李光榮，盧靈峰，向成玉，楊　葵，鄧正華，劉靳波

(西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院檢驗科，四川瀘州 646000)

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·論著·

醫(yī)院分離多重耐藥鮑曼不動桿菌耐藥基因的研究*

李光榮，盧靈峰，向成玉，楊葵，鄧正華，劉靳波△

(西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院檢驗科，四川瀘州 646000)

摘要:目的研究多重耐藥鮑曼不動桿菌(MDR-Ab)的耐藥性及相關耐藥基因，為臨床抗菌藥物的合理選擇提供依據(jù)。方法采用MicroScan WalkAway96全自動微生物鑒定/藥敏測試系統(tǒng)篩選鮑曼不動桿菌(Ab)98株；采用聚合酶鏈式反應檢測MDR-Ab攜帶相關耐藥基因OXA-23、OXA-24、IMP、VIM、TEM、SHV；并對耐藥基因擴增陽性的產(chǎn)物進行DNA序列分析。結果98株MDR-Ab對青霉素類和頭孢類抗菌藥物的耐藥率均為100.0%；對氨芐西林/舒巴坦的耐藥率為73.5%，對亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為55.1%和54.1%，對慶大霉素、阿米卡星、妥布霉素的耐藥率分別為100.0%、100.0%和87.8%，對環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、加替沙星的耐藥率分別為89.8%、91.8%和77.6%，對磺胺甲噁唑和利福平的耐藥率分別為91.8%和100.0%，對多黏菌素和多黏菌素B的耐藥率分別為14.3%和11.2%，對四環(huán)素、米諾環(huán)素、替加環(huán)素的耐藥率分別為100.0%、6.1%、4.1%；98株MDR-Ab耐藥基因檢測，各有70株攜帶OXA-23和TEM基因， 53株攜帶VIM基因，41株攜帶IMP基因，未檢測到OXA-24、SHV基因；DNA序列分析結果顯示OXA-23、TEM、IMP和VIM 4種基因分別與NCBI序列的同源性為98%、98%、99%和99%。結論該地區(qū)臨床分離MDR-Ab耐藥情況比較嚴重，耐藥基因的攜帶以OXA-23和TEM為主，攜帶多種耐藥基因是導致 MDR-Ab耐藥的重要原因，臨床醫(yī)務人員對Ab感染患者應盡量根據(jù)藥敏試驗結果合理使用抗菌藥物。

關鍵詞:鮑曼不動桿菌；多重耐藥；耐藥基因

鮑曼不動桿菌(Ab)是一類非發(fā)酵的革蘭陰性桿菌，廣泛存在于醫(yī)院環(huán)境和人體皮膚表面，主要引起獲得性肺炎、菌血癥、尿路感染、繼發(fā)性腦膜炎等，是醫(yī)院感染的重要致病菌之一。根據(jù)2013年CHINET數(shù)據(jù)顯示，Ab的臨床分離率已高于銅綠假單胞菌，位居非發(fā)酵菌臨床分離率第1位[1]。多重耐藥鮑曼不動桿菌(MDR-Ab)指對3種以上不同類型抗菌藥物耐藥的菌株。隨著廣譜抗菌藥物和免疫抑制劑的大量使用，MDR-Ab在臨床中大量出現(xiàn)，給臨床抗感染治療帶來極大的挑戰(zhàn)。為了解本院MDR-Ab相關耐藥基因的存在情況，筆者對本院臨床分離的98株MDR-Ab菌株進行了耐藥性分析，選取6種具有代表性的耐藥基因(SHV、TEM、IMP、VIM、OXA-23、OXA-24)進行檢測，現(xiàn)報道如下。

1材料與方法

1.1菌株來源98株MDR-Ab均來自2012年1月至2014年9月本院收集的臨床標本，標本來源：呼吸道標本中分離73株(74.5%)、分泌物標本中分離12株(12.2%)，血液標本中分離5株(5.1%)，其他標本中分離8株(8.2%)；標本來源科室主要為重癥監(jiān)護室(ICU)、呼吸內(nèi)科和神經(jīng)外科。

1.2儀器與試劑MicroScan WalkAway96全自動微生物鑒定/藥敏測試系統(tǒng)及其配套試劑(德國西門子公司)、C1000TM Thermal Cycle聚合酶鏈式反應(PCR)擴增儀與GelDoc XR凝膠成像儀(美國Bio-RAD公司)、PCR引物(上海生物工程有限公司合成)、Taq DNA酶系等(上海生物工程有限公司)、Maker DL500(大連寶生物工程有限公司)。各靶基因引物序列和產(chǎn)物長度，見表1。

P1：特異性引物1；P2：特異性引物2。

1.3方法

1.3.1細菌鑒定及藥敏試驗98株MDR-Ab均使用MicroScan WalkAway96全自動微生物鑒定/藥敏測試系統(tǒng)鑒定并獲得，同時采用該系統(tǒng)檢測其對氨芐西林-舒巴坦、阿米卡星、頭孢曲松鈉、頭孢他啶、頭孢泊肟、頭孢噻肟、環(huán)丙沙星、頭孢吡肟、加替沙星、慶大霉素、亞胺培南、美羅培南、左氧氟沙星、哌拉西林、美洛西林、磺胺甲噁唑、妥布霉素、多黏菌素、多黏菌素B、利福平、四環(huán)素、米諾環(huán)素、替加環(huán)素等23種抗菌藥物的最小抑菌濃度(MIC)。所有MDR-Ab經(jīng)檢測鑒定后凍存于-80 ℃冰箱。實驗操作及藥敏結果判斷標準參照2011年美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)標準執(zhí)行。藥敏試驗所用質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922、鮑曼不動桿菌ATCC19606。

1.3.2MDR-Ab DNA模板制備采用煮沸法提取細菌DNA模板[2]：挑選已分純單克隆MDR-Ab菌落放入含1 mL生理鹽水的EP管中，混勻后在離心半徑為10 cm的離心機上8 000 r/min離心2 min，棄上清后加100 μL蒸餾水在漩渦混合器上充分震蕩混勻，在干浴鍋上95 ℃干浴10 min，再在離心半徑為10 cm的離心機上12 000 r/min離心2 min，所得上清液即為檢測細菌DNA的模板。

1.3.3反應體系及條件PCR擴增反應體系：總反應體系為25 μL，其中10×緩沖液2.5 μL，25 mmol/L氯化鎂(MgCl2)1.5 μL，25 mmol/L脫氧核糖核苷酸(dNTPs)0.2 μL，DNA模板2 μL，5 μmol/L P1和P2引物各1 μL，5 U/μL TaqDNA酶0.5 μL，用無菌水補足至總體積25 μL，通過C1000TM Thermal Cycle PCR擴增儀擴增。反應條件：93 ℃預變性3 min，93 ℃變性30 s→53 ℃復性30 s→72 ℃延伸l min，循環(huán)35個周期，72 ℃延長5 min。

1.3.4電泳與成像PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠(1.5%)電泳跑膠，以無菌生理鹽水為陰性對照，瓊脂糖凝膠上出現(xiàn)目的條帶即為基因檢測陽性，通過GelDoc XR凝膠成像儀觀察并攝像保存。

1.3.5PCR產(chǎn)物的測序PCR擴增陽性的產(chǎn)物送上海鉑尚生物技術有限公司純化、測序，讀序軟件為Chromas。測序結果與序列比對軟件BLASTN與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進行對比分析。

1.4統(tǒng)計學處理采用WHONET5.6軟件進行耐藥性分析。

2結果

2.1藥敏試驗結果98株MDR-Ab對青霉素類和頭孢類抗菌藥物的耐藥率均為100.0%；對氨芐西林/舒巴坦的耐藥率為73.5%，對碳青霉烯類抗菌藥物中亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為55.1%和54.1%，對氨基糖苷類抗菌藥物中慶大霉素、阿米卡星、妥布霉素的耐藥率分別為100.0%、100.0%和87.8%，對喹諾酮類抗菌藥物中環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、加替沙星的耐藥率分別為89.8%、91.8%和77.6%，對磺胺甲噁唑和利福平的耐藥率分為91.8%和100.0%，對多黏菌素和多黏菌素B的耐藥率分為14.3%和11.2%，對四環(huán)素、米諾環(huán)素、替加環(huán)素的耐藥率分別為100.0%、6.1%、4.1%。見表2。

R:耐藥；I：中介；S：敏感。

2.2基因檢測結果對98株MDR-Ab菌進行OXA-23、OXA-24、IMP、VIM、TEM、SHV基因檢測，分別有70株(71.4%)攜帶OXA-23基因和TEM基因，53株(54.1%)攜帶VIM基因，41株(41.8%)攜帶IMP基因，28株(28.5%)同時攜帶TEM、VIM和IMP基因，26株(26.5%)同時攜帶OXA-23、IMP和VIM基因，26株(26.5%)同時攜帶OXA-23、TEM和IMP基因，47株(48.0%)同時攜帶OXA-23、TEM和VIM基因，26株(26.5%)同時攜帶OXA-23、TEM、IMP和VIM基因，未檢測到攜帶OXA-24、SHV基因的MDR-Ab。

2.3PCR陽性產(chǎn)物電泳結果對OXA-23、VIM、IMP、TEM基因擴增陽性的產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳，電泳結果見圖1～4。

M：DNA分子量標記物DL500；N：陰性對照；1～8：陽性標本。

圖1TEM基因的擴增產(chǎn)物電泳

M：DNA分子量標記物DL500；N：陰性對照；1～8：陽性標本。

圖2VIM基因的擴增產(chǎn)物電泳

2.4PCR擴增陽性產(chǎn)物測序結果OXA-23、VIM、IMP、TEM 4種基因經(jīng)PCR擴增后的陽性產(chǎn)物測序結果經(jīng)BLAST程序對比分析，與NCBI已登錄目的基因的同源性分別為98%、99%、99%和98%。

M：DNA分子量標記物DL500；N：陰性對照；1～8：陽性標本。

圖3IMP基因的擴增產(chǎn)物電泳

M：DNA分子量標記物DL500；N：陰性對照；1～8：陽性標本。

圖4OXA-23基因的擴增產(chǎn)物電泳

3討論

Ab是引起臨床感染的主要病原菌之一，尤其是MDR-Ab菌株的出現(xiàn)常常導致感染者不治身亡[3]。由于其存在廣泛且耐藥機制復雜，臨床分離率逐年升高，尤其容易感染老年患者、重癥患者和免疫力低下的患者，給臨床抗感染治療帶來很大的困難。

本研究結果顯示，MDR-Ab主要來自呼吸道標本(74.5%)，這與國內(nèi)外大多數(shù)報道接近[4]，提示呼吸道是Ab最容易侵襲的部位。標本來源科室主要為ICU、呼吸內(nèi)科和神經(jīng)外科，考慮這些科室主要是一些重癥患者，住院時間較長，容易進行一些侵襲性操作和激素、免疫抑制劑等治療，一定程度上造成了MDR-Ab在醫(yī)院環(huán)境的定植和播散。

隨著抗菌藥物在臨床的廣泛使用，Ab的耐藥情況越來越嚴重，尤其是MDR-Ab。本次研究的MDR-Ab對大部分常規(guī)抗菌藥物耐藥率均大于73.5%，由此可見本院分離的MDR-Ab耐藥情況十分嚴峻，常規(guī)抗菌藥物對MDR-Ab已基本失去抗菌作用。亞胺培南和美羅培南是臨床常用于治療Ab感染的碳青霉烯類抗菌藥物，但其耐藥率已分別達到55.1%和54.1%，這與臨床醫(yī)務人員在治療Ab感染時經(jīng)驗性選用既往相對敏感的亞胺培南或美羅培南，使耐藥菌株不斷得到選擇性生存有關，應引起臨床高度重視。Dinc等[5]研究發(fā)現(xiàn)，對于MDR-Ab引起的嚴重感染，選用大劑量多黏菌素B聯(lián)合利福平或頭孢哌酮/舒巴坦聯(lián)合米諾環(huán)素進行治療，其耐藥性大幅降低，提示聯(lián)合用藥也是治療MDR-Ab感染的有效方式。本研究還發(fā)現(xiàn)，MDR-Ab對部分藥物有較低的耐藥率，如多黏菌素和多黏菌素B的耐藥率分別為14.3%和11.2%，米諾環(huán)素和替加環(huán)素的耐藥率分別為6.1%、4.1%，提示臨床醫(yī)務人員對MDR-Ab導致的感染可以考慮使用這些藥物。

目前認為MDR-Ab對大部分抗菌藥物的耐藥機制是產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶，β-內(nèi)酰胺酶主要包括Ambler分類的A、B、C、D 4類酶[6]，超廣譜β-內(nèi)酰胺酶為A類酶，主要包括SHV、TEM和CTX-M等[7]?？伤鈫苇h(huán)β-內(nèi)酰胺類和頭孢菌素類抗菌藥物，但不能水解碳青霉烯類和頭霉素，可被β-內(nèi)酰胺酶抑制劑抑制。B類酶又被稱為金屬β-內(nèi)酰胺酶(MBLs)，包括IMP、VIM、SPM、GIM、SIM、KHM和NDM等[8-9]，由于其高效的碳青霉烯酶活性和對抑制劑較強的抵抗能力，它對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物具有廣泛的水解作用。C類酶為頭孢菌素酶(AmpC酶)，可由染色體和質粒介導，且插入序列ISAbal的存在可增強AmpC酶的表達[10]。D類酶又叫苯唑西林酶，包括OXA-23、OXA-24、OXA-58等[11]，是β-內(nèi)酰胺酶中最復雜多樣的一種酶，幾乎對所有β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物高度耐藥，能降低Ab菌株外膜蛋白的表達[12]。本研究對98株MDR-Ab菌進行OXA-23、OXA-24、IMP、VIM、TEM、SHV 6種基因檢測，主要檢測出OXA-23、TEM、IMP和VIM 4種基因陽性，其中OXA-23和TEM基因的檢出率都達到了71.4%(70株)，接近湯鳳珍等[13]的報道。IMP和VIM基因的檢出率分別為41.8%(41株)和54.1%(53株)，另外同時攜帶3種以上耐藥基因的MDR-Ab也多達26株以上。說明本地區(qū)耐藥基因的攜帶以OXA-23和TEM為主，另外多種耐藥基因的攜帶是Ab多重耐藥的重要原因，這導致了Ab對多種抗菌藥物的耐藥及各種細菌之間耐藥能力的進一步傳播。

綜上所述，本地區(qū)臨床分離MDR-Ab耐藥情況比較嚴重，耐藥基因的攜帶以OXA-23和TEM為主，多種耐藥基因是MDR-Ab耐藥的重要原因。及時了解醫(yī)院Ab的耐藥性及耐藥基因攜帶情況，對于預防、監(jiān)測并控制醫(yī)院內(nèi)Ab感染和傳播具有重要意義。臨床醫(yī)務人員對Ab感染患者應避免經(jīng)驗性用藥，盡量根據(jù)藥敏試驗結果合理使用抗菌藥物。

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Study on multiple drug resistance gene of Acinetobacter baumanii isolated from hospital*

LiGuangrong，LuLingfeng，XiangChengyu，YangKui，DengZhenghua，LiuJinbo△

(DepartmentofClinicalLaboratory,theAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China)

Abstract:ObjectiveTo study the drug resistance of multiple-drug-resistant Acinetobacter baumannii(MDR-Ab) and its relative carbapenemases genes,in order to provide references for rational use of antibacterial agents.MethodsA total of 98 strains of Acinetobacter baumannii(Ab) were identified by using the MicroScan WalkAway96 automated microbial identification susceptibility testing system,and the resistance genes,including OXA-23,OXA-24,IMP,VIM,TEM and SHV,were detected by using the polymerase chain reaction.DNA sequences of positive amplification products of the resistance gene were analysed.ResultsThe drug resistance rates of 98 strains of MDR-Ab to penicillin class and cephalosporin class both were 100.0%,to imipenem and meropenem were 55.1% and 54.1% respectively,to gentamicin,amikacin and tobramycin were 100.0%,100.0% and 87.8% respectively,to ciprofloxacin,levofloxacin and gatifloxacin were 89.8%,91.8% and 77.6% respectively,to sulfamethoxazole and rifampicin were 91.8% and 100.0% respectively,to polymyxin B and polymyxin were 14.3% and 11.2% respectively,to tetracycline,minocycline and tigecycline were 100.0%,6.1% and 4.1% respectively.The results of resistance genes detection in 98 strains of MDR-Ab showed that 70 strains carried TEM and OXA-23 gene,53 strains carried VIM gene,41 strains carried IMP gene,while OXA-24 and SHV genes were not detected.DNA sequence analysis showed that the homology of OXA-23,TEM,IMP and VIM genes were 98%,98%,99% and 99%.ConclusionThe condition of antibacterial resistance of MDR-Ab in this area is very serious,and TEM and OXA-23 are the main drug resistance genes.Carrying multiple resistance genes is an important cause of MDR-Ab resistance.The treatment of patients with Ab infection should be based on the results of drug sensitivity test for rational use of antibacterial agents.

Key words:Acinetobacter baumannii；multiple-drug resistantce；drug resistance genes

基金項目：瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院基金資助項目(14035)。

作者簡介：李光榮，男，主管檢驗師，主要從事微生物和生物化學檢驗研究。 △通訊作者E-mail：liujb7203@163.com。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.05.010

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)05-0602-04

(收稿日期：2015-11-13)