陶程，朱方容，李秋捷，彭夢媛，陳慧珠，屈達才

（1.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南寧市 530004；2.廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)科學(xué)研究院，南寧市 530007）

桑樹主要活性物質(zhì)提取技術(shù)的研究進展

陶程1，朱方容2，李秋捷1，彭夢媛1，陳慧珠1，屈達才1

（1.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南寧市 530004；2.廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)科學(xué)研究院，南寧市 530007）

桑樹含有多種活性成分，如黃酮類物質(zhì)、多糖、生物堿等活性物質(zhì)，具有降血糖、降血脂、降血壓、抗氧化、提高人體免疫力等作用?；钚晕镔|(zhì)提取是藥理作用研究的關(guān)鍵和后續(xù)藥品與健康食品開發(fā)的基礎(chǔ)。通過對桑葉、桑枝中總黃酮以及具有代表性的黃酮類化合物，如槲皮素、花青素、蘆丁，桑葉多糖、桑枝多糖，總生物堿以及具有代表性的生物堿類化合物1-脫氧野尻霉素（DNJ）的提取方法進行綜述，為這幾種活性物質(zhì)的利用和開發(fā)提供依據(jù)。

桑樹；活性成分；提取利用

中國是蠶桑產(chǎn)業(yè)的發(fā)源地，也是桑樹種植面積最大的國家之一，擁有豐富的桑樹品種資源。桑樹是落葉性多年生木本植物，自古以來就被認(rèn)作是藥食兩用的珍貴材料，現(xiàn)代科學(xué)也已經(jīng)證實了桑樹資源的營養(yǎng)成分、藥理活性成分及作用機理［1］。

桑葉是家蠶唯一的飼料，同時還可入藥，早在《本草綱目》［2］中就有記載：“桑葉乃手足陽明之藥，汁煎代茗，能止消渴，明目長發(fā)?！爆F(xiàn)代科學(xué)研究結(jié)果表明桑葉中有著多種的有效活性成分，諸如黃酮類化合物、生物堿（DNJ等）、多糖、葉蛋白等。桑枝主要指桑樹的一年生枝條，據(jù)《中國藥典》記載，桑枝作為常用的中藥材，有著祛風(fēng)濕，利關(guān)節(jié)，行水之功效，適用于風(fēng)寒濕痹、四肢拘攣、腳氣浮腫之病癥?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，桑枝主要含有多糖、黃酮類化合物、香豆精類化合物、生物堿等活性物質(zhì)。此外還含有揮發(fā)油、氨基酸、有機酸以及各類維生素，其具有抗真菌、消炎、降血糖、清除體內(nèi)超氧離子自由基的作用［3-7］。本文主要對桑枝桑葉活性物質(zhì)提取方法進行綜述，以期為桑樹資源的多元化開發(fā)提供參考。

1 桑葉、桑枝中黃酮類物質(zhì)

1.1 桑葉、桑枝中黃酮類化合物

黃酮類物質(zhì)是桑葉發(fā)揮功效的主要活性成分之一，具有降血糖、降血脂、降血壓、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗病毒等作用［8］。目前，對其藥理作用研究最多的是降血糖作用。從桑葉、桑枝中提取黃酮類物質(zhì)用來開發(fā)降血糖、降血脂、降血壓和抗腫瘤方面的藥物和健康食品，將為糖尿病患者、心血管病患者帶來福音。桑樹中黃酮類物質(zhì)較為豐富，其主要分為黃酮類、黃酮醇類、二氫黃酮醇類、花色素類等四大類物質(zhì)，包括槲皮素、桑色素、花青素等4 000余種化合物［9-10］。

1.2 桑葉、桑枝中黃酮類化合物提取方法

1.2.1 桑葉、桑枝中總黃酮的提取方法 桑葉、桑枝中總黃酮的提取方法主要有有機溶劑提取法、微波輔助提取法、超聲波提取法、酶提取法、超臨界流體萃取法、半仿生提取法等［11］。目前，關(guān)于提取桑葉桑枝中總黃酮的文獻很多。

1.2.1.1 桑葉中總黃酮提取方法 超臨界流體萃取利用了超臨界流體在臨界壓力和臨界溫度的附近所具有的獨特性能，以此性能作為溶劑萃取物質(zhì)的一種新技術(shù)。肖奇志［12］采用超臨界CO2的方法萃取桑葉中總黃酮，獲取最佳萃取工藝為：壓力35 MPa，夾帶劑乙醇流量0.01 mL/min，溫度為55℃，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)90%，得總黃酮萃取率達2.28%。林英男［13］用同樣的方法提取桑葉中的總黃酮，但改變了工藝條件，在萃取壓力為30 MPa，萃取溫度為40℃，萃取時間為3.0 h，夾帶劑無水乙醇用量為4.0 mL/g的條件下進行驗證試驗，黃酮得率達到3.2%。兩種方法大致相同，但實驗結(jié)果卻不同，筆者認(rèn)為桑品種的不同、產(chǎn)地條件的不同，其桑葉中所含的總黃酮量也可能不一樣。超聲波提取法采用的是超聲波輔助溶劑進行提取，聲波產(chǎn)生了高速、強烈的空化效應(yīng)和攪拌的作用，快速破壞植物的細(xì)胞，使溶劑能夠滲透到藥材細(xì)胞中，縮短提取時間，提高提取效率。蘭才［14］在總黃酮提取工藝的研究中表明與煎煮法、回流法相比，超聲波提取法提取率最高，得出桑葉總黃酮提取的最佳條件為：約0.500g樣品用40 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇水溶液充分浸泡后，超聲波輔助提取45 min，平均提取率為3.3%。

1.2.1.2 桑枝中總黃酮提取方法 何雪梅等［15］采用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計獲得最佳提取桑枝中總黃酮的工藝條件為：溫度80℃，時間為3.5 h，乙醇濃度60%，料液比1∶40，獲得總黃酮率為0.63%；陳建明［16］采用正交試驗的方法對桑枝總黃酮超聲提取的工藝進行研究，獲得最佳工藝條件為：乙醇濃度為80%，料液比為1∶8，超聲反復(fù)提取3次，每次提取時間為20 min，此方法獲得總黃酮的平均提取率為0.719%，提取率高于前者，可見經(jīng)過超聲處理能較好地提取桑枝中的總黃酮，其操作方便、提取時間短、產(chǎn)率高而且無需加熱。目前，關(guān)于桑枝中總黃酮的提取方法的研究報道明顯少于桑葉總黃酮的提取方法，原因可能與桑枝含大量木質(zhì)和纖維不容易粉碎處理有關(guān)。

1.3 桑樹幾種主要黃酮類化合物

1.3.1 槲皮素 槲皮素廣泛存在于植物的花、葉、果實中，是一種具有多種生物學(xué)活性的黃酮類化合物，已知有100多種中草藥中含有槲皮素，如桑樹的枝、葉、果實，菊花、絞股藍、山楂、銀杏葉、雞冠花、魚腥草［17］。槲皮素具有抗氧化和清除自由基、抗纖維化、抗腫瘤等作用，此外還對心血管系統(tǒng)具有降血壓、保護心肌缺血、再灌注損傷、抑制心肌肥厚和抗病毒等作用。王海燕［18］利用超聲波輔助的方法提取桑葉中槲皮素獲得了最優(yōu)工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為51%、液料比26∶1（mL/g）、超聲功率為200 W、超聲溫度70℃，可以得到桑葉槲皮素提取量為11.13 mg/g。由此可見，槲皮素在桑葉中的含量還是相當(dāng)可觀的，可以利用桑葉為原材料開發(fā)有關(guān)槲皮素方面的藥品。

1.3.2 花青素 花青素，由一定數(shù)量的兒茶素、表兒茶素縮合而成，屬于酚類化合物中的類黃酮類化合物，溶于水。花青素是植物體內(nèi)一類次生代謝物質(zhì)，存在于植物花瓣、果實的細(xì)胞液組織及莖葉的表面細(xì)胞中［19］，具有延緩衰老等作用。江巖［20］對新疆藥桑椹花青素做了提取和測定，獲得藥桑椹花青素的最佳提取工藝：溶劑體積比為0.1%的HCl溶液和95%的乙醇為40∶60、固液比為1∶20（g/mL），提取溫度為50℃，提取時間為90 min，在這種條件下花青素得率為0.0305%。此實驗獲得的花青素得率比較少，是藥桑品種的桑椹花青素特別少，還是提取桑椹中花青素的問題，有待繼續(xù)研究。

1.3.3 桑色素 桑色素是一種天然的活性物質(zhì)，主要有抗癌、抗炎、免疫、抗氧化等作用。存在于桑的葉、根皮和果實中［21］，李文娟［22］用AB-8型大孔吸附樹脂對新疆藥桑進行分離純化，獲得新疆藥桑最佳提取條件：用0.1%的HCl-C2H5OH溶液，按1∶5的配比在溫度為40℃時提取1 h。經(jīng)此方法純化后的色素為紫紅色的粉末，色價提高近7倍之多。

2 桑葉、桑枝多糖的提取方法

2.1 桑葉多糖的提取方法

多糖是極性大分子物質(zhì)，國內(nèi)外研究證明，植物、動物及菌類中均含有天然多糖，具有降血糖、降血脂、消除自由基、抗腫瘤、抑制細(xì)菌生長及增強免疫力等功能［23］。桑葉多糖是一種較為常見的生物多糖，中國是桑葉主要產(chǎn)地，大約有83萬hm2的種植面積，年產(chǎn)桑葉1 500多萬t，提取桑葉多糖的原料十分豐富。

目前，對于桑葉多糖的提取主要有熱水浸提法、酸浸提法、堿浸提法、酶提取法、超聲波提取法及微波提取法等。熱水浸提法是以水作為提取劑，無污染且對多糖結(jié)構(gòu)不易造成破壞，但是需要反復(fù)提取多次，提取時間久且提取率不高。沈愛英［24］經(jīng)正交實驗得出最佳桑葉多糖提取條件：桑葉粉質(zhì)量濃度為0.040 g/mL，75℃水浴中抽提2次，每次60 min，用80%（終體積分?jǐn)?shù)）乙醇醇析，此方法測得多糖得率為2.508%。酸堿提取由于提取液為酸性或堿性容易破壞多糖的立體結(jié)構(gòu)，而且提取后還需綜合其pH，程序復(fù)雜，多不為采用。酶提取法即采用熱水浸提法的同時加入酶的提取方法，目前酶提取法有單一酶法、復(fù)合酶法和分別酶法。所采用的酶一般為果膠酶、纖維素酶和中性蛋白酶等［25］。夏平等［26］用纖維素酶∶果膠酶＝1∶1的方法提取桑葉中的多糖得到最佳工藝為：溫度50℃、pH 4.5，酶用量1.0%，提取1 h，提取率為14.32%。此方法對桑葉中的活性物質(zhì)影響較小，且實驗快速。趙俊等［27］發(fā)現(xiàn)超聲波提取法的產(chǎn)量明顯多于水煎煮，且用時少、提取的次數(shù)也少于水煎煮法，所以使用超聲波法提取桑葉多糖值得推廣。黃山等［28］用微波法提取桑葉多糖，獲得的最佳工藝條件：料液比1∶25，溶劑pH 8.0，微波功率為300 W，微波處理10 min，多糖得率為4.26%，比熱水浸提法的得率提高了18.99%［29］。此方法應(yīng)用于植物細(xì)胞破壁，可以使目的物的回收率提高。

2.2 桑枝多糖的提取方法

桑枝是養(yǎng)蠶業(yè)的副產(chǎn)物，是一種傳統(tǒng)的中藥，臨床上主要用于關(guān)節(jié)腫痛、手足麻木、風(fēng)濕痹痛、癱瘓等多種疾病的治療［30］?，F(xiàn)代研究表明，桑枝多糖具有降血糖、提高免疫力、抗氧化等藥理活性［31］。因此，從桑枝中提取桑多糖對桑資源利用具有重要的意義。

費建明等［32］研究了一般提取法、微波提取法、超聲波提取法和生物酶提取法等多種提取桑枝多糖的方法。確定了一般提取法中的最佳條件：以沸水為提取劑，溶液與材料比為20倍，提取時間為100 min，pH 5，獲得最高提取率為16.82%，平均提取率為14.54%。用桑枝一般提取法中最佳的提取條件，中間增加間隔微波處理，采用正交試驗法，對功率、時間比例和微波次數(shù)這三個因素設(shè)置三個水平試驗，獲得微波提取的最適條件：微波功率500 W，3次微波處理，微波時間為總提取時間的60%，獲得最高提取率為17.22%，平均提取率為15.15%，比一般提取法的最高提取率和平均提取率均有所提高。超聲波提取法與微波提取法的處理方法基本一致，用同樣的三個因素設(shè)置三個水平因素獲得最佳超聲波功率為120 W，獲得最高提取率為17.37%，平均提取率為15.27%，同樣比一般提取法提取率高。果膠酶提取法獲得的最高提取率為18.26%，平均提取率17.24，提取率高于以上3種提取方法。

3 桑葉、桑枝中生物堿類物質(zhì)

3.1 桑葉、桑枝中生物堿類化合物種類

桑生物堿具有良好的降血糖、降血脂、抗病毒、提高免疫力、抗衰老等藥理作用［33］。多羥基生物堿及其苷類化合物集中在桑屬植物的親水性較強部位，常與氨基酸、甜菜堿等其他化合物共存。根據(jù)化合物結(jié)構(gòu)特點，又可分為多羥基哌啶類、多羥基吡咯烷類和多羥基降托品烷類［34］。

1-脫氧野尻霉素（DNJ）是桑樹中的一種生物堿，首先是由Inoue等作為抗生素從鏈霉菌中提取得到，由野尻霉素氫化而來。Yoshiaki從桑中分離出DNJ［35］，桑葉中含量為0.11%［36］。DNJ為桑的特有物質(zhì)，其他植物中也含有，如Hang Sub kim等［37］從野跖草中分離并鑒定出了DNJ，但其DNJ含量只有0.01125%。Asano等［38］從風(fēng)信子鱗莖利用甲醇提取物中分離到DNJ，含量也只為0.0012%。可見桑樹的DNJ含量遠高于其他植物，DNJ是桑樹生物堿特征性、標(biāo)志性的生物堿。

現(xiàn)代藥理實驗證明DNJ在治療糖尿病和抗菌消炎等方面具有良好的作用。有相關(guān)文獻報道，糖尿病已經(jīng)成為僅次于心血管病、癌癥的第三大類導(dǎo)致人類死亡的疾病，具有高致死率、高致殘率和高醫(yī)療花費的特征。世衛(wèi)組織表明全球糖尿病患者已超過4億人，而且數(shù)目呈增長趨勢。中國糖尿病患者人數(shù)達9 700萬以上，數(shù)量為世界第一。糖尿病早已成為當(dāng)前世界各國共同面對的公共健康問題，DNJ又具有明顯的抑制食后血糖急劇升高、延緩糖尿病的發(fā)作和惡化等作用，所以對于DNJ的藥理學(xué)研究已經(jīng)相當(dāng)?shù)亩?。但是，桑葉中DNJ的含量非常少，所以選取提取率高、簡單、快速、操作成本低的提取方法，將為以后的桑葉綜合利用、開發(fā)研制降血糖藥品和保健食品提供良好的技術(shù)支持。

3.2 桑葉、桑枝中生物堿類物質(zhì)的提取方法

3.2.1 桑葉、桑枝中總生物堿的提取方法

天然有機化合物的提取方法可分為經(jīng)典提取方法和現(xiàn)代提取方法兩種。經(jīng)典提取方法不需要特殊的儀器，簡單、易操作，可降低提取成本，主要包括溶劑提取法、水蒸氣蒸餾法、分子蒸餾法等。其中，溶劑提取法又包括煎煮法、浸漬法、滲漉法、回流提取法、連續(xù)提取法等?，F(xiàn)代提取方法是以現(xiàn)代先進的儀器為基礎(chǔ)或新發(fā)展起來的提取方法，主要包括超臨界流體萃取法、超聲波提取法、微波提取法、仿生提取法、酶法提取法、加壓逆流提取法、固相微萃取法等。其優(yōu)點在于縮短了天然產(chǎn)物有效成分的提取時間，同時提高提取效率，但又因這些提取方法大多需要先進的儀器或嚴(yán)格的操作技術(shù)，所以普及程度不高。桑中總生物堿提取的常見方法主要有溶劑法、離子交換樹脂法、大孔吸附樹脂法、滲漉—薄膜蒸發(fā)連續(xù)提取法和超臨界流體萃取法等。

劉凡等［39］測定98份不同桑樹品種中總生物堿含量，所用方法為：稱取桑葉粉2.000 g，提取液為25%乙醇和-0.05 mol/L鹽酸，原料質(zhì)量濃度為0.050 g/mL，常溫浸提3 h，次數(shù)為2次，過濾，合并提取液后濃縮，用HPD-100大孔樹脂過柱，純水進行洗脫，洗脫液進行減壓濃縮，以4-羥基哌啶醇為標(biāo)準(zhǔn)物，采用雷氏鹽比色法測定桑葉中的總生物堿的含量，測得結(jié)果表明多數(shù)品種的桑葉總生物堿質(zhì)量比分布在1.50～3.00 mg/g之間。劉一衡等［40］使用優(yōu)化超聲法提取新疆藥桑桑葉總生物堿，獲得提取的優(yōu)化工藝條件為：提取時間20 min，溫度60℃，料液比1∶20（g/mL），超聲功率為800 W，乙醇濃度為60%。在這種條件下，獲得新疆藥桑桑葉總生物堿含量為4.64 mg/g。此種方法獲得生物堿比較高，其他桑品種在提取總生物堿時多有借用。

3.2.2 桑樹生物堿特征成分1-脫氧野尻霉素（DNJ）的提取方法

DNJ的提取方法比較傳統(tǒng)的有蒸餾水提取法、酸提取法、有機溶劑提取法等，隨著科技的進步、實驗儀器的發(fā)展，可在這些傳統(tǒng)方法上施以超聲波、微波等處理，則又有了超聲波提取法和微波提取法等。劉樹興等［41］利用水提法經(jīng)工藝優(yōu)化后獲得最佳提取方案：固液比1∶40，溫度80℃，時間為2.5 h。蒸餾水提取很難過濾桑樹中含有的一些果膠等成分，而且用時多，提取率低，所以現(xiàn)在很少使用。馬靜［42］利用酸水解法和有機溶劑提取法相結(jié)合的方法獲得最佳的工藝條件：桑葉粉末粒度為60目，提取溫度為55℃，pH 1的50%乙醇溶液，提取時間為1.5 h，獲得DNJ的得率為0.062%。此實驗的提取時間有所減少，但是提取量還不理想?；←惖龋?3］利用超聲波強化法獲得最佳工藝條件：超聲功率125 W，每克桑葉浸提劑用量為40 mL，超聲時所用溫度為70℃，超聲時間為20 min，獲得DNJ的得率為0.091%。有文獻表明，微波提取較水蒸氣蒸餾、索氏提取等傳統(tǒng)的中藥提取方法，以及超臨界提取、超聲提取、加速溶劑提取等手段具有一定優(yōu)勢，表現(xiàn)在提取率高，顯示出廣闊的應(yīng)用前景［44］。胡瑞君等［45］利用微波輔助提取技術(shù)獲得最佳實驗條件：微波功率406 W、處理時間1.5 min，固液比為1∶40，提取2次，提取率為0.024%。

4 總結(jié)

4.1 優(yōu)選原料

桑葉、桑枝、桑果含有黃酮類、多糖、生物堿類物質(zhì)等重要活性成分，但是否具有產(chǎn)業(yè)化開發(fā)利用的商業(yè)價值和市場前景，主要取決于原料來源、價格和提取率。廣西是我國最大的蠶桑生產(chǎn)省區(qū)，桑葉、桑枝資源豐富，但桑葉中總黃酮、總生物堿含量均小于3.00 mg/ g。因此，用桑葉提取黃酮類、生物堿類、多糖類物質(zhì)等活性物質(zhì)的成本很高，難以產(chǎn)業(yè)化。桑枝為養(yǎng)蠶的副產(chǎn)物，收獲、干燥、運輸和貯存較為方便，以桑枝為原料提取黃酮類、生物堿類、多糖類物質(zhì)等活性物質(zhì)的成本較低，有利于產(chǎn)業(yè)化開發(fā)。不同桑品種、不同產(chǎn)地、不同季節(jié)和生長時間的桑枝原料，其活性成分含量有較大差異，研究比較蠶桑產(chǎn)區(qū)現(xiàn)有桑品種、不同季節(jié)和生長時間的桑枝原料中活性成分含量，以評估優(yōu)選原料。

4.2 綜合利用，優(yōu)化工藝

桑樹活性物質(zhì)提取和產(chǎn)業(yè)化開發(fā)，應(yīng)以高效、節(jié)能、環(huán)保、安全、多用、高值為目標(biāo)，科學(xué)設(shè)計技術(shù)路線，優(yōu)化生產(chǎn)工藝，實現(xiàn)同一原料提取多種活性物質(zhì)，開發(fā)多種健康產(chǎn)品，廢渣、廢液循環(huán)利用，以提高綜合經(jīng)濟效益。

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S888；

A；

1006-1657（2016）03-0042-5

2016-07-26；

2016-09-05

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（No.CARS-22），八桂學(xué)者建設(shè)工程專項（No：2011104-16）。

信息］陶程（1993—），女，在讀碩士研究生，主要研究桑枝生物堿。E-mail：309529318@qq.com

信息］朱方容（1962—），男，本科，研究員。E-mail：gxzfr@126.com