公 華

（甘肅省張掖市高臺縣畜牧獸醫(yī)局，甘肅 高臺 734300）

牛奶中鹽酸環(huán)丙沙星的殘留檢測

公 華

（甘肅省張掖市高臺縣畜牧獸醫(yī)局，甘肅 高臺 734300）

采用高效液相色譜——紫外吸收檢測法對牛奶中鹽酸環(huán)丙沙星殘留進行檢測，試驗樣品經(jīng)磷酸鹽緩沖溶液處理以后，用固相萃取小柱濃縮、凈化，回收液過0.45 μm濾膜后進樣檢測；流動相：乙腈（25%）+磷酸溶液（75%），流速：1.0 mL/min，柱溫：400 C，檢測波長：277 nm。結果表明鹽酸環(huán)丙沙星在0.005～5.0 μg/mL的范圍內(nèi)與檢測峰面積呈良好的線性關系，回收率90%～96%，樣品殘留檢出率為62.5%。

牛奶；鹽酸環(huán)丙沙星；殘留；HPLC

1 研究的目的和意義

隨著畜牧養(yǎng)殖的規(guī)?；?、集約化，造成了抗生素的大量使用，其中鹽酸環(huán)丙沙星應用最廣泛，因為它具有抗菌范圍廣、抗菌活性強的特點。該藥還具有容易滲入組織、毒副作用小，適用于多種細菌所致感染性疾病的治療。但由于有些不遵守休藥期和動物個體代謝差異、濫用藥等行為，導致了動物性食品中藥物殘留，進而危害人類健康；尤其以肉類、蛋類及乳品類的藥物殘留是導致人類健康受到影響最為嚴重的問題。

高效液相色譜法（HPLC）是目前殘留檢測運用最多的方法，因為其靈敏度高，方便檢測，同時能對獸藥殘留進行定性和定量分析，是氟喹諾酮類藥物多組分殘留確證檢測的最佳方法之一。

2 試驗材料與方法

2.1 試驗時間

2012年10月至2013年10月。

2.2 試驗地點

高臺縣農(nóng)產(chǎn)品安全質量檢測中心實驗室。

2.3 試驗材料

2.3.1 儀器

高效液相色譜儀：配紫外吸收檢測器；電子天平：精度0.000 1 g；超純水器；pH計；超聲清洗器；SPE C18固相萃取小柱；0.45 μ m微孔濾膜；真空抽濾裝置；冷藏冰箱；振蕩器；分子移液器：20 μ l、200 μ l、1 000 μ l、2 000 μ l； 移 液 管：1 mL、2 mL、10 mL；容量瓶：10 mL、100 mL、500 mL、1 000 mL。

2.3.2 試劑

2.3.2.1 標準品

鹽酸環(huán)丙沙星對照品 批號：H0100803；含量：100%；中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

2.3.2.2 試劑

乙腈（色譜純）；甲醇（色譜純）；冰乙酸（色譜純）；磷酸（優(yōu)級純）；磷酸二氫鉀（分析純）；氫氧化鈉（分析純）；三乙胺（分析純）。

2.3.3 材料

牛奶：采集四個奶牛場12個鮮奶樣品，以及四種市售商品奶（蒙牛、伊利、莊園、雪頓）袋裝純牛奶樣品。

四個牛場奶?？倲?shù)107頭，其中泌乳奶牛68頭。樣品在2～8 ℃冷藏條件下保存。

2.4 試驗內(nèi)容

2.4.1 樣品前處理

取混勻奶樣2 mL轉入50 mL燒杯中，加入10 mL磷酸鹽緩沖溶液，搖勻后超聲10 min；過經(jīng)5 mL甲醇和5 ml超純水活化處理過的固相萃取小柱，再用5 mL超純水淋洗，用6 mL 4%氨水-甲醇溶液洗脫，收集洗脫液；在50±1 ℃水浴條件下氮氣吹干，轉移定容至1 mL離心管中，過0.45 μ m濾膜，待檢。

2.4.2 溶液配備

0.025 mol/L磷酸溶液：取85%的磷酸1.71 mL，加水稀釋至1 000 mL，搖勻，用三乙胺調節(jié)pH至3.0，即得。

5.0 mol/L氫氧化鈉溶液：稱取氫氧化鈉20 g，加水稀釋至100 mL，即得。

0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液：取磷酸二氫鉀6.8 g，加水溶解并稀釋至500 mL，用5.0 mol/L氫氧化鈉溶液調節(jié)pH值為7.0，即得。

4%氨水-甲醇溶液：準確量取4 mL氨水于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得。

流動相：磷酸+乙腈（75：25），準確量取75 mL 0.025 mol/L磷酸溶液于100 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，即得。

3 試驗結果

結果表明鹽酸環(huán)丙沙星在0.005～5.0 μ g/mL的范圍內(nèi)，最低檢出限為0.005 μ g/mL，線性方程式Y= 156.36X+3.006 4

相關系數(shù)R >0.999

3.1 回收率和精密度

分別在6份空白樣品中加入一定量的鹽酸環(huán)丙沙星標準使用液，使其濃度分別為0.1、0.5、1.0μ g/mL各2份，回收率在90%～96%之間，相對標準偏差為4.8%～6.4%。

3.2 樣品檢測結果

16個牛奶樣品經(jīng)檢測，每個樣品重復測定3次，按峰面積計算樣品實際殘留量，樣品實際含量計算公式為：C=X×V1/V2

C-樣品的實際含量，μ g/mL；

X-從標準曲線中得到的濃度，μ g/mL；

V1-定容體積，mL；

V2-取樣體積，mL；

其中10個樣品峰面積大于最低檢出限，樣品檢出率為62.5%。其中最小檢出值為0.046 μ g/mL，最大檢出值為0.494 μ g/mL。

4 討論

4.1 標準品的溶解

對于鹽酸環(huán)丙沙星標準貯備液（1.0 mg/mL）的制備，葉鹿鳴[1]、陳曉紅等以少量甲醇溶解后，并用甲醇定容至刻度；董志遠等用0.03 mol/L氫氧化鈉溶液溶解并稀釋成1 mg/mL的標準儲備液；本試驗中在制備標準溶液時鹽酸環(huán)丙沙星在甲醇中溶解性較差，多次試驗比較發(fā)現(xiàn)用流動相溶解效果較好，即磷酸+乙腈（75∶25）。

4.2 流動相的選擇與優(yōu)化

中華人民共和國國家標準《動物源性食品中14種氟喹諾酮藥物殘留檢測方法液相色譜-質譜/質譜法》[2]中：流動相為0.05 mo1/L磷酸緩沖液—乙腈（82∶18）；葉鹿鳴等[1]以甲醇+乙腈+0.2%甲酸（15+15+70）為流動相。在試驗中，進行流動相選擇時，發(fā)現(xiàn)用磷酸緩沖系：甲醇時，出峰左右不對稱，試用磷酸：乙腈時，出峰情況最優(yōu)。同時在系數(shù)比選擇中，分別進行了磷酸緩沖系∶甲醇=80∶20、75∶25、65∶35、60∶40的試驗，發(fā)現(xiàn)出峰情況在75∶25時最優(yōu)。

5 結論

本試驗以高效液相色譜—紫外吸收檢測法對牛奶中鹽酸環(huán)丙沙星殘留進行檢測，流動相：乙腈（25%）+磷酸溶液（75%），流速：1.0 m L/m in，柱溫：40 ℃，檢測波長：277 nm。結果表明鹽酸環(huán)丙沙星在0.005～5.0 μ g/mL的范圍內(nèi)與檢測峰面積呈良好的線性關系，回收率在90%～96%之間。

本次共檢測8個牛奶樣品，樣品殘留檢出率為62.5%，且商品袋裝牛奶中鹽酸環(huán)丙沙星的殘留量明顯低于奶牛場采樣鮮奶。

[1]葉鹿鳴，謝東華；高效液相色譜熒光檢測法測定牛奶中3種氟喹諾酮殘留研究[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2008.5，18，（5）：804-806.

[2]動物性食品中氟喹諾酮類藥物殘留檢測—高效液相色譜法[S].農(nóng)業(yè)部1025號公告，2008.

（編輯：晏兵兵）

TS252.7

B

1006-799X(2016)18-0103-02

公 華（1988-），男，甘肅高臺人，助理獸醫(yī)師；從事動物疫病防控工作。