張麗娜，王明義，楊小蕾，曹　源，張萍萍，胡成進(jìn)△

(1.遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州 121001；2.威海市立醫(yī)院，山東威海 264200；3.濟(jì)南博科生物

科技有限公司，山東濟(jì)南 250100；4.濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院，山東濟(jì)南 250031)

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·論著·

海洋創(chuàng)傷弧菌LAMP快速診斷方法的建立與評價*

張麗娜1，王明義2，楊小蕾3，曹源4，張萍萍1，胡成進(jìn)4△

(1.遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州 121001；2.威海市立醫(yī)院，山東威海 264200；3.濟(jì)南博科生物

科技有限公司，山東濟(jì)南 250100；4.濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院，山東濟(jì)南 250031)

摘要:目的利用環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(LAMP)技術(shù)，建立海洋創(chuàng)傷弧菌快速、簡便、特異且敏感的檢測方法，并對該方法的特異性和靈敏度進(jìn)行評價。方法選取海洋創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素(vvhA)基因作為靶基因，根據(jù)GenBank公布的序列設(shè)計4條LAMP引物；對47株細(xì)菌(包括20株弧菌屬細(xì)菌)進(jìn)行LAMP和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增，并做特異性比較；對創(chuàng)傷弧菌M06株增菌液10倍倍比稀釋，提取DNA后進(jìn)行靈敏度的檢測，并與常規(guī)PCR作比較；構(gòu)建含vvhA基因片段的重組質(zhì)粒，作為LAMP反應(yīng)體系的標(biāo)準(zhǔn)陽性對照。結(jié)果常規(guī)PCR實驗出現(xiàn)假陽性結(jié)果，而LAMP實驗只有海洋創(chuàng)傷弧菌出現(xiàn)陽性擴(kuò)增，其他樣品均為陰性，無假陽性和假陰性結(jié)果，表明引物的特異性較好，加入鈣黃綠素和電泳結(jié)果相一致；針對vvhA基因建立的LAMP技術(shù)其最低檢測下限為每個反應(yīng)4×10 CFU，是常規(guī)PCR(每個反應(yīng)4×102CFU)的10倍，呈現(xiàn)較好的靈敏度。重復(fù)實驗過程兩遍，PCR和LAMP技術(shù)檢測結(jié)果穩(wěn)定。結(jié)論建立了一種用于檢測海洋創(chuàng)傷弧菌的LAMP檢測方法，該方法特異性強(qiáng)，靈敏度高，方便快捷，特別適合用于現(xiàn)場和床旁的快速檢測。

關(guān)鍵詞:海洋；創(chuàng)傷弧菌；環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增；快速診斷；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

海洋創(chuàng)傷弧菌是一種分布于亞熱帶淺海水域及海產(chǎn)品中的革蘭陰性弧菌，該菌的生長繁殖環(huán)境不同于陸地菌種，具有高鹽、高鈉、低溫、乏氧、寡營養(yǎng)的特點，人主要通過生食生蠔等海產(chǎn)品感染，從而導(dǎo)致胃腸炎等消化系統(tǒng)疾病[1]，或者經(jīng)海水浸泡感染傷口致蜂窩性組織炎或菌血癥等，此類感染進(jìn)展迅速，病死率高達(dá)50%[2]，尤其對肝功能低下的患者易感。海洋創(chuàng)傷弧菌因其生長繁殖的特殊性，未引起實驗室的足夠重視，且缺乏專業(yè)培養(yǎng)基對其進(jìn)行鑒定，使得感染后存在鑒定困難。傳統(tǒng)的鑒定方法主要是分離培養(yǎng)和生化鑒定，這類方法繁瑣、費時、費力，并且存在易受人為和試劑的影響或需要昂貴的微生物鑒定系統(tǒng)的缺陷[3]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)為代表的病原菌核酸快速檢測技術(shù)得到了廣泛應(yīng)用，但它們都需要昂貴的特殊儀器、試劑和專業(yè)技術(shù)人員，檢測成本較高，不適合基層及現(xiàn)場的快速檢測[4]。2000年日本學(xué)者Notomi等[5]發(fā)明了一種新型的基因診斷技術(shù)，即環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(LAMP)技術(shù)。該技術(shù)是在鏈置換型DNA聚合酶的作用下，利用特別設(shè)計的4段引物來識別靶基因的6個區(qū)域，恒溫條件下(60～65 ℃)1 h內(nèi)就可以對目的基因進(jìn)行高效、特異的復(fù)制[6-9]。此外，該技術(shù)無需購置昂貴的PCR分析儀，操作簡單，可用于現(xiàn)場的快速檢測，近年來已得到廣泛應(yīng)用。本研究針對海洋創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素(vvhA)基因設(shè)計了4條引物，建立快速診斷海洋創(chuàng)傷弧菌的LAMP技術(shù)，可視化判斷結(jié)果，并對該方法進(jìn)行了應(yīng)用評價。

1材料與方法

1.1菌株來源本實驗所用的菌株共47株，其中海洋創(chuàng)傷弧菌(M06)為韓國首爾大學(xué)食品生物技術(shù)與毒理營養(yǎng)研究所Sang Ho Choi惠贈，其余弧菌屬細(xì)菌來源于中國海洋微生物菌種保藏管理中心(青島)，其他菌株均為濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院臨床分離保存菌株。

1.2儀器與試劑恒溫金屬浴(濟(jì)南博科生物科技有限公司)，低溫高速離心機(jī)Centrifuge 5430R(德國Eppendorf公司)，熒光凝膠成像分析系統(tǒng)(美國UVP公司)，TC-XR型基因擴(kuò)增儀(日本BIOER公司)。Bst DNA聚合酶(8 U/μL)購于New England Biolabs公司，三磷酸脫氧核苷酸(dNTP，10 mol/L)和DNA標(biāo)記物均購于大連寶生物工程有限公司，鈣黃綠素購于北京藍(lán)譜科技有限公司，所有試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.3方法

1.3.1細(xì)菌培養(yǎng)及DNA模板的制備按常規(guī)操作規(guī)程采用三區(qū)劃線法取弧菌屬細(xì)菌接種于2216E平板，培養(yǎng)溫度為28 ℃。非弧菌屬細(xì)菌接種于血平板，培養(yǎng)溫度為37 ℃，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。采用煮沸法提取細(xì)菌DNA：取50 μL雙蒸水(ddH2O)于1.5 mL EP管中，調(diào)菌液至1～2個濁度，震蕩15 s，煮沸10 min后立即冰浴3 min，13 000 r/min離心5 min，取上清作為DNA模板，-20 ℃保存?zhèn)溆?。革蘭陽性菌則需要加入溶菌酶后煮沸提取。

1.3.2LAMP引物的設(shè)計與合成根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中收集的vvhA基因序列進(jìn)行LAMP引物設(shè)計(http://primerexplorer.jp/e/)，篩選出一套最佳引物(2對)，其中兩條外引物為F3、B3，內(nèi)引物為FIP、BIP(引物序列見專利申請內(nèi)容)，設(shè)計好的引物交由Invitrogen公司合成。

1.3.3LAMP反應(yīng)體系總體積25 μL，具體組分包括：10×緩沖液、dNTP、引物、甜菜堿、硫酸鎂(MgSO4)、Bst酶、鈣黃綠素、DNA模板等(專利申請內(nèi)容)，輕微混勻瞬時離心后加入20 μL滅菌液體石蠟密封，置于恒溫金屬浴中，反應(yīng)條件設(shè)置為63 ℃，1 h；85 ℃，5 min終止反應(yīng)。

1.3.4vvhA基因的克隆和陽性對照的建立用LAMP實驗的兩條外引物F3/B3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系(25 μL)：模板2 μL、Premix Taq 12.5 μL、F3/B3(5 μmol/L)各1 μL、ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 8 min，94 ℃ 40 s，62 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，72 ℃ 8 min；共30個循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物于2%的瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果，將217 bp的擴(kuò)增目的片段切膠回收后，與PMD18-T載體連接，16 ℃ 2 h后4 ℃冰箱過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜后挑取單克隆菌落搖菌后經(jīng)PCR驗證送測序，測序成功后提取質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)陽性對照。

1.3.5LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的判斷(1)肉眼判讀結(jié)果：反應(yīng)結(jié)束后肉眼觀察結(jié)果，反應(yīng)液由橙色變?yōu)榫G色則判為陽性，保持橙色則判為陰性。(2)瓊脂糖凝膠電泳：6 μL擴(kuò)增產(chǎn)物與1 μL上樣緩沖液混勻點樣于含0.1 μL/mL GoldviewⅠ型核酸染料的2%瓊脂糖凝膠中，100 V電泳25 min，電泳顯示LAMP特征性梯狀條帶則判為陽性，否則判為陰性。

1.3.6PCR和LAMP法檢測創(chuàng)傷弧菌的特異性分析將4株海洋創(chuàng)傷弧菌、3株副溶血弧菌、3株哈維弧菌、3株美人魚弧菌、3株查格斯弧菌、2株海洋溶藻弧菌、1株費氏弧菌、1株弗氏弧菌，臨床分離的大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、銅綠假單胞菌、不動桿菌、嗜麥芽假單胞菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腸球菌各3株用上述反應(yīng)體系進(jìn)行LAMP和常規(guī)PCR檢測。

1.3.7PCR和LAMP法檢測海洋創(chuàng)傷弧菌的靈敏度將海洋創(chuàng)傷弧菌M06株增菌液培養(yǎng)過夜后，進(jìn)行10倍系列倍比稀釋，從101～109稀釋液中各吸取20 μL至無菌平皿中，傾注冷卻的2216E液體培養(yǎng)基后混勻，每個稀釋度做兩個平行，37 ℃培養(yǎng)48 h計數(shù)菌落數(shù)。吸取各濃度稀釋液1 mL，提取DNA后用上述擴(kuò)增條件同時進(jìn)行LAMP和PCR檢測。

2結(jié)果

2.1vvhA基因的克隆和陽性對照的建立用F3/B3作為引物，普通PCR擴(kuò)增，電泳顯示條帶與目的條帶大小一致(217 bp)，見圖1。將此條帶切膠回收成功與PMD18-T載體連接，并轉(zhuǎn)入大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)PCR驗證后測序結(jié)果顯示已成功構(gòu)建含vvhA目的片段的重組質(zhì)粒，可以作為LAMP實驗的標(biāo)準(zhǔn)陽性對照。

M：DNA分子量標(biāo)記物DL2000;T:vvhA基因片斷陽性擴(kuò)增。

圖1PCR vvhA電泳結(jié)果

2.2PCR和LAMP法檢測海洋創(chuàng)傷弧菌的特異性分析以vvhA基因重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)陽性對照，ddH2O為陰性對照，PCR和LAMP技術(shù)檢測上述菌株。結(jié)果顯示，常規(guī)PCR除4株海洋創(chuàng)傷弧菌出現(xiàn)陽性外，1株副溶血弧菌、1株海洋溶藻弧菌也出現(xiàn)陽性；而LAMP實驗只有海洋創(chuàng)傷弧菌出現(xiàn)陽性擴(kuò)增，其他樣品均為陰性，無假陽性和假陰性結(jié)果，表明引物的特異性較好，加入鈣黃綠素和電泳結(jié)果相一致。見表1。

2.3PCR和LAMP法檢測海洋創(chuàng)傷弧菌的靈敏度分析海洋創(chuàng)傷弧菌MO6培養(yǎng)物進(jìn)行傾注平板計數(shù)，已測定的初始菌液濃度為2×108CFU/mL，10倍倍比稀釋的菌液濃度分別為2×107、2×106、2×105、2×104、2×103、2×102、2×101CFU/mL。所對應(yīng)反應(yīng)體系中的濃度為每個反應(yīng)4×104、4×103、4×102、4×101、4×100、4×10-1、4×10-2CFU。對不同稀釋度的模板DNA進(jìn)行常規(guī)PCR(F3/B3作引物)和LAMP實驗，發(fā)現(xiàn)針對vvhA基因設(shè)計的引物最低檢測下限為每個反應(yīng)4×10 CFU，是常規(guī)PCR(每個反應(yīng)4×102CFU)的10倍，呈現(xiàn)較好的靈敏度。兩種實驗方法檢測海洋創(chuàng)傷弧菌的靈敏度分析結(jié)果見圖2，LAMP檢測海洋創(chuàng)傷弧菌靈敏度顯色分析見圖3(見《國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁“論文附件”)。重復(fù)實驗過程兩遍，PCR和LAMP法檢測結(jié)果穩(wěn)定。

A：LAMP實驗；B：常規(guī)PCR；M：DNA分子量標(biāo)記物DL2000；1：濃度為每個反應(yīng)4×104CFU；2：濃度為每個反應(yīng)4×103CFU；3：濃度為每個反應(yīng)4×102CFU；4：濃度為每個反應(yīng)4×10 CFU；5：濃度為每個反應(yīng)4×100CFU；6：濃度為每個反應(yīng)4×10-1CFU；7：濃度為每個反應(yīng)4×10-2CFU；8：陰性對照；9：陽性對照。

圖2兩種實驗方法檢測創(chuàng)傷弧菌的靈敏度分析

3討論

隨著海洋作業(yè)活動的日益頻繁，海洋致病菌感染性疾病的發(fā)生逐年增加，但是由于海洋致病菌自身生長特點使其在臨床實驗室常規(guī)培養(yǎng)條件下難以生長，導(dǎo)致不能正確檢出而漏診，對此應(yīng)引起醫(yī)學(xué)實驗室的高度重視。在海洋致病菌中創(chuàng)傷弧菌致病力最強(qiáng)，感染后常導(dǎo)致菌血癥及器官衰竭[10-12]。本研究采用LAMP技術(shù)建立了一種快速檢測海洋創(chuàng)傷弧菌感染的方法。構(gòu)建了重組質(zhì)粒作為檢測體系的陽性對照，并對此方法進(jìn)行了特異性和靈敏度的評價。

本研究的核心技術(shù)在于引物的設(shè)計，需要考慮以下幾個方面。(1)熔解溫度(Tm)值： F1c/B1c引物區(qū)的Tm值控制在64～66 ℃，F(xiàn)2/B2、F3/B3則控制在59～61 ℃，LF/LB引物的Tm值約為60 ℃。(2)引物末端的穩(wěn)定性：引物作為DNA合成的起點，其末端必須要有一定的穩(wěn)定性，⊿G為吉布斯自由能變，該值越小，引物越容易與模板退火結(jié)合。設(shè)計原則為F3/B3、F2/B2、LF/LB的3′端⊿G值小于或等于-4 kcal/mol，F(xiàn)1c/B1c的5′端⊿G值小于或等于-4 kcal/mol。(3)GC百分含量：引物的GC百分含量在40%～65%。(4)引物之間的距離：F2與B2之間的距離(LAMP的擴(kuò)增區(qū)域)為0～60 bp，F(xiàn)2與F3之間的距離為0～60 bp，而F2的5′端與F1的5′端的距離(環(huán)引物的區(qū)域)為40～60 bp[13]。

常規(guī)PCR需要配套控溫精密的儀器和復(fù)雜的實驗程序，檢測成本高[14]。而本研究所用的LAMP技術(shù)無需PCR儀，僅使用一臺恒溫金屬浴即可，操作簡單，并且本實驗使用47株細(xì)菌檢測該方法的特異性，結(jié)果顯示只有海洋創(chuàng)傷弧菌出現(xiàn)陽性擴(kuò)增，其他樣品均為陰性，無假陽性和假陰性結(jié)果，且該方法特異性明顯高于常規(guī)PCR。另外，LAMP檢測海洋創(chuàng)傷弧菌的最低檢測限度達(dá)到每個反應(yīng)40 CFU，靈敏度是常規(guī)PCR的10倍。

LAMP檢測結(jié)果判讀有濁度分析、電泳分析、染料比色分析等多種方式[15]。但是觀察濁度具有主觀性及靈敏度低等缺點，而通過電泳分析或者在反應(yīng)完成后添加SYBR GreenⅠ熒光染料來判斷反應(yīng)結(jié)果都使反應(yīng)產(chǎn)物暴露于空氣中，極易造成假陽性，而反應(yīng)擴(kuò)增之前加入SYBR GreenⅠ會抑制LAMP反應(yīng)的進(jìn)行[16]。本研究中使用的鈣黃綠素檢測，將整個反應(yīng)和檢測融合為一個過程，而且反應(yīng)完成后不開蓋，很好地杜絕了污染，有效防止了假陽性[17]。

綜上所述，LAMP技術(shù)快速檢測海洋創(chuàng)傷弧菌用時少、操作簡單、特異性強(qiáng)、靈敏度高，且結(jié)果判讀簡單。在63 ℃條件下擴(kuò)增1 h，便可根據(jù)顏色變化用肉眼來判定是否存在海洋創(chuàng)傷弧菌。近年來有報道顯示，聚乙二醇可以加速LAMP反應(yīng)的進(jìn)行[18]，相信采用LAMP技術(shù)檢測海洋創(chuàng)傷弧菌的方法將會逐漸完善并應(yīng)用于臨床。筆者下一步研究將著重優(yōu)化反應(yīng)體系，提高引物純度，進(jìn)一步提高反應(yīng)的靈敏度，縮短反應(yīng)時間，為該方法在臨床的推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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Establishment and evaluation of loop-mediated isothermal amplification assay for detecting marine Vibrio vulnificus*

ZhangLina1，WangMingyi2，YangXiaolei3，CaoYuan4，ZhangPingping1,HuChengjin4△

(1.LiaoningMedicalUniversity,Jinzhou,Liaoning121001,China；2.WeihaiMunicipalHospital,

Weihai,Shandong264200,China；3.Ji′nanBiobaseBiotechCo.,Ltd,Ji′nan,Shandong250100,China；

4.GeneralHospitalofJi′nanMilitaryRegionofPLA,Ji′nan,Shandong250031,China)

Abstract:ObjectiveTo develop a rapid,convenient,sensitive and specific method for the detection of marine Vbrio vulnificus by using loop-mediated isothermal amplification(LAMP) technique,and evaluate the specificity and sensitivity of this method.MethodsAccording to marine Vibrio vulnificus cytolysin(vvhA) gene sequence published by GenBank,a set of LAMP primers were designed.LAMP and polymerase chain reaction(PCR) amplification were carried out in 47 strains of bacteria(including 20 strains of Vibrio) and specificities of LAMP and PCR were compared.Serial ten-fold dilutions of an overnight Vibrio vulnificus M06 culture were prepared in sterile saline solution,and compared the sensitivity of LAMP with that of PCR after extracting DNA templates.A recombinant plasmid containing fragment of vvhA gene was constructed and set as a standard positive control of LAMP assay.ResultsFalse-positive results occurred in the conventional PCR,while in the LAMP assay positive amplifications were only seen in strains of Vibrio vulnificus and no false-positive or false-negative results were generated among 47 strains of bacteria,which indicated that primers had high specificity.Additionally,the results of electrophoresis were consistent with those after adding the calcein.The detection limit of LAMP was 4×10 CFU each reaction for detecting vvhA gene in pure culture,which was 10-fold more sensitive than that of conventional PCR(4×102CFU each reaction).It indicated that LAMP assay had good sensitivity.Repeated the test twice,the detection results of LAMP and PCR were both stable.ConclusionAn LAMP detection method for marine Vibrio vulnificus has been developed,which is highly specific,sensitive,convenient and suitable for rapid field detection and point-of-care testing.

Key words:marine；Vibrio vulnificus；loop-mediated isothermal amplification；rapid diagnosis；polymerase chain reaction

基金項目：全軍“十二五”科研重點項目(BWS12J014)。

作者簡介：張麗娜，女，檢驗技師，主要從事分子生物學(xué)研究。 △通訊作者，E-mail：hcj6289@163.com。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.05.001

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)05-0577-04

(收稿日期：2015-10-10)