陳　揚(yáng)，胡大春，崔　穎，王　林，劉德華，邵劍春，穆士杰△

(1.第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院輸血科，陜西西安 710038；2.昆明市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南昆明 650011)

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·論著·

某院耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MLVA基因分型及流行狀況研究*

陳揚(yáng)1，胡大春2，崔穎1，王林1，劉德華2，邵劍春2，穆士杰1△

(1.第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院輸血科，陜西西安 710038；2.昆明市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南昆明 650011)

摘要:目的通過(guò)構(gòu)建適合臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)應(yīng)用的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)菌株同源性多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(MLVA)分型方法，建立昆明地區(qū)臨床分離MRSA菌株的MLVA基因分型基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫(kù)，分析醫(yī)院MRSA感染流行情況。方法收集昆明市第一人民醫(yī)院臨床微生物室2010年10月至2013年12月分離的111株MRSA菌株，對(duì)7個(gè)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)位點(diǎn)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增和產(chǎn)物電泳分析，歸類各菌株的基因型別。結(jié)果VNTR09-01位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果顯示9 bp的重復(fù)子，重復(fù)規(guī)律性不強(qiáng)、易突變；111株分離株被分為25個(gè)基因型別(A～Y)，其中G、A、B為主要型別，分別占47.7%、13.5%、8.1%；呼吸內(nèi)科、神經(jīng)外科、重癥監(jiān)護(hù)室(ICU)和乳腺科存在MRSA集中流行趨勢(shì)。結(jié)論MLVA分型方法可推廣應(yīng)用于本研究中7個(gè)VNTR位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)，部分科室存在MRSA同源菌集中流行情況，值得高度關(guān)注。

關(guān)鍵詞:耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；基因分型；多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分型

1961年，英國(guó)學(xué)者Jevons首次發(fā)現(xiàn)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)[1]。2011年美國(guó)感染病學(xué)會(huì)(IDSA)MRSA感染治療指南——《IDSA-2011-MRSA指南》中報(bào)道，美國(guó)醫(yī)院細(xì)菌感染中MRSA感染率為31.8%，遠(yuǎn)超其他細(xì)菌感染率[2]，其所致感染呈散發(fā)、流行，甚至暴發(fā)[3-4]。我國(guó)金黃色葡萄球菌臨床分離株中MRSA所占百分比增至50%以上[5]，根據(jù)2011年中國(guó)CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)[6]，MRSA僅對(duì)噁唑烷酮類、利奈唑胺、萬(wàn)古霉素等糖肽類抗菌藥物敏感。MRSA引起醫(yī)院感染的暴發(fā)已成為重點(diǎn)關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。本研究構(gòu)建適合臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)應(yīng)用的MRSA菌株同源性多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(MLVA)分型方法，建立本地臨床分離MRSA菌株的MLVA基因分型基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫(kù)，分析MRSA的醫(yī)院流行情況，為制訂有效控制措施提供客觀依據(jù)。

1材料與方法

1.1菌株來(lái)源收集昆明市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科微生物室2010年10月至2013年12月臨床分離鑒定的MRSA菌株111株。

1.2儀器與試劑MicroScan WalkAway 40 SI全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)(德國(guó)西門子公司)；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)試劑、50 bp DNA標(biāo)記物(美國(guó)Fermentas公司)；瓊脂糖(西班牙Biowest公司)。

1.3MRSA臨床菌株的分離培養(yǎng)與鑒定參照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》(第3版)的臨床病原微生物分離培養(yǎng)方法進(jìn)行菌株的分離培養(yǎng)，根據(jù)血漿凝固酶試驗(yàn)，金黃色葡萄球菌A蛋白(SPA)單克隆抗體檢測(cè)和MicroScan WalkAway 40 SI全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)進(jìn)行菌種鑒定和抗菌藥物敏感性試驗(yàn)。

1.4MRSA菌株DNA提取采用離心柱法提取高濃度的模板DNA。

1.5可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)方法的建立

1.5.1引物設(shè)計(jì)與合成本研究參考Schouls等[7]在S.aureus strain N315基因組序列中尋找的VNTR序列位點(diǎn)，采用BLASTN進(jìn)行引物序列比對(duì)和特異性驗(yàn)證后，從中選取7個(gè)分辨力和分型能力較好的位點(diǎn)，由上海生工公司合成其側(cè)翼特異性引物，見(jiàn)表1(見(jiàn)《國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁(yè)“論文附件”)。

1.5.2反應(yīng)體系和條件上、下游引物各1.5 μL，Taq緩沖液5 μL，三磷酸脫氧核糖核苷酸(dNTP)4 μL，氯化鎂(MgCl2)4 μL，DNA模板2 μL，Taq DNA聚合酶1.4 μL，雙蒸水補(bǔ)至50 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，退火30 s(各自引物的Tm值-5 ℃)，72 ℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃后延伸10 min。

1.5.3結(jié)果檢測(cè)與分析配制2%的瓊脂糖凝膠，用50 bp DNA標(biāo)記物確定其相對(duì)分子質(zhì)量。用50 bp DNA標(biāo)記物作為相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)照，按照產(chǎn)物片段大小確定其多態(tài)性情況，即人工估算出各細(xì)菌株各VNTR序列位點(diǎn)的基序重復(fù)次數(shù)。

1.6所構(gòu)建的PCR方法對(duì)菌株VNTR多態(tài)性檢測(cè)的驗(yàn)證

1.6.1重復(fù)性驗(yàn)證從研究菌株中抽取24株，每株MRSA用7對(duì)引物進(jìn)行不同位點(diǎn)VNTR多態(tài)性擴(kuò)增檢測(cè)3次，分析3次產(chǎn)物的一致性。

1.6.2正確性測(cè)序驗(yàn)證選取14株研究菌株(編號(hào)為1～14號(hào))，分別對(duì)所構(gòu)建的7個(gè)VNTR位點(diǎn)多態(tài)性PCR檢測(cè)方法進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.7臨床分離MRSA菌株的MLVA分型數(shù)據(jù)庫(kù)建立對(duì)7個(gè)VNTR位點(diǎn)及其核心基序重復(fù)次數(shù)進(jìn)行編號(hào)，然后分別對(duì)111株臨床分離MRSA菌株中每一株細(xì)菌進(jìn)行7個(gè)VNTR位點(diǎn)多態(tài)性組合編碼，并根據(jù)其編碼進(jìn)行MLVA型別歸類，得出MLVA分型數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)。

1.8臨床分離主要MLVA型別菌株的流行趨勢(shì)分析根據(jù)MLVA分型結(jié)果及菌株分離的時(shí)間，分析主要MLVA型別菌株的流行時(shí)間分布及病房分布情況。

2結(jié)果

2.1PCR方法對(duì)菌株VNTR多態(tài)性檢測(cè)的重復(fù)性驗(yàn)證從研究的MRSA菌株中抽取24株，每株MRSA在不同VNTR位點(diǎn)重復(fù)檢測(cè)3次，每次DNA擴(kuò)增片段大小完全相符。

2.2PCR方法對(duì)菌株VNTR多態(tài)性檢測(cè)的正確性測(cè)序驗(yàn)證選取14株研究菌株(編號(hào)為1～14號(hào))，分別對(duì)所構(gòu)建的7個(gè)VNTR位點(diǎn)多態(tài)性PCR檢測(cè)方法進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，VNTR09-01位點(diǎn)的9 bp重復(fù)子規(guī)律性不強(qiáng)，堿基突變率較高。VNTR位點(diǎn)序號(hào)2上游引物擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖1、2(見(jiàn)《國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁(yè)“論文附件”)，其中重復(fù)子基序?yàn)?0 bp，3、4號(hào)研究菌株分別重復(fù)0次(見(jiàn)圖1)和7次(見(jiàn)圖2)。其余各VNTR位點(diǎn)引物擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序序列圖略。

2.3111株臨床分離MRSA菌株6個(gè)VNTR位點(diǎn)的多態(tài)性檢測(cè)部分菌株(24株)中6個(gè)VNTR基因位點(diǎn)的多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果，見(jiàn)圖3(見(jiàn)《國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁(yè)“論文附件”)。各位點(diǎn)的VNTR多態(tài)性變化，見(jiàn)表2。

2.4111株臨床分離MRSA的MLVA基因分型依據(jù)6個(gè)VNTR序列位點(diǎn)多態(tài)性在111株臨床分離MRSA菌株中的變化信息，對(duì)各株細(xì)菌進(jìn)行基因VNTR多態(tài)性編碼，具有相同編碼的菌株歸類為同一分型類別中，得到111株臨床分離MRSA菌株的MLVA基因型別歸類數(shù)據(jù)庫(kù)。111株分離株可分為25個(gè)基因型別(A～Y)，其中G、A、B為主要型別，分別占47.7%(53/111)、13.5%(15/111)、8.1%(9/111)。

2.5主要MLVA型別菌株的流行趨勢(shì)分析根據(jù)MLVA分型結(jié)果及菌株分離的時(shí)間進(jìn)行分析，主要MLVA型別菌株的流行時(shí)間分布情況見(jiàn)圖4(見(jiàn)《國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁(yè)“論文附件”)；病房分布情況見(jiàn)圖5(見(jiàn)《國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁(yè)“論文附件”)，呼吸內(nèi)科、神經(jīng)外科、重癥監(jiān)護(hù)室(ICU)和乳腺科存在MRSA集中流行趨勢(shì)。

3討論

目前，脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)(PFGE)作為細(xì)菌分子分型的“金標(biāo)準(zhǔn)”而被首推[8]，但其操作繁瑣、費(fèi)時(shí)。2009年，Schouls等[7]對(duì)529株金黃色葡萄球菌分別采用MLVA、Spa和PFGE 3種分型方法進(jìn)行比較，結(jié)果顯示MLVA與PFGE有相似多樣性指數(shù)。2010年陶曉霞等[9]參考Sabat選取的5個(gè)VNTR位點(diǎn)對(duì)49株MRSA進(jìn)行了MLVA分型，結(jié)果顯示該方法與PFGE具有較好的符合率。此外，在Pourcel等[10]收集的300株MRSA研究中，顯示MLVA與多位點(diǎn)序列分型(MLST)和Spa分型方法相比有較強(qiáng)的分辨力，且另有研究證明VNTR的重復(fù)性和穩(wěn)定性更好[11]。在本研究選取的7個(gè)VNTR位點(diǎn)中，6個(gè)位點(diǎn)的分辨力和分型能力較好，操作較PFGE更為簡(jiǎn)單易行、快速，在臨床實(shí)驗(yàn)室具有較好的可操作性，值得推廣應(yīng)用。

本研究在對(duì)2010年10月至2013年12月收集到的111株分離自住院患者臨床標(biāo)本的MRSA進(jìn)行MLVA型別歸類后，發(fā)現(xiàn)呼吸科、神經(jīng)外科、ICU和乳腺科在以上時(shí)間段內(nèi)存在MRSA集中流行趨勢(shì)。醫(yī)務(wù)人員的手是引起醫(yī)院MRSA感染的重要傳播途徑之一，由醫(yī)務(wù)人員的手傳播細(xì)菌而造成的醫(yī)院感染占30%左右[9]。因此，應(yīng)進(jìn)一步提高醫(yī)務(wù)人員手衛(wèi)生依從性，努力阻斷MRSA的傳播途徑。

綜上所述，MLVA可推廣應(yīng)用于本研究中7個(gè)VNTR位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)，該院部分科室存在MRSA同源菌集中流行情況，值得高度關(guān)注。

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MLVA genotyping and the prevalence status analysis of methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolated from a hospital*

ChenYang1，HuDachun2，CuiYing1，WangLin1，LiuDehua2，ShaoJianchun2，MuShijie1△

(1.DepartmentofBloodTransfusion,TangduHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an,Shaanxi710038,China；2.DeparmentofClinicalLaboratory,theFirstPeople′sHospitalofKunmingCity,Kunming,Yunnan650011,China)

Abstract:ObjectiveTo establish multiple-locus variable-number tandem repeat assay(MLVA) genotyping database for clinical isolates of methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA) in Kunming area and analyse the prevalence status of MRSA in hospital,through establishing a classification method for MRSA by homology MLVA which was appropriate to routine application in clinical laboratory.MethodsA total of 111 strains of MRSA isolated by the Clinical Microbiology Chamber of the First People′s Hospital of Kunming City from October 2010 to December 2013 were collected.The polymerase chain reaction(PCR) amplification and electrophoresis for analysis of PCR products were carried out for the seven sites of variable number tandem repeats(VNTR),classification of strain based on genotypes was carried out,as well.ResultsThe sequencing results of VNTR09-01 site showed 9 bp repetitive sequence elements whose regularity was not strong,and the repetitive elements was mutable.The 111 isolates were divided into 25 kinds of genotypes(A-Y),among which genotype G,A and B were the main types,accounted for 47.7%,13.5% and 8.1% respectively.ConclusionMLVA could be generally applied in the seven sites of VNTR in this study.Some departments might exit concentrated epidemic of homologous MRSA strains,which is worthy of being paid more attention.

Key words:methicillin-resistant Staphylococcus aureus；genotype；multiple-locus variable-number tandem repeat assay

基金項(xiàng)目：云南省教育廳科學(xué)研究基金項(xiàng)目(2010C097)。

作者簡(jiǎn)介：陳揚(yáng)，女，住院醫(yī)師，主要從事臨床微生物學(xué)與檢驗(yàn)研究。 △通訊作者，E-mail:musj1963@fmmu.edu.cn。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.05.004

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-4130(2016)05-0586-03

(收稿日期：2015-11-26)