喻　容，胡發(fā)莉，石國民，彭雪峰，馬小華，石　燕，聶　英，陳擁軍，吳佳玲，向延根

(長沙市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南長沙 410006)

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·論著·

4種檢測方法在結(jié)核病臨床診斷中的應(yīng)用價(jià)值*

喻容，胡發(fā)莉，石國民，彭雪峰，馬小華，石燕，聶英，陳擁軍，吳佳玲，向延根

(長沙市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南長沙 410006)

摘要:目的探討結(jié)核分枝桿菌感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT.TB)、結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)試驗(yàn)、結(jié)核分枝桿菌抗體免疫球蛋白M(IgM)與免疫球蛋白G(IgG)聯(lián)合檢測，以及痰液或肺泡灌洗液涂片4種肺結(jié)核診斷方法的臨床診斷價(jià)值。方法選取該院2014年10月至2015年5月臨床初次診斷為結(jié)核病，且尚未用藥的住院患者516例，對所有患者行T-SPOT.TB、結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)試驗(yàn)、結(jié)核分枝桿菌抗體IgM與IgG聯(lián)合檢測和痰液或肺泡灌洗液涂片檢測，計(jì)算并比較各方法的靈敏度。結(jié)果T-SPOT.TB的靈敏度(88.76%)高于結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)試驗(yàn)(45.74%)、結(jié)核分枝桿菌抗體IgM與IgG聯(lián)合檢測(72.87%)、痰液或肺泡灌洗液涂片(17.25%)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論T-SPOT.TB在檢測結(jié)核分枝桿菌感染、輔助結(jié)核病診斷方面具有很高的應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)聯(lián)合其他檢測方法可提高診斷率，滿足不同的臨床需要。

關(guān)鍵詞:肺結(jié)核；結(jié)核分枝桿菌感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)；結(jié)核分枝桿菌抗體；結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)試驗(yàn)；痰液或肺泡灌洗液涂片

肺結(jié)核是一種由結(jié)核分枝桿菌感染引起，嚴(yán)重危害人類健康的慢性傳染病。目前全世界活動性肺結(jié)核患者達(dá)2 000萬人，每年死于結(jié)核病的患者人數(shù)達(dá)200～300萬人[1-2]。我國活動性肺結(jié)核患者約有450萬人，年均死亡約13萬人[3-4]，傳統(tǒng)的羅氏培養(yǎng)法雖然仍被視為“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其靈敏度不高且耗時(shí)長，不能滿足臨床快速診斷的需要，因此，為彌補(bǔ)羅氏培養(yǎng)法的缺點(diǎn)，采用快速準(zhǔn)確的檢測方法對防治結(jié)核分枝桿菌感染極為重要[5]。目前，針對結(jié)核分枝桿菌的快速檢測方法有多種。(1)影像學(xué)檢查，如X射線、CT等。(2)病理學(xué)檢查，如對病灶進(jìn)行組織切片。(3)實(shí)驗(yàn)室檢查：免疫學(xué)檢查，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、膠體金法等；微生物學(xué)檢查，該方法是診斷結(jié)核分枝桿菌感染的金標(biāo)準(zhǔn)，包括直接涂片查找抗酸桿菌和結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)；分子生物學(xué)檢查，包括核酸分子雜交和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)等；以及結(jié)核分枝桿菌感染T細(xì)胞檢測等[6]。本研究采用結(jié)核分枝桿菌抗體檢測、結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)試驗(yàn)、痰液或肺泡灌洗液涂片檢測和結(jié)核分枝桿菌感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT.TB)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料2014年10月至2015年5月本院收治的臨床初次診斷為結(jié)核病且尚未用藥的住院患者516例，男398例，女118例；年齡19～78歲，平均(44.50±6.68)歲。結(jié)核病患者納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者具有長期低熱、咳嗽、咳痰、咯血、消瘦、乏力等典型癥狀，胸部CT提示明顯肺結(jié)核征象；(2)行支氣管鏡肺泡灌洗，灌洗液內(nèi)找到抗酸桿菌，或病理顯微鏡檢查證實(shí)具有肺結(jié)核改變，或痰涂片檢查顯示抗酸桿菌陽性至少1次，或結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)陽性；(3)患者胸腔積液穿刺檢查，穿刺液為滲出液，穿刺液標(biāo)本檢查可見大量淋巴細(xì)胞，腺苷脫氨酶大于45 U/L[7]。

1.2方法對所有患者分別進(jìn)行T-SPOT.TB、結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)試驗(yàn)、結(jié)核分枝桿菌抗體檢測和痰液或肺泡灌洗液涂片檢測。

1.2.1T-SPOT.TB使用上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司提供的T-SPOT.TB試劑盒，按照說明書進(jìn)行操作。采集每例患者5 mL肝素抗凝血，加入Ficoll淋巴分離液后，經(jīng)過離心，洗滌得到外周單核細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)板顯微鏡計(jì)數(shù)，若每個(gè)大方格單核細(xì)胞數(shù)超過55個(gè)則需進(jìn)行細(xì)胞稀釋，若低于35視為不合格標(biāo)本，需重新抽血，最后通過放大鏡進(jìn)行斑點(diǎn)計(jì)數(shù)。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)空白對照孔點(diǎn)數(shù)為0～5，總檢測孔數(shù)與空白對照孔數(shù)的差值大于或等于6，則檢測標(biāo)本判為陽性；(2)空白對照孔點(diǎn)數(shù)大于或等于6，總檢測孔數(shù)是空白對照孔點(diǎn)數(shù)的2倍，則檢測標(biāo)本判為陽性。

1.2.2結(jié)核分枝桿菌抗體檢測試驗(yàn)分別采用濰坊市康華生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的結(jié)核分枝桿菌免疫球蛋白G(IgG)及免疫球蛋白M(IgM)抗體膠體金檢測試劑盒和結(jié)核分枝桿菌抗體酶聯(lián)免疫法檢測試劑盒對患者血清標(biāo)本進(jìn)行檢測，具體檢測方法及判斷標(biāo)準(zhǔn)參照試劑盒說明。

1.2.3結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)試驗(yàn)將24 h痰液標(biāo)本用2% N-乙酰-L-半胱氨酸-氫氧化鈉(NALC-NaOH)消化液前處理(左旋半胱氨酸臨用時(shí)配制)，采用堿消化方式。視標(biāo)本性狀，加1～2倍體積的處理液于無菌痰杯中，使痰液充分液化，整個(gè)處理時(shí)間不超過20 min，再振蕩均勻并加入pH7.0的生理鹽水至35 mL處，3 000 r/min離心20 min，棄上清液，加生理鹽水1 mL溶解后接種到液體分枝桿菌培養(yǎng)管(MGIT)，再放入美國BD公司生產(chǎn)的BACTEC MGIT 960全自動快速分枝桿菌培養(yǎng)鑒定藥敏儀，具體操作方法參照儀器手冊。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

T-SPOT.TB的靈敏度明顯高于結(jié)核分枝桿菌抗體IgG與IgM聯(lián)合檢測、痰液及肺泡灌洗液涂片檢測和結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)試驗(yàn)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為102.274、8.718、32.979，P<0.01)。結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)試驗(yàn)的靈敏度低于結(jié)核抗體IgG與IgM聯(lián)合檢測，高于痰液或肺泡灌洗液涂片，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為137.633、60.647，P<0.01)。結(jié)核分枝桿菌抗體IgG與IgM聯(lián)合檢測的靈敏度高于痰液或肺泡灌洗液涂片，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=13.081，P<0.01)。見表1。

*：P<0.01，與T-SPOT.TB比較；#：P<0.01，與結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)試驗(yàn)比較；△：P<0.01，與結(jié)核分枝桿菌抗體IgG與IgM聯(lián)合檢測比較。

3討論

結(jié)核病是目前世界上首要的感染性疾病，是全球關(guān)注的公共衛(wèi)生和社會問題之一。我國是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)、高危險(xiǎn)性的國家[8]，因此，早期診斷是結(jié)核病早期治療和預(yù)防傳播的重要手段之一，其中實(shí)驗(yàn)室檢查對結(jié)核病輔助診斷起著舉足輕重的作用。

T-SPOT.TB技術(shù)是近幾年新研發(fā)的結(jié)核病診斷技術(shù)，其基于PCR技術(shù)，從單細(xì)胞水平對具有分析抗體或細(xì)胞因子功能的細(xì)胞極性進(jìn)行檢測。無論患者是否出現(xiàn)癥狀或癥狀是否典型，都能通過檢測效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的水平來確定是否有結(jié)核分枝桿菌感染，具有較高的靈敏度[8]。本研究T-SPOT.TB檢測的靈敏度為88.76%，與朱國勇[9]報(bào)道的83.33%和國外文獻(xiàn)[8，10-12]報(bào)道的83%～100%基本相符。本研究發(fā)現(xiàn)，在516例肺結(jié)核患者中有109例患者T-SPOT.TB檢測陽性，其余3種方法檢測均為陰性，這說明在其他3種檢測方法不能檢出肺結(jié)核感染時(shí)，T-SPOT.TB對結(jié)核感染仍具有顯著的診斷價(jià)值。另外，在236例結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)試驗(yàn)陽性患者中，有230例T-SPOT.TB也是陽性，這可以說明T-SPOT.TB與“金標(biāo)準(zhǔn)”檢測有很好的一致性。但結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)試驗(yàn)具有操作繁瑣，需要體外預(yù)處理及專門培訓(xùn)技術(shù)人員，成本高，且只能用于檢測是否有結(jié)核感染，并不能鑒別活動性肺結(jié)核和結(jié)核潛伏感染等缺點(diǎn)，這都限制了其在臨床的推廣和應(yīng)用。我國結(jié)核病發(fā)病率高，隱匿性結(jié)核多，這削弱了T-SPOT.TB在診斷活動性肺結(jié)核時(shí)的特異性[13]。但是該法檢測所需時(shí)間不長，24 h即可出結(jié)果，而且能檢測出隱匿性結(jié)核，可實(shí)現(xiàn)疾病的早發(fā)現(xiàn)、早治療，因此可將其列入體檢項(xiàng)目?？傊?，由于T-SPOT.TB技術(shù)具有抗原的高特異度、試驗(yàn)方法學(xué)的高靈敏度等突出優(yōu)點(diǎn)，使其在檢測結(jié)核分枝桿菌感染及輔助結(jié)核病診斷方面具有很高的應(yīng)用價(jià)值。目前，世界各國的實(shí)驗(yàn)室及臨床科室都在大量應(yīng)用此項(xiàng)技術(shù)。

痰液或肺泡灌洗液涂片檢測是一項(xiàng)較為簡單的微生物形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)，操作簡便、快速、價(jià)格便宜和特異性強(qiáng)，一旦涂片陽性，即可確診為結(jié)核分枝桿菌感染。因此，目前仍是基層醫(yī)院作為初篩及診斷結(jié)核病的主要檢測手段，本次研究中痰液或肺泡灌洗液涂片抗酸染色的靈敏度為 17.25%，與文獻(xiàn)[14-15]報(bào)道的13.85%～22.90%相符；而與楊松等[16]報(bào)道的36.4%相差較大，這可能是由于本研究樣本量(516例)明顯高于文獻(xiàn)[16]報(bào)道的98例，以及標(biāo)本未正確留取等因素降低了陽性率。但此方法靈敏度太低，在本研究中位居4項(xiàng)檢查最末尾，對潛伏性結(jié)核的篩查意義不大。本次研究發(fā)現(xiàn)在516例肺結(jié)核患者中，有15例涂片陽性而培養(yǎng)為陰性，可能是由于標(biāo)本的運(yùn)送或不規(guī)范采集等造成結(jié)核分枝桿菌活力低下。因此，必須嚴(yán)格實(shí)行全面的質(zhì)量管理，按照標(biāo)準(zhǔn)操作手冊進(jìn)行操作，以提高其陽性檢出率。

利用BACTEC MGIT 960系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌快速生長培養(yǎng)檢測，該系統(tǒng)是集分枝桿菌快速生長培養(yǎng)、檢測及藥敏技術(shù)為一體的全自動分枝桿菌培養(yǎng)儀，通過連續(xù)檢測接種標(biāo)本的培養(yǎng)基所顯示的熒光強(qiáng)度的變化判斷是否有分枝桿菌生長[17-18]。本研究中結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)試驗(yàn)的靈敏度為45.74%，與馬俊等[19]報(bào)道的46.5%相近，但低于文獻(xiàn)[20]報(bào)道的70.05%，原因可能為本研究樣本量為516例明顯高于文獻(xiàn)[20]報(bào)道的180例。此外，操作不規(guī)范及破壞了細(xì)胞完整性等因素也可能降低其靈敏度。本研究還發(fā)現(xiàn)在516例肺結(jié)核患者中，有162例結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)陽性，而痰液或肺泡灌洗液涂片陰性，說明結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)的陽性檢測率明顯高于痰液或肺泡灌洗液涂片。結(jié)核分枝桿菌快速生長培養(yǎng)作為診斷結(jié)核分枝桿菌感染的金標(biāo)準(zhǔn)，是目前常用的結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)可對多種標(biāo)本進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)陽性即可通知臨床，因其有活菌，必要時(shí)可立即加做藥敏試驗(yàn)，可大大縮短報(bào)告時(shí)間[21]。但該方法也存在缺陷，如培養(yǎng)周期長，靈敏度低，不能排除潛伏期結(jié)核菌感染的影響，造成特異度也有所降低[22]。

結(jié)核分枝桿菌抗體IgM與IgG分別利用ELISA和膠體金法進(jìn)行檢測，兩者聯(lián)合檢測是一種簡便、快速的血清學(xué)檢測方法，且有較高的靈敏度。本研究中結(jié)核抗體IgM與IgG聯(lián)合檢測的靈敏度(72.87%)與相關(guān)研究報(bào)道的96.88%相差較大[23]，這可能與本研究樣本量(516例)明顯高于文獻(xiàn)報(bào)道的160例有關(guān)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)在516例肺結(jié)核患者中，有45例結(jié)核分枝桿菌抗體IgM與IgG聯(lián)合檢測陽性，而其余3種方法檢測陰性，說明結(jié)核分枝桿菌抗體IgM與IgG聯(lián)合檢測對T-SPOT.TB、結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)和痰液或肺泡灌洗液涂片檢測結(jié)核分枝桿菌感染陰性患者的診斷具有重要意義。因此，結(jié)核分枝桿菌抗體IgM與IgG聯(lián)合檢測可以減少漏診，做到早發(fā)現(xiàn)、早治療。

綜上所述，肺結(jié)核實(shí)驗(yàn)室快速診斷技術(shù)已經(jīng)取得了較大進(jìn)展，其中近幾年研發(fā)的T-SPOT.TB診斷肺結(jié)核的陽性率、靈敏度均較高，可見T-SPOT.TB在檢測結(jié)核分枝桿菌感染、輔助結(jié)核病診斷方面具有很高的應(yīng)用價(jià)值，值得臨床推廣。如今隨著醫(yī)療設(shè)施的不斷改進(jìn)，單一的檢測方法已不能滿足輔助臨床診斷肺結(jié)核的需要。因此，采用快速、簡便、靈敏度高的檢測方法對結(jié)核病的輔助診斷尤為重要，并且同時(shí)聯(lián)合運(yùn)用T-SPOT.TB、結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)試驗(yàn)、結(jié)核分枝桿菌抗體IgM與IgG聯(lián)合檢測和痰液或肺泡灌洗液涂片可大大提高診斷率，并滿足不同臨床需要，為結(jié)核病的臨床診斷與防治提供科學(xué)依據(jù)。

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The application value of four detection methods in clinical diagnosis of tuberculosis*

YuRong，HuFali，ShiGuomin，PengXuefeng，MaXiaohua，ShiYan，NieYing，ChenYongjun，WuJialing，XiangYangen

(DepartmentofClinicalLaboratory,ChangshaCentralHospital,Changsha,Hu′nan410006,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the clinical diagnostic value of four kinds of diagnostic methods,including pulmonary tuberculosis,including T-cell-based spot test for tuberculosis infection(T-SPOT.TB),rapid culture test for Mycobacterium tuberculosis,combined detection of IgM and IgG antibodies in tuberculosis and sputum or bronchoalveolar lavage fluid smear.MethodsA total of 516 cases of patients who were initially diagnosed with tuberculosis and without medication were collected from October 2014 to May 2015 in this hospital.T-SPOT.TB,rapid culture test for Mycobacterium tuberculosis,combined detection of IgM and IgG antibodies in tuberculosis and sputum or bronchoalveolar lavage fluid smear were performed in all patients.The sensitivity of these methods were calculated and compared.ResultsThe sensitivity of T-SPOT.TB(88.76%) was higher than that of rapid culture test for Mycobacterium tuberculosis(45.74%),combined detection of IgM and IgG antibodies in tuberculosis(72.87%) and sputum or bronchoalveolar lavage fluid smear(17.25%),all had statistically significant differences(P<0.01).ConclusionT-SPOT.TB might have significant application value for detecting Mycobacterium tuberculosis infection and assisting the diagnosis of tuberculosis.Meanwhile,combining with other detection methods could greatly improve the diagnostic rate and meet different clinical needs.

Key words:pulmonary tuberculosis；T-cell-based spot test for tuberculosis infection；tuberculosis antibody； rapid culture test for Mycobacterium tuberculosis；sputum or bronchoalveolar lavage fluid smear

基金項(xiàng)目：艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治科技重大專項(xiàng)資助項(xiàng)目(2013ZX10005004)。

作者簡介：喻容，男，主管檢驗(yàn)技師，主要從事臨床微生物學(xué)與檢驗(yàn)研究。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.05.002

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)05-0580-03

(收稿日期：2015-12-14)