張雪　明雅南　張嵐

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·綜述·

誘導性多能干細胞的安全性及其在肝細胞再生方面的應用潛能

張雪明雅南張嵐

200127上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院血管外科(張雪、張嵐)；上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院、上海市消化病研究所(明雅南)

2006年，Takahashi等[1]運用逆轉錄病毒將4個與胚胎干細胞(Embryonic stem cells, ESCs)多能性密切相關的基因Oct-4、Sox2、c-Myc及Klf4導入到小鼠胚胎成纖維細胞和小鼠尾尖成纖維細胞中，成功將其重編程為具有ESCs多能性的細胞，命名為誘導性多能干細胞(Induced pluripotent stem cells，iPSCs)。2007年,Yamanaka研究小組進一步利用Nanog代替Fbx15進行篩選,得到了Nanog+的iPSCs系,這樣取得的iPSCs更接近于胚胎干細胞[2]。研究表明，iPSCs在體外可誘導分化成諸多目的細胞，如原始生殖細胞[3]、神經細胞[4]、心血管細胞[5, 6]以及肝臟細胞[7]等，在疾病治療中具有巨大應用價值。iPSCs優(yōu)勢明顯，不僅繼承了成體干細胞和ESCs各自的優(yōu)點，且來源比成體干細胞豐富，并克服了與ESCs相關的免疫原性和倫理學爭議，成為再生醫(yī)學領域最有潛力的種子細胞[8]。但是，iPSCs誘導分化的安全性(如致瘤性)卻是其臨床運用的一大障礙[9]。

肝臟是人體的“加工廠”，在生命體中起著解毒、代謝、分泌膽汁、免疫防御以及造血、儲血和調節(jié)循環(huán)血量等重要功能。但肝臟很容易患上如肝炎、肝硬化以及肝癌等疾病，且早期往往沒有明顯癥狀，已成為嚴重威脅人類健康的“隱形殺手”[10]。目前，對于終末期肝病仍然沒有有效的治療措施，原位肝移植(Orthotopic liver transplantation, OLT)成為了疾病治療最后的保障，然而供肝短缺、費用昂貴、高手術風險、免疫排斥而需要服用免疫抑制劑等因素嚴重限制其發(fā)展[11]。近年來，干細胞移植療法在治療終末期肝病方面有效性凸顯，其中以iPSCs最引人關注。研究表明，iPSCs來源的肝細胞(iPSCs derived hepatocytes,iPSC-Heps)在動物肝臟損傷、衰竭等模型中發(fā)揮良好的治療效果[12-14]。

盡管iPSCs存在安全隱患，但其在肝細胞再生治療終末期肝病方面具有巨大的應用潛能。

一、iPSCs誘導分化的安全性

綜觀近年來iPSCs安全性方面的研究，一般認為主要通過以下幾種途徑提高其誘導分化的安全性。

(一)通過改變誘導因子及其載體提高iPSCs的安全性由于重編程iPSCs的誘導因子如c-Myc等本身就是致瘤基因，導入后增加了iPSCs的致瘤風險，所以減少誘導因子的數(shù)量或重編程后敲除致瘤基因可降低iPSCs致瘤性。有研究發(fā)現(xiàn)僅導入三個基因(Oct4、Sox2、Klf4)甚至二個基因(Oct4、Sox2)也可以得到iPSCs，雖然誘導效率下降，但降低了iPSCs的致瘤風險[15, 16]。Soldner等[17]使用一種基因編碼技術將轉錄因子的基因序列兩端留存特殊標志，重編程完成后使用Cre-重組酶識別此標志并移除轉錄因子。也有研究者使用piggyBac轉座子重編系統(tǒng)[18]，當使用piggyBac轉座子成功編程后再表達轉座酶刪除轉座子，獲得無外源性病毒載體及轉錄因子的iPSCs。除了轉錄因子，其傳統(tǒng)載體包括反轉錄病毒、慢病毒以及腺相關病毒載體等難免嵌入細胞染色體，增加癌變風險。要想更安全的臨床應用iPSCs，非整合性載體如質粒、重組腺病毒載體[19, 20]是較好的選擇。Zhou T等[21]使用episomal載體將六種胚胎相關基因(Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Lin28、Nanog)導入腎臟上皮細胞，成功誘導成為人iPSCs，從而避免了使用病毒載體,提高了移植安全性。另外，Margaritia等[22]發(fā)現(xiàn)從體細胞重編程的早期階段到多能狀態(tài),特定的基因表達模式會發(fā)生改變。因此，不減少轉錄因子的數(shù)量，僅將重編程時間縮短為4 d就可生成部分iPSCs(Partial iPSCs，PiPSCs)，移植到體內后不形成腫瘤。

(二)通過細胞分選技術提高iPSCs的安全性移植前使用細胞分選技術，包括熒光活化細胞分選(Fluorescence Activated Cell Sorting，F(xiàn)ACS)、磁性活化細胞分選(Magnetic Activated Cell Sorting，MACS)等對細胞進行純化可提高iPSCs移植后安全性。Doi等[23]運用FACS有效分選出CORIN+人iPSCs來源的中腦多巴胺能神經祖細胞，此類細胞表達中腦多巴胺能神經祖細胞標記FOXA2和LMX1A。CORIN+細胞移植到6-羥基多巴胺帕金森病模型大鼠體內后存活并分化為中腦多巴胺能神經元，顯著提高其運動能力且不形成腫瘤。Polanco等[24]發(fā)現(xiàn)使用病毒轉導或者游離非整合載體獲得的處于分化極早期的人iPSCs表現(xiàn)出還原到多潛能表型的傾向，增加了iPSCs的致瘤風險。對此類細胞進行有效的分離及監(jiān)控將有助于提高安全性。研究人員基于細胞表面標記TG30(CD9)和GCTM-2的表達使用FACS識別處于分化極早期的多潛能細胞。經FACS分離后的已分化細胞重新獲得對于TG30(CD9)和GCTM-2的免疫反應，形成干細胞樣集落，重新表達常見的多能性標志物，并在免疫功能不全小鼠體內形成畸胎瘤。因此，可通過激光技術發(fā)現(xiàn)并鑒定iPSCs表面特異性蛋白，基于特異性蛋白的存在與否分離出這些iPSCs并進行監(jiān)控，不安全的iPSCs系形成可識別的細胞聚集體，可用于篩選出安全的iPSCs。

(三)通過清除殘留的未分化細胞提高iPSCs的安全性殘留的未分化細胞也是引起iPSCs移植術后腫瘤形成的主要原因。因此，消除未分化細胞成分是實現(xiàn)iPSCs治療無瘤化的有效策略。目前，一些實驗室已經集中篩選擁有選擇性地誘導多能干細胞死亡能力的小分子,這些分子有應用到臨床以消除未分化干細胞的潛力。Wyles SP等[25]發(fā)現(xiàn)DNA拓撲異構酶II抑制劑依托泊苷可清除早期心臟祖細胞群中的多能細胞從而抑制畸胎瘤的形成。將治療劑量的部分分化iPSCs來源的心臟祖細胞移植到心梗的免疫缺陷小鼠心臟內，依托泊苷處理組相比于對照組降低了腫瘤形成的風險。Ben.David等[26]對超過52000個小分子進行高通量篩選并確定了15個多潛能干細胞特異性抑制劑(PluriSins)。在這些分子中, 硬脂?；?輔酶A脫氫酶(Stearoyl-CoA Desaturase，SCD)抑制劑PluriSin#1作為多能干細胞特異性抑制劑在誘導人ESCs的細胞毒性方面顯示出高效率，能夠選擇性清除人類多能干細胞，而對組織特異性干/祖細胞以及已分化細胞卻無此作用，有望徹底攻克iPSC致瘤性這一難題。由于iPSCs和ESCs在基因和蛋白表達方面有顯著的差異，關于PluriSin#1對ESCs致瘤性的影響的數(shù)據(jù)不能直接外推到iPSCs。有鑒于此，本課題組對PluriSin#1在克服iPSCs的致瘤性方面做了深入研究，發(fā)現(xiàn)Nanog陽性細胞在心臟中是形成iPS衍生物(induced Pluripotent Stem Derivative，iPSD)來源腫瘤的主要啟動細胞，PluriSin#1能選擇性地消除Nanog+的iPSD，抑制了腫瘤的形成且并不增加Nanog-細胞的凋亡。我們進一步將經PluriSin#1和二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)處理的iPSD分別注射入心梗模型小鼠的心肌內，PluriSin#1組的小鼠體內不形成腫瘤，可見消除殘余的Nanog+細胞可預防腫瘤的發(fā)生[6]。

盡管iPSCs從發(fā)現(xiàn)至今只有近十年時間，但是進展十分迅速。研究人員不斷對iPSCs分化過程中的各個環(huán)節(jié)進行優(yōu)化和改進，在提高其應用安全性方面已取得了一定的成果。

二、iPSCs誘導分化為肝細胞

Chiang等[7]誘導iPSCs分化為類肝細胞，表達多種肝臟特異性標記物(白蛋白、甲胎蛋白、肝細胞核因子3β等)，符合正常肝細胞生物學特性。Chang等[27]發(fā)現(xiàn)，無重編程因子c-Myc的iPSCs也具有分化成肝細胞的能力。Chiang等[28]誘導人牙髓來源的成纖維細胞為iPSCs，并進一步分化為類肝細胞，與人ESCs來源的肝細胞相似。Liu等[13]運用相同的分化與移植方案評估了來源于各個胚層組織(外胚層、中胚層和內胚層)的iPSCs誘導分化為肝細胞的能力，發(fā)現(xiàn)分化所得iPSC-Heps都能定植到小鼠肝臟，且能促進肝硬化小鼠肝臟組織再生。但是，傳統(tǒng)培養(yǎng)方法獲得iPSCs-Heps的效率欠佳。Zhang等[29]改進誘導方案，運用3D培養(yǎng)系統(tǒng)誘導人iPSCs來源的同源性肝臟內胚層細胞(Hepatic endoderm cells,iPSC-HEs)分化為功能性類肝細胞。iPSC-HEs培養(yǎng)在3D微型培養(yǎng)板中。第4天，iPSC-Hes集聚形成許多大小一致(直徑約100-200μm)，分布均勻的球狀體。第14天，球狀體分化為類肝細胞，表達肝臟標志基因，效率比傳統(tǒng)方法更高。Choi等[30]也通過改進誘導分化方案獲得不同組織器官起源的病人特異性的iPSC-Heps。Chen等[31]等發(fā)現(xiàn)肝細胞生長因子可增強活化素A和Wnt3a的效力，提高內胚層標志物Foxa2的表達。所得iPSC-Heps具有與成熟肝細胞相似的基因表達譜，并且具有細胞色素P450酶活性，可分泌尿素、攝取低密度脂蛋白、儲存糖原。Chien等[32]運用非病毒載體提呈miR-122，縮短了iPSCs分化為肝細胞的時間。Nagamoto等[33]將表達FNK(一種來自Bcl-xL的極度活躍的突變基因)的腺病毒載體轉染hiPSC-Heps得到hiPSC-Heps/ FNK，并將其移植到嚴重聯(lián)合免疫缺陷FNK基因敲除小鼠體內，提高了肝細胞再生效率。

三、iPSC-Heps的應用潛能

研究表明，iPSCs促進肝細胞再生的有效性顯著。移植iPSC-Heps對于四氯化碳(CCl4)或對硫代乙酰胺誘導的小鼠急性/暴發(fā)性肝衰具有明顯的保護活性，有效減少了肝臟壞死面積，改善肝臟功能[7, 27]。iPSC-Heps表現(xiàn)出多種抗氧化酶活性，阻止CCl4誘導的活性氧的產生及細胞死亡。此外，移植iPSC-Heps還可以改善CCl4誘導的肝性腦病[27]。Chiang等[28]為了提高類肝細胞的移植能力開發(fā)了一種可持續(xù)釋放肝細胞生長因子的可注射性羧甲基己酰殼聚糖水凝膠(HGF-CHC)，研究了已遞呈HGF-CHC的類肝細胞在體外和在硫代乙酰胺誘導的免疫功能不全小鼠的AHF模型體內的肝臟保護效應。相比 于PBS處理的iPSC-Heps，肝內提呈HGF-CHC-iPSC-Heps表現(xiàn)出更高的抗氧化抗凋亡活性，減少了肝臟壞死面積。此外，該肝臟保護效應可被抗HGF 中和抗體消除?？梢?，HGF-CHC是iPSC-Heps移植治療AHF 理想的載體。Chien等[32]運用CHC提呈miR122-iPSC-Heps，表現(xiàn)出明顯的體內肝臟保護效應，有望促進AHF肝臟再生。腹腔內注射氨基半乳糖常被用于誘導大鼠致死性急性肝衰模型，三天內死亡率高達90%。Ramanathan等[34]分別將hiPSC-Heps、hiPSC-Heps及內皮細胞的混合細胞移植到急性肝衰的無胸腺裸大鼠脾臟，提高了大鼠存活率。移植后第三天，超過一半的大鼠血清中可檢測到人血清蛋白。但半個月后，只有在移植混合細胞的大鼠血清中可檢測到人血清蛋白。Chen等[31]發(fā)現(xiàn)人iPSC-Heps在體內實驗中，可促進肝臟再生，挽救暴發(fā)性肝功能衰竭的非肥胖糖尿病嚴重聯(lián)合免疫缺陷小鼠生命。Zhang等[35]在肝細胞分化中期發(fā)現(xiàn)，人iPSC-HEs中包含最高含量的Ki67+細胞，證實該時期存在豐富的增殖肝臟祖細胞，其分化與擴增在移植治療肝臟疾病方面有樂觀的應用前景。Takebe[14, 36]將人體皮膚細胞來源的iPSCs誘導分化為早期肝細胞，與人類臍靜脈內皮細胞和MSCs混合，很快形成肉眼可見的立體細胞團。5 d后，細胞團形成微三維結構-“肝芽”，功能類似小型肝臟。隨后將“肝芽”移植到免疫缺陷小鼠體內，“肝芽”在48 h之內與小鼠血管連接，約10 d后，開始正常工作?！案窝俊钡幕虮磉_譜與人類胎兒肝組織相近，移植到小鼠體內的“肝芽”與成人肝臟具有相似的代謝功能。后續(xù)實驗發(fā)現(xiàn)，對更昔洛韋誘導的肝衰竭小鼠行“肝芽”移植可提高存活率。Lau等[37]將iPSCs分化細胞封裝入3D支架系統(tǒng)來制造植入式復合物用于肝臟再生。該研究團隊以微孔水凝膠作為細胞集落及胚體形成和分化的平臺，在干細胞生成集落和胚體后進一步誘導其向肝細胞系分化，分化所得細胞內肝臟特定基因和標記物上調。微孔水凝膠能加強營養(yǎng)交換，為封裝入的干細胞提供更大的空間以快速生成集落和胚體。相比于單層細胞培養(yǎng)，3D培養(yǎng)產生的尿素和白蛋白明顯增加，也證實此系統(tǒng)的優(yōu)越性。

四、問題與展望

目前人工肝臟研究進展緩慢，肝細胞來源問題是主要瓶頸之一，肝細胞移植技術也同樣面臨此問題。iPSCs因其獨特的優(yōu)勢已成為移植用肝細胞的理想來源。雖然iPSC-Heps促進肝臟再生作用顯著,但iPSCs的誘導效率和安全性、iPSC-Heps的功能、移植時間窗、途徑等問題仍需重視。目前已經有學者研究出微型肝臟，如“肝芽”，但規(guī)模仍太小且結構并不完整。如何使“肝芽”發(fā)育成熟、結構功能完善(膽管生成)將是急需解答的課題。

隨著研究的深入，iPSCs臨床推廣所面臨的障礙必將一一掃除，在肝細胞再生方面的應用必將給終末期肝病患者帶來福音。

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(本文編輯：張苗)

基金項目：上海市科委國際科技合作基金(14430721400)

通信作者：張嵐，Email: rjzhanglan@sjtu.edu.cn

(收稿日期：2015-12-20)