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        基于線粒體COⅠ基因序列的DNA條形碼在中國南海緋鯉屬魚類鑒定中的應(yīng)用

        2016-03-09 09:13:38宮亞運呂金磊楊喜書
        海洋漁業(yè) 2016年2期
        關(guān)鍵詞:黑斑種間條形碼

        宮亞運,章 群,曹 艷,呂金磊,楊喜書

        (暨南大學(xué)水生生物研究中心,廣州 510632)

        基于線粒體COⅠ基因序列的DNA條形碼在中國南海緋鯉屬魚類鑒定中的應(yīng)用

        宮亞運,章 群,曹 艷,呂金磊,楊喜書

        (暨南大學(xué)水生生物研究中心,廣州 510632)

        為探討COⅠ基因作為DNA條形碼對緋鯉屬(Upeneus)魚類鑒定的有效性,明確物種的分類地位,通過COⅠ基因5'端652 bp序列研究中國南海緋鯉屬的黑斑緋鯉(Upeneus tragula)、馬六甲緋鯉(Upeneus moluccensis)、縱帶緋鯉(Upeneus subvittatus)、黃帶緋鯉(Upeneus sulphureus)、呂宋緋鯉(Upeneus luzonius)以及條尾緋鯉(Upeneus bensasi)6個種56 ind標(biāo)本的標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼序列的種內(nèi)種間遺傳距離,并構(gòu)建分子系統(tǒng)樹。研究表明:所測樣品的堿基組成為T:29.2%,C:29.6%,A:21.4%,G:19.8%,A+T含量(50.6%)略高于G+C含量(49.4%),轉(zhuǎn)換/顛換率為3.08。6種緋鯉屬魚類組成5個自展支持率為100%的分支,其中黑斑緋鯉和馬六甲緋鯉混雜分布于同一分支上,其余4種緋鯉獨自成支;分支間平均遺傳距離10.10%(8.60%~12.40%),是分支內(nèi)平均遺傳距離0.18%(0.00%~0.30%)的56倍。縱帶緋鯉、黃帶緋鯉、呂宋緋鯉、條尾緋鯉種間平均遺傳距離為10.70%(8.80%~12.40%),約為這4個種種內(nèi)平均遺傳距離0.125%(0.00%~0.20%)的85倍,種間遺傳距離大于種內(nèi)遺傳距離的10倍以上,確定了它們的物種有效性。黑斑緋鯉和馬六甲緋鯉種內(nèi)遺傳距離分別為0.40%和0.20%,與其它4種緋鯉為同一水平;但種間遺傳距離僅為0.30%,屬于一般物種的種內(nèi)遺傳距離范圍,因此推測二者或為同一物種,但還需從形態(tài)學(xué)和基因組序列分析等方面加以進(jìn)一步確證,其是否受到種間雜交和近期輻射進(jìn)化的影響也需要今后更多的研究。標(biāo)準(zhǔn)的DNA條形碼雖然能夠有效地區(qū)分中國南海緋鯉屬魚類中的縱帶緋鯉、黃帶緋鯉、呂宋緋鯉和條尾緋鯉,但DNA條形碼對黑斑緋鯉和馬六甲緋鯉的鑒定與形態(tài)學(xué)的鑒定結(jié)果不一致,表明在物種鑒定時,母系遺傳的線粒體COⅠ基因有時需要結(jié)合其它核基因分子標(biāo)記或生態(tài)調(diào)查資料加以輔助。

        緋鯉屬;DNA條形碼;COⅠ基因;中國南海

        準(zhǔn)確的物種鑒定是開展生理生態(tài)研究和資源開發(fā)利用的前提與基礎(chǔ)。傳統(tǒng)的魚類分類主要依據(jù)外部形態(tài)特征,并結(jié)合比較解剖學(xué)特性和生態(tài)習(xí)性來確定,雖能區(qū)分大部分魚類,但通常比較依賴鑒定者的個人經(jīng)驗,且很多魚類的條紋、斑點、體色等外部形態(tài)易受外界環(huán)境及發(fā)育階段的影響而產(chǎn)生變化,鑒定時常會出現(xiàn)爭議和錯誤。為此HEBERT等[1-2]提出了DNA條形碼(DNA barcoding)的概念,即通過分析一個標(biāo)準(zhǔn)的目標(biāo)基因的DNA序列對物種進(jìn)行鑒定,對動物界除刺胞動物門外的所有11個門13 320個物種的研究表明,線粒體 COⅠ基因(細(xì)胞色素氧化酶亞基I)靠近5′端的一段序列能夠有效鑒定動物界物種,其序列間的差異能夠很好地鑒別所研究的物種。隨著HEBERT等[3]和WARD等[4]分別在北美260種鳥類和澳大利亞207種魚類中分子鑒定的成功,COⅠ基因5′端約652 bp的序列憑借其快速簡單高效的特點,已成為動物界物種鑒定的首選DNA條形碼,目前已經(jīng)成功應(yīng)用于鰈形目、鯉形目及裸胸鱔屬等魚類的物種鑒定中[5-7],在植物、微生物以及生物多樣性調(diào)查和保護(hù)等領(lǐng)域也發(fā)揮著重要作用[8]。

        緋鯉屬(Upeneus)魚類隸屬輻鰭魚綱(Actinopterygii)鱸形目(Perciformes)羊魚科(Mullidae)[9],廣泛分布于印度洋、太平洋等溫?zé)岷^(qū)沿岸淺海區(qū)域[10]。羊魚科魚類的突出特點是它們頦部具有一對長須,有兩個獨立的背鰭;其中緋鯉屬的典型特征是犁骨和顎骨上有絨毛狀齒[9]。據(jù)報道,目前世界范圍內(nèi)分布的緋鯉屬魚類共有30種[11],中國分布有其中的8種[10],其中南海分布有黑斑緋鯉(Upeneus tragula)、馬六甲緋鯉(Upeneus moluccensis)、縱帶緋鯉(Upeneus subvittatus)、黃帶緋鯉(Upeneus sulphureus)、呂宋緋鯉(Upeneus luzonius)、條尾緋鯉(Upeneus bensasi)6種[9]。緋鯉屬魚類肉質(zhì)鮮美,是海洋漁業(yè)的重點捕撈對象[12],具有重要的經(jīng)濟(jì)價值[9];由于目前南海魚類資源多數(shù)呈現(xiàn)逐年衰退的局面[13],為避免緋鯉屬魚類資源的衰竭,有必要對其現(xiàn)有的漁業(yè)資源進(jìn)行合理的保護(hù)和開發(fā)利用,而物種的準(zhǔn)確鑒定是開展其后續(xù)保護(hù)和開發(fā)利用研究的基礎(chǔ)。傳統(tǒng)的緋鯉屬魚類分類方法主要依據(jù)體色和斑紋等,但緋鯉屬魚類被薄櫛鱗,鱗片極易脫落[9],其外部形態(tài)易受到破壞;同時,由于生境和發(fā)育階段的不同,不同個體的色彩斑紋差異也較大[10],這就給緋鯉屬的分類鑒定帶來了很大困難;此外,不同鑒定者鑒定往往會有不同的結(jié)果,有時會出現(xiàn)同物異名等情況[10,14]。而DNA條形碼技術(shù)采用分子手段對物種進(jìn)行鑒定,不依賴個體形態(tài)特征,不受個體發(fā)育階段的影響,并能發(fā)掘潛在的隱存種等,擁有許多傳統(tǒng)鑒定方法無可比擬的優(yōu)勢,其在很多物種鑒定中的準(zhǔn)確性和有效性也已被廣泛證實。目前,國內(nèi)外對緋鯉屬魚類的研究多集中在對其形態(tài)指標(biāo)、生態(tài)學(xué)方面以及資源狀況的研究等[15-17];分子方面除LAKRA等[18]對印度洋海洋魚類的DNA條形碼研究中涉及到的緋鯉屬中斑尾緋鯉(Upeneus vittatus)3 ind和黃帶緋鯉4 ind外,未見用DNA條形碼技術(shù)對中國南海緋鯉屬魚類進(jìn)行研究的報道。本研究采用DNA條形碼技術(shù)對中國南海緋鯉屬魚類進(jìn)行鑒定,探究COⅠ基因序列作為區(qū)分南海緋鯉屬魚類物種的有效性,以期明確中國南海緋鯉屬魚類的分類地位,并探尋可能存在的隱存種,為其種質(zhì)資源的保護(hù)和開發(fā)利用提供參考資料,同時也為緋鯉屬魚類DNA條形碼數(shù)據(jù)庫進(jìn)行補(bǔ)充。

        1 材料與方法

        根據(jù)《南海魚類志》[9]對采自11個地點共56 ind在95%乙醇中保存良好的標(biāo)本進(jìn)行鑒定,共得到6個種,其中黑斑緋鯉16 ind、馬六甲緋鯉6 ind、縱帶緋鯉8 ind、黃帶緋鯉12 ind、呂宋緋鯉4 ind、條尾緋鯉10 ind。樣品具體采樣地點和種類見表1。

        取背部肌肉晾干后提取總DNA,提取方法參考高鹽法[19]。設(shè)計PCR引物:CX1F2:5′-ACCTGTGGCAATCACACGCTGAT,TestCXR1a:5′-ATGTGRTTGGCTTGAAAC。PCR后,將經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶清晰的PCR產(chǎn)物送至北京六合華大基因有限公司,切膠純化后在ABI-3730自動測序儀上進(jìn)行測序。測定的序列通過MEGA 6.0[20]軟件進(jìn)行人工校對,計算堿基組成、變異位點、轉(zhuǎn)換與顛換的比值以及基于Kimura 2-parameter(K2P)模型的種內(nèi)和種間遺傳距離,構(gòu)建鄰接樹,經(jīng)1 000次重復(fù)抽樣(bootstraps)檢測分支置信度。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 COⅠ基因片段序列特征

        在擴(kuò)增到的652 bp線粒體COⅠ基因5′端序列中,沒有出現(xiàn)堿基插入和缺失,其中多態(tài)位點132個,簡約信息位點121個。T、C、A、G平均含量分別是29.2%、29.6%、21.4%、19.8%,A+T含量(50.6%)略高于C+G含量(49.4%),與其它硬骨魚類線粒體COⅠ基因堿基組成的基本特征一致[4]。轉(zhuǎn)換與顛換比(R)為3.08,表明COⅠ基因序列的突變未達(dá)到飽和,適合遺傳分析[21]。

        2.2 鄰接樹和種內(nèi)種間K2P遺傳距離

        在鄰接樹上,6種緋鯉屬魚類組成了5個支持率為100%的支系,分支內(nèi)與分支間平均遺傳距離分別為0.18%(0.00%~0.30%)、10.10%(8.60%~12.40%),分支間平均遺傳距離是分支內(nèi)平均遺傳距離的56倍;其中分支2和分支5間遺傳距離最大(12.40%),分支1與分支2以及分支1與分支3的遺傳距離最小(8.60%)。在鄰接樹上黑斑緋鯉和馬六甲緋鯉互相混雜,共同位于支系1,其它4種緋鯉獨自成支(圖1)。

        表1 研究所用樣品及采集地Tab.1 Specimens and sampling information in the present study

        圖1 COⅠ基因基于K 2P模型構(gòu)建的NJ樹Fig.1 NJ tree based on COⅠgene using K2Pmodel

        基于K2P模型的種內(nèi)種間遺傳距離見表2。種內(nèi)遺傳距離最大的為黑斑緋鯉(0.40%),最小的為呂宋緋鯉(0.00%),平均為0.18%;種間遺傳距離最大的是縱帶緋鯉與條尾緋鯉(12.40%),最小的是黑斑緋鯉與馬六甲緋鯉(0.30%),平均為9.26%;種間平均遺傳距離約為種內(nèi)平均遺傳距離的51倍。單獨分析獨立成支的4種緋鯉時,種內(nèi)遺傳距離最大的為縱帶緋鯉和條尾緋鯉(均為0.20%),最小的為呂宋緋鯉(0.00%),平均為0.125%;種間遺傳距離最大的仍為縱帶緋鯉和條尾緋鯉(12.40%),最小的是縱帶緋鯉和黃帶緋鯉(8.80%),平均為10.70%,種間平均遺傳距離約為種內(nèi)平均遺傳距離的85倍。

        3 討論

        3.1 COⅠ基因?qū)δ虾>p鯉屬魚類的鑒定

        利用COⅠ基因序列進(jìn)行物種鑒定的主要標(biāo)準(zhǔn)在于種間遺傳距離遠(yuǎn)大于種內(nèi)遺傳距離(約10倍以上)[1]。除腔腸動物門(Cnidaria)外,大部分動物種內(nèi)遺傳距離小于1%,很少大于2%,2%是DNA條形碼研究中的物種劃分參考值[2]。本文6種魚類種內(nèi)遺傳距離(0.00%~0.40%)均小于1%,符合種內(nèi)遺傳距離標(biāo)準(zhǔn),其中獨自成支的縱帶緋鯉、黃帶緋鯉、呂宋緋鯉、條尾緋鯉相互間遺傳距離(8.80%~12.40%)都顯著大于種間2%的遺傳差異界限[2],且均遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于它們種內(nèi)遺傳距離的10倍以上,DNA條形碼對這4種魚類進(jìn)行了有效的區(qū)分。黑斑緋鯉和馬六甲緋鯉混雜分布在鄰接樹的同一個分支上,種間遺傳距離(0.30%)在一般物種種內(nèi)范圍(≤2%),但在形態(tài)上,黑斑緋鯉自吻尖經(jīng)眼到尾鰭基有一黑色縱帶,第一背鰭頂端黑色;馬六甲緋鯉體側(cè)為金黃色縱帶,且背鰭尾鰭上葉均有黃棕色條紋[9],二者有較明顯的區(qū)別。對于這種情況,推測原因如下:一方面,很多魚類在不同的發(fā)育階段斑紋、色澤等都有顯著差異[22-23],如鯛科黑鯛(Sparus macrocephalus)、切氏黑棘鯛(Sparus swinhonisczerskii)體側(cè)有6~7條明顯的橫帶,而黑棘鯛(Acanthopagrus schlegelii)體側(cè)無橫帶,與前二者外部形態(tài)上存在差異,但AKAZAKI[24]研究發(fā)現(xiàn)黑棘鯛為唯一的有效種,黑鯛和切氏黑棘鯛均為黑棘鯛的幼魚;吳仁協(xié)等[25]在研究外部無橫帶黑棘鯛(A.schlegeliischlegelii)和有橫帶黑棘鯛(A.schlegeliiczerkii)時,發(fā)現(xiàn)二者COⅠ和控制區(qū)基因序列的平均遺傳距離僅分別為0.15%和0.51%,且并未形成單系群,認(rèn)為二者是同一物種的不同形態(tài)型。筆者推測黑斑緋鯉和馬六甲緋鯉有可能與上述情況類似,是同一物種的不同形態(tài)型?;蚨卟皇峭晃锓N,可能情況如下:1)存在種間雜交現(xiàn)象。本文馬六甲緋鯉和部分黑斑緋鯉均采自廣東陽江和廣西合浦,同屬的近緣物種處于相同的地點和相似的生活環(huán)境時,由于缺乏有效的隔離機(jī)制,使得相互間的基因滲透幾率升高,可能出現(xiàn)雜交現(xiàn)象[26]。黑斑緋鯉和馬六甲緋鯉體側(cè)均具縱帶,僅有顏色方面的差別,雜交后代可能在形態(tài)上更多的表現(xiàn)為縱帶顏色不同的中間形態(tài)或者趨向于親本中的一種。但由于線粒體DNA是核外遺傳物質(zhì),呈母系遺傳(maternal inheritance)方式,后代線粒體DNA幾乎全部來自母本,因而可能會出現(xiàn)分子與形態(tài)鑒定結(jié)果不一致的情況。2)近期輻射進(jìn)化的影響。GOVINDARAJU等[27]對印度洋沿岸7種石斑魚隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(RAPD)研究發(fā)現(xiàn),點帶石斑魚(Epinephelus coioides)、巨石斑魚(Epinephelus tauvina)和黑帶石斑魚(Epinephelus malabaricus)間遺傳距離很近,但從斑點、體色方面差異可以區(qū)分,這與本文中黑斑緋鯉和馬六甲緋鯉的情況十分類似;另外SHEARER等[28]對30個加勒比海珊瑚礁物種的研究發(fā)現(xiàn),標(biāo)準(zhǔn)COⅠ條形碼序列長度較短且進(jìn)化速度較慢,而近期進(jìn)化形成的物種種間分化不足,導(dǎo)致種間和種內(nèi)的遺傳距離往往相差不大,對近期進(jìn)化形成的物種經(jīng)常難以徹底區(qū)分。因此,結(jié)合上述報道,也不排除二者是近期輻射進(jìn)化形成的可能。

        表2 緋鯉屬魚類基于K 2P模型的種間(對角線下)和種內(nèi)(對角線)遺傳距離Tab.2 Inter-species(below diagonal)and intra-species(diagonal)genetic distance based on K 2P model of Upeneus

        3.2 小結(jié)與展望

        綜上所述,線粒體COⅠ基因能夠作為DNA條形碼有效地鑒定區(qū)分中國南海緋鯉屬魚類中的縱帶緋鯉、黃帶緋鯉、呂宋緋鯉、條尾緋鯉。由于DNA條形碼對物種的鑒定不依賴個體形態(tài),不受發(fā)育階段影響,今后可被廣泛應(yīng)用于這幾種緋鯉屬魚卵、仔稚魚的鑒定工作,為海洋漁業(yè)早期調(diào)查提供資料,同時也能用來對緋鯉屬魚類形態(tài)學(xué)分類系統(tǒng)進(jìn)行補(bǔ)充和修訂。由于采樣的限制,本文所分析樣本量仍有不足,得到的結(jié)果可能不夠全面,同時黑斑緋鯉和馬六甲緋鯉的分類地位仍未明確,考慮在今后的工作中,擴(kuò)大采樣的地理范圍,增加分析樣品的數(shù)量,進(jìn)行詳細(xì)形態(tài)測量和傳統(tǒng)漁業(yè)生物學(xué)調(diào)查,選取線粒體中進(jìn)化速度更快的區(qū)域如控制區(qū)等,并結(jié)合核基因等信息研究是否存在生殖或遺傳隔離等情況,以更好地明確它們的分類地位和遺傳背景,為種質(zhì)資源的保護(hù)和開發(fā)利用提供參考資料。

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        [28]SHEARER T L,COFFROTH M A.Barcoding corals:Limited by interspecific divergence,not intraspecific variation[J].Molecular Ecology Resources,2008,8(2):247-255.

        Application of Mitochondrial Cytochrome Oxidase Subunit I sequence in DNA barcoding Upeneus in the South China Sea

        GONG Ya-yun,ZHANG Qun,CAO Yan,LV Jin-lei,YANG Xi-shu
        (Institute of Hydrobiology,Jinan University,Guangzhou510632,China)

        To test the role of652 bp segments of mtDNA cytochrome oxidase subunit I gene as DNA barcoding in identifyingUpeneusspecies,reliably determining species status and constructing a reference sequence library,specimens collected in the South China Sea were morphologically identified,the intra-species and inter-species genetic distances of the genusUpeneuswere calculated,and phylogenetic trees were reconstructed.DNA barcoding from 56 specimens representing 6 species of genusUpeneusrevealed that the nucleotide compositions were calculated as T=29.2%,C=29.6%,A=21.4%,G=19.8%,A+T(50.6%)was slightly higher than C+G(49.4%),the average value of transition/transversion ratios was 3.08.In the NJ tree 6 species exhibited 5 discrete clades with 100%bootstrap supports,of whichUpeneus tragulaandUpeneusmoluccensiswere intertwined in the same clade,and the remaining 4 species formed 4 independent clades,the average genetic distances among clades[10.1%(8.6%-12.4%)]were 56 times thatwithin clades[0.18%(0.0%-0.3%)].Inter-species distances amongUpeneus subvittatus,Upeneus sulphureus,Upeneus luzonius,andUpeneus bensasi[10.7(8.8%-12.4%)]were 85 times that of the intraspecies[0.125%(0.0%-0.2%)],the inter-species distances were 10 times greater than that of intraspecies divergences(the"10x rule"),which confirmed their species status.Although intra-species genetic distances ofU.tragulaandU.moluccensiswere 0.4%and 0.2%respectively,which were similar to the other 4 congeneric species,the genetic distances betweenU.tragulaandU.moluccensiswere only 0.3%,which fell within the scope of most intra-species distances,suggesting that they might be the same species,but it needs to be confirmed by morphological and genomic sequence analysis,and interspecific hybridization or recent evolutionary radiation also should be excluded in further studies.Although DNA barcoding permitted the discrimination of66.7%(4/6)Upeneusspecies,demonstrating the utility of barcoding for regional species identification,the inconsistence of DNA barcoding and morphological identification ofU.tragulaandU.moluccensisnecessitates the worth of combination ofmore detailed morphological examination and ecological investigation,and sequence information from nuclear genes and/or fast-evolving mitochondrial DNA genes.

        Upeneus;DNA barcoding;Cytochrome Oxidase Subunit1;the South China Sea

        Q 349

        A

        1004-2490(2016)02-0113-07

        2015-10-22

        國家自然科學(xué)基金(41071034);中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項資金(21613105);歐盟Erasmus Mundus TECHNO I博士后教育交流項目

        宮亞運(1990-),男,山東即墨人,碩士研究生,研究方向為分子生態(tài)學(xué)。E-mail:gyy19901005@163.com

        章 群,副研究員。Tel:13431042736,E-mail:tqzhang@jnu.edu.cn

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