腺而出現(xiàn)于乳汁。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，乳汁孕酮濃度會(huì)隨血液或血漿孕酮濃度而變化，而且孕酮易溶于乳脂，因此乳汁單位容積中孕酮濃度比血液或血漿中更高。國外學(xué)者曾介紹了采用這種技術(shù)進(jìn)行診斷妊娠的方法，此后許多國家開展了大量類似的工作。采用這種方法時(shí)，可由飼養(yǎng)員采集約20 mL乳汁于玻璃瓶或塑料瓶中，通常在下午擠奶時(shí)采樣，因?yàn)榇藭r(shí)乳汁脂肪含量更高。采集乳樣后加入重鉻酸鉀或氯化汞作為保護(hù)劑，如果樣品沒有暴露在高溫或過度紫外線光照中，則孕酮活性幾乎沒有喪失。

最初采用放射免疫分析技術(shù)測(cè)定牛奶孕酮濃度，雖然這種方法檢測(cè)十分有效，但需要使用放射性同位素及專門設(shè)備來測(cè)定放射性，因此只能在專門的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，而且其最大的缺點(diǎn)是獲得結(jié)果需要數(shù)天的時(shí)間。目前已建立了許多檢測(cè)法并用于牧場(chǎng)奶牛妊娠的檢查，可在采樣后1h內(nèi)獲得結(jié)果。所用試劑和設(shè)備以試劑盒的形式提供。此外還建立了一些半定量或全定量檢測(cè)法，但只是用于獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室，需要一些設(shè)備和專業(yè)知識(shí)。這兩種檢測(cè)都是以酶聯(lián)免疫技術(shù)(ELISA)為基礎(chǔ)的。

基于實(shí)驗(yàn)室的定量檢測(cè)根據(jù)孕酮檢測(cè)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。一般建議每份樣品進(jìn)行2次分析，至少在操作者熟練之前應(yīng)該如此。在牧場(chǎng)采用這些方法存在一些問題，這些問題概述如下：(1)不熟悉實(shí)驗(yàn)室操作過程的人員經(jīng)常不能很好理解和操作；(2)即使簡(jiǎn)單設(shè)備也需要有相當(dāng)熟練的操作；(3)需嚴(yán)格遵守操作說明，特別是孵育時(shí)間和試劑量；(4)試劑盒應(yīng)該保存在4℃冰箱中，在使用前預(yù)熱到室溫，但不能加熱；(5)有些人難以識(shí)別顏色差異；(6)奶樣在分析前應(yīng)保存在2～8℃，必須使用防腐劑。

采集乳樣的最佳時(shí)間是配種或人工授精后24 d，雖然這一時(shí)間間隔能防止在比平均發(fā)情間隔長(zhǎng)的牛造成假陽性結(jié)果，但比平均發(fā)情間隔短的牛會(huì)造成假陽性結(jié)果。采用這種方法進(jìn)行妊娠診斷時(shí)其準(zhǔn)確率在80%～88%，診斷未孕的準(zhǔn)確率幾乎為100%。據(jù)報(bào)道，現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)中在輸精當(dāng)天和其后第21天采取乳樣，放射免疫分析和酶免疫分析的靈敏度分別為86%和93%，而特異性只有48%(放射免疫分析)和39%(酶免疫分析)。

出現(xiàn)假陰性結(jié)果的原因分析：(1)在牧場(chǎng)或?qū)嶒?yàn)室識(shí)別動(dòng)物失誤。(2)乳樣貯存中出現(xiàn)過熱或紫外線照射。(3)黃體產(chǎn)生的孕酮少。(4)乳汁混合不充分，樣品中乳脂含量低。

出現(xiàn)假陽性結(jié)果的原因：(1)發(fā)情間隔時(shí)間比平均發(fā)情間隔短，如18 d，在配種或人工授精后24 d采樣時(shí)如果未孕，則牛已進(jìn)入下一周期的黃體期早期。(2)采集乳樣后發(fā)生了胚胎死亡。(3)能產(chǎn)生孕酮的黃體囊腫。(4)輸精時(shí)間錯(cuò)誤。已有研究表明(Hoffmann等，1976)，高達(dá)15%的牛是在非發(fā)情期進(jìn)行了人工授精，如果在此后的24 d采集乳樣，并且未觀察到發(fā)情，采樣時(shí)牛則處在具有黃體功能的間情期，此時(shí)乳中孕酮濃度高。(5)黃體壽命病理性延長(zhǎng)。

乳樣孕酮檢查法的主要優(yōu)點(diǎn)是可在其他方法(如直腸觸診)之前鑒別未孕牛。如果配種后牛未妊娠，測(cè)定第24天乳樣可以預(yù)測(cè)牛在配種后第42天返情；如果?；加屑膊?，則可在再次返情之前進(jìn)行檢查治療。在第24天檢查發(fā)現(xiàn)的妊娠牛應(yīng)在隨后用直腸超聲或觸診檢查確診。牧場(chǎng)進(jìn)行的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)可早至配種后第19天進(jìn)行，此時(shí)如果孕酮濃度低則說明動(dòng)物未孕，據(jù)此可預(yù)測(cè)第1次返情的時(shí)間。最近有研究表明，奶牛和肉牛人工授精后18~24 d或胚胎移植后11~17 d采集糞便樣品可以代替血漿或乳汁測(cè)定孕酮進(jìn)行妊娠診斷。

2乳汁硫酸雌酮檢測(cè)法

硫酸雌酮從數(shù)量上來說是妊娠泌乳奶牛乳中主要的雌激素之一。妊娠期硫酸雌酮濃度逐漸增加，妊娠105 d以后出現(xiàn)在所有妊娠動(dòng)物的乳汁中，而在未孕動(dòng)物其濃度很低或檢測(cè)不到，因此檢測(cè)妊娠105 d之后牛奶硫酸雌酮是可靠的妊娠診斷方法。而且與孕酮分析不同，檢測(cè)硫酸雌酮不要求準(zhǔn)確的采樣日期。但是其主要缺點(diǎn)是獲得陽性診斷的時(shí)間太晚(妊娠105 d后)，因此限制了其應(yīng)用。但對(duì)牧場(chǎng)奶牛繁育工作者來說是應(yīng)該了解的一種檢測(cè)方法。

作者簡(jiǎn)介：田成武(1963-)，男，黑龍江依蘭縣人，大專，高級(jí)畜牧師。

收稿日期：2015-09-21

中圖分類號(hào)：S823.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1005-2739(2016)01-0040-02