張雪　明雅南　張嵐

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·綜述·

誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的安全性及其在肝細(xì)胞再生方面的應(yīng)用潛能

張雪明雅南張嵐

200127上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院血管外科(張雪、張嵐)；上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院、上海市消化病研究所(明雅南)

2006年，Takahashi等[1]運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄病毒將4個(gè)與胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cells, ESCs)多能性密切相關(guān)的基因Oct-4、Sox2、c-Myc及Klf4導(dǎo)入到小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和小鼠尾尖成纖維細(xì)胞中，成功將其重編程為具有ESCs多能性的細(xì)胞，命名為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(Induced pluripotent stem cells，iPSCs)。2007年,Yamanaka研究小組進(jìn)一步利用Nanog代替Fbx15進(jìn)行篩選,得到了Nanog+的iPSCs系,這樣取得的iPSCs更接近于胚胎干細(xì)胞[2]。研究表明，iPSCs在體外可誘導(dǎo)分化成諸多目的細(xì)胞，如原始生殖細(xì)胞[3]、神經(jīng)細(xì)胞[4]、心血管細(xì)胞[5, 6]以及肝臟細(xì)胞[7]等，在疾病治療中具有巨大應(yīng)用價(jià)值。iPSCs優(yōu)勢(shì)明顯，不僅繼承了成體干細(xì)胞和ESCs各自的優(yōu)點(diǎn)，且來(lái)源比成體干細(xì)胞豐富，并克服了與ESCs相關(guān)的免疫原性和倫理學(xué)爭(zhēng)議，成為再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最有潛力的種子細(xì)胞[8]。但是，iPSCs誘導(dǎo)分化的安全性(如致瘤性)卻是其臨床運(yùn)用的一大障礙[9]。

肝臟是人體的“加工廠”，在生命體中起著解毒、代謝、分泌膽汁、免疫防御以及造血、儲(chǔ)血和調(diào)節(jié)循環(huán)血量等重要功能。但肝臟很容易患上如肝炎、肝硬化以及肝癌等疾病，且早期往往沒(méi)有明顯癥狀，已成為嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的“隱形殺手”[10]。目前，對(duì)于終末期肝病仍然沒(méi)有有效的治療措施，原位肝移植(Orthotopic liver transplantation, OLT)成為了疾病治療最后的保障，然而供肝短缺、費(fèi)用昂貴、高手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)、免疫排斥而需要服用免疫抑制劑等因素嚴(yán)重限制其發(fā)展[11]。近年來(lái)，干細(xì)胞移植療法在治療終末期肝病方面有效性凸顯，其中以iPSCs最引人關(guān)注。研究表明，iPSCs來(lái)源的肝細(xì)胞(iPSCs derived hepatocytes,iPSC-Heps)在動(dòng)物肝臟損傷、衰竭等模型中發(fā)揮良好的治療效果[12-14]。

盡管iPSCs存在安全隱患，但其在肝細(xì)胞再生治療終末期肝病方面具有巨大的應(yīng)用潛能。

一、iPSCs誘導(dǎo)分化的安全性

綜觀近年來(lái)iPSCs安全性方面的研究，一般認(rèn)為主要通過(guò)以下幾種途徑提高其誘導(dǎo)分化的安全性。

(一)通過(guò)改變誘導(dǎo)因子及其載體提高iPSCs的安全性由于重編程iPSCs的誘導(dǎo)因子如c-Myc等本身就是致瘤基因，導(dǎo)入后增加了iPSCs的致瘤風(fēng)險(xiǎn)，所以減少誘導(dǎo)因子的數(shù)量或重編程后敲除致瘤基因可降低iPSCs致瘤性。有研究發(fā)現(xiàn)僅導(dǎo)入三個(gè)基因(Oct4、Sox2、Klf4)甚至二個(gè)基因(Oct4、Sox2)也可以得到iPSCs，雖然誘導(dǎo)效率下降，但降低了iPSCs的致瘤風(fēng)險(xiǎn)[15, 16]。Soldner等[17]使用一種基因編碼技術(shù)將轉(zhuǎn)錄因子的基因序列兩端留存特殊標(biāo)志，重編程完成后使用Cre-重組酶識(shí)別此標(biāo)志并移除轉(zhuǎn)錄因子。也有研究者使用piggyBac轉(zhuǎn)座子重編系統(tǒng)[18]，當(dāng)使用piggyBac轉(zhuǎn)座子成功編程后再表達(dá)轉(zhuǎn)座酶刪除轉(zhuǎn)座子，獲得無(wú)外源性病毒載體及轉(zhuǎn)錄因子的iPSCs。除了轉(zhuǎn)錄因子，其傳統(tǒng)載體包括反轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒以及腺相關(guān)病毒載體等難免嵌入細(xì)胞染色體，增加癌變風(fēng)險(xiǎn)。要想更安全的臨床應(yīng)用iPSCs，非整合性載體如質(zhì)粒、重組腺病毒載體[19, 20]是較好的選擇。Zhou T等[21]使用episomal載體將六種胚胎相關(guān)基因(Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Lin28、Nanog)導(dǎo)入腎臟上皮細(xì)胞，成功誘導(dǎo)成為人iPSCs，從而避免了使用病毒載體,提高了移植安全性。另外，Margaritia等[22]發(fā)現(xiàn)從體細(xì)胞重編程的早期階段到多能狀態(tài),特定的基因表達(dá)模式會(huì)發(fā)生改變。因此，不減少轉(zhuǎn)錄因子的數(shù)量，僅將重編程時(shí)間縮短為4 d就可生成部分iPSCs(Partial iPSCs，PiPSCs)，移植到體內(nèi)后不形成腫瘤。

(二)通過(guò)細(xì)胞分選技術(shù)提高iPSCs的安全性移植前使用細(xì)胞分選技術(shù)，包括熒光活化細(xì)胞分選(Fluorescence Activated Cell Sorting，F(xiàn)ACS)、磁性活化細(xì)胞分選(Magnetic Activated Cell Sorting，MACS)等對(duì)細(xì)胞進(jìn)行純化可提高iPSCs移植后安全性。Doi等[23]運(yùn)用FACS有效分選出CORIN+人iPSCs來(lái)源的中腦多巴胺能神經(jīng)祖細(xì)胞，此類(lèi)細(xì)胞表達(dá)中腦多巴胺能神經(jīng)祖細(xì)胞標(biāo)記FOXA2和LMX1A。CORIN+細(xì)胞移植到6-羥基多巴胺帕金森病模型大鼠體內(nèi)后存活并分化為中腦多巴胺能神經(jīng)元，顯著提高其運(yùn)動(dòng)能力且不形成腫瘤。Polanco等[24]發(fā)現(xiàn)使用病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)或者游離非整合載體獲得的處于分化極早期的人iPSCs表現(xiàn)出還原到多潛能表型的傾向，增加了iPSCs的致瘤風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)此類(lèi)細(xì)胞進(jìn)行有效的分離及監(jiān)控將有助于提高安全性。研究人員基于細(xì)胞表面標(biāo)記TG30(CD9)和GCTM-2的表達(dá)使用FACS識(shí)別處于分化極早期的多潛能細(xì)胞。經(jīng)FACS分離后的已分化細(xì)胞重新獲得對(duì)于TG30(CD9)和GCTM-2的免疫反應(yīng)，形成干細(xì)胞樣集落，重新表達(dá)常見(jiàn)的多能性標(biāo)志物，并在免疫功能不全小鼠體內(nèi)形成畸胎瘤。因此，可通過(guò)激光技術(shù)發(fā)現(xiàn)并鑒定iPSCs表面特異性蛋白，基于特異性蛋白的存在與否分離出這些iPSCs并進(jìn)行監(jiān)控，不安全的iPSCs系形成可識(shí)別的細(xì)胞聚集體，可用于篩選出安全的iPSCs。

(三)通過(guò)清除殘留的未分化細(xì)胞提高iPSCs的安全性殘留的未分化細(xì)胞也是引起iPSCs移植術(shù)后腫瘤形成的主要原因。因此，消除未分化細(xì)胞成分是實(shí)現(xiàn)iPSCs治療無(wú)瘤化的有效策略。目前，一些實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)集中篩選擁有選擇性地誘導(dǎo)多能干細(xì)胞死亡能力的小分子,這些分子有應(yīng)用到臨床以消除未分化干細(xì)胞的潛力。Wyles SP等[25]發(fā)現(xiàn)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑依托泊苷可清除早期心臟祖細(xì)胞群中的多能細(xì)胞從而抑制畸胎瘤的形成。將治療劑量的部分分化iPSCs來(lái)源的心臟祖細(xì)胞移植到心梗的免疫缺陷小鼠心臟內(nèi)，依托泊苷處理組相比于對(duì)照組降低了腫瘤形成的風(fēng)險(xiǎn)。Ben.David等[26]對(duì)超過(guò)52000個(gè)小分子進(jìn)行高通量篩選并確定了15個(gè)多潛能干細(xì)胞特異性抑制劑(PluriSins)。在這些分子中, 硬脂?；?輔酶A脫氫酶(Stearoyl-CoA Desaturase，SCD)抑制劑PluriSin#1作為多能干細(xì)胞特異性抑制劑在誘導(dǎo)人ESCs的細(xì)胞毒性方面顯示出高效率，能夠選擇性清除人類(lèi)多能干細(xì)胞，而對(duì)組織特異性干/祖細(xì)胞以及已分化細(xì)胞卻無(wú)此作用，有望徹底攻克iPSC致瘤性這一難題。由于iPSCs和ESCs在基因和蛋白表達(dá)方面有顯著的差異，關(guān)于PluriSin#1對(duì)ESCs致瘤性的影響的數(shù)據(jù)不能直接外推到iPSCs。有鑒于此，本課題組對(duì)PluriSin#1在克服iPSCs的致瘤性方面做了深入研究，發(fā)現(xiàn)Nanog陽(yáng)性細(xì)胞在心臟中是形成iPS衍生物(induced Pluripotent Stem Derivative，iPSD)來(lái)源腫瘤的主要啟動(dòng)細(xì)胞，PluriSin#1能選擇性地消除Nanog+的iPSD，抑制了腫瘤的形成且并不增加Nanog-細(xì)胞的凋亡。我們進(jìn)一步將經(jīng)PluriSin#1和二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)處理的iPSD分別注射入心梗模型小鼠的心肌內(nèi)，PluriSin#1組的小鼠體內(nèi)不形成腫瘤，可見(jiàn)消除殘余的Nanog+細(xì)胞可預(yù)防腫瘤的發(fā)生[6]。

盡管iPSCs從發(fā)現(xiàn)至今只有近十年時(shí)間，但是進(jìn)展十分迅速。研究人員不斷對(duì)iPSCs分化過(guò)程中的各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行優(yōu)化和改進(jìn)，在提高其應(yīng)用安全性方面已取得了一定的成果。

二、iPSCs誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞

Chiang等[7]誘導(dǎo)iPSCs分化為類(lèi)肝細(xì)胞，表達(dá)多種肝臟特異性標(biāo)記物(白蛋白、甲胎蛋白、肝細(xì)胞核因子3β等)，符合正常肝細(xì)胞生物學(xué)特性。Chang等[27]發(fā)現(xiàn)，無(wú)重編程因子c-Myc的iPSCs也具有分化成肝細(xì)胞的能力。Chiang等[28]誘導(dǎo)人牙髓來(lái)源的成纖維細(xì)胞為iPSCs，并進(jìn)一步分化為類(lèi)肝細(xì)胞，與人ESCs來(lái)源的肝細(xì)胞相似。Liu等[13]運(yùn)用相同的分化與移植方案評(píng)估了來(lái)源于各個(gè)胚層組織(外胚層、中胚層和內(nèi)胚層)的iPSCs誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞的能力，發(fā)現(xiàn)分化所得iPSC-Heps都能定植到小鼠肝臟，且能促進(jìn)肝硬化小鼠肝臟組織再生。但是，傳統(tǒng)培養(yǎng)方法獲得iPSCs-Heps的效率欠佳。Zhang等[29]改進(jìn)誘導(dǎo)方案，運(yùn)用3D培養(yǎng)系統(tǒng)誘導(dǎo)人iPSCs來(lái)源的同源性肝臟內(nèi)胚層細(xì)胞(Hepatic endoderm cells,iPSC-HEs)分化為功能性類(lèi)肝細(xì)胞。iPSC-HEs培養(yǎng)在3D微型培養(yǎng)板中。第4天，iPSC-Hes集聚形成許多大小一致(直徑約100-200μm)，分布均勻的球狀體。第14天，球狀體分化為類(lèi)肝細(xì)胞，表達(dá)肝臟標(biāo)志基因，效率比傳統(tǒng)方法更高。Choi等[30]也通過(guò)改進(jìn)誘導(dǎo)分化方案獲得不同組織器官起源的病人特異性的iPSC-Heps。Chen等[31]等發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子可增強(qiáng)活化素A和Wnt3a的效力，提高內(nèi)胚層標(biāo)志物Foxa2的表達(dá)。所得iPSC-Heps具有與成熟肝細(xì)胞相似的基因表達(dá)譜，并且具有細(xì)胞色素P450酶活性，可分泌尿素、攝取低密度脂蛋白、儲(chǔ)存糖原。Chien等[32]運(yùn)用非病毒載體提呈miR-122，縮短了iPSCs分化為肝細(xì)胞的時(shí)間。Nagamoto等[33]將表達(dá)FNK(一種來(lái)自Bcl-xL的極度活躍的突變基因)的腺病毒載體轉(zhuǎn)染hiPSC-Heps得到hiPSC-Heps/ FNK，并將其移植到嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷FNK基因敲除小鼠體內(nèi)，提高了肝細(xì)胞再生效率。

三、iPSC-Heps的應(yīng)用潛能

研究表明，iPSCs促進(jìn)肝細(xì)胞再生的有效性顯著。移植iPSC-Heps對(duì)于四氯化碳(CCl4)或?qū)α虼阴０氛T導(dǎo)的小鼠急性/暴發(fā)性肝衰具有明顯的保護(hù)活性，有效減少了肝臟壞死面積，改善肝臟功能[7, 27]。iPSC-Heps表現(xiàn)出多種抗氧化酶活性，阻止CCl4誘導(dǎo)的活性氧的產(chǎn)生及細(xì)胞死亡。此外，移植iPSC-Heps還可以改善CCl4誘導(dǎo)的肝性腦病[27]。Chiang等[28]為了提高類(lèi)肝細(xì)胞的移植能力開(kāi)發(fā)了一種可持續(xù)釋放肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的可注射性羧甲基己酰殼聚糖水凝膠(HGF-CHC)，研究了已遞呈HGF-CHC的類(lèi)肝細(xì)胞在體外和在硫代乙酰胺誘導(dǎo)的免疫功能不全小鼠的AHF模型體內(nèi)的肝臟保護(hù)效應(yīng)。相比 于PBS處理的iPSC-Heps，肝內(nèi)提呈HGF-CHC-iPSC-Heps表現(xiàn)出更高的抗氧化抗凋亡活性，減少了肝臟壞死面積。此外，該肝臟保護(hù)效應(yīng)可被抗HGF 中和抗體消除?？梢?jiàn)，HGF-CHC是iPSC-Heps移植治療AHF 理想的載體。Chien等[32]運(yùn)用CHC提呈miR122-iPSC-Heps，表現(xiàn)出明顯的體內(nèi)肝臟保護(hù)效應(yīng)，有望促進(jìn)AHF肝臟再生。腹腔內(nèi)注射氨基半乳糖常被用于誘導(dǎo)大鼠致死性急性肝衰模型，三天內(nèi)死亡率高達(dá)90%。Ramanathan等[34]分別將hiPSC-Heps、hiPSC-Heps及內(nèi)皮細(xì)胞的混合細(xì)胞移植到急性肝衰的無(wú)胸腺裸大鼠脾臟，提高了大鼠存活率。移植后第三天，超過(guò)一半的大鼠血清中可檢測(cè)到人血清蛋白。但半個(gè)月后，只有在移植混合細(xì)胞的大鼠血清中可檢測(cè)到人血清蛋白。Chen等[31]發(fā)現(xiàn)人iPSC-Heps在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，可促進(jìn)肝臟再生，挽救暴發(fā)性肝功能衰竭的非肥胖糖尿病嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠生命。Zhang等[35]在肝細(xì)胞分化中期發(fā)現(xiàn)，人iPSC-HEs中包含最高含量的Ki67+細(xì)胞，證實(shí)該時(shí)期存在豐富的增殖肝臟祖細(xì)胞，其分化與擴(kuò)增在移植治療肝臟疾病方面有樂(lè)觀的應(yīng)用前景。Takebe[14, 36]將人體皮膚細(xì)胞來(lái)源的iPSCs誘導(dǎo)分化為早期肝細(xì)胞，與人類(lèi)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和MSCs混合，很快形成肉眼可見(jiàn)的立體細(xì)胞團(tuán)。5 d后，細(xì)胞團(tuán)形成微三維結(jié)構(gòu)-“肝芽”，功能類(lèi)似小型肝臟。隨后將“肝芽”移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，“肝芽”在48 h之內(nèi)與小鼠血管連接，約10 d后，開(kāi)始正常工作?！案窝俊钡幕虮磉_(dá)譜與人類(lèi)胎兒肝組織相近，移植到小鼠體內(nèi)的“肝芽”與成人肝臟具有相似的代謝功能。后續(xù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)更昔洛韋誘導(dǎo)的肝衰竭小鼠行“肝芽”移植可提高存活率。Lau等[37]將iPSCs分化細(xì)胞封裝入3D支架系統(tǒng)來(lái)制造植入式復(fù)合物用于肝臟再生。該研究團(tuán)隊(duì)以微孔水凝膠作為細(xì)胞集落及胚體形成和分化的平臺(tái)，在干細(xì)胞生成集落和胚體后進(jìn)一步誘導(dǎo)其向肝細(xì)胞系分化，分化所得細(xì)胞內(nèi)肝臟特定基因和標(biāo)記物上調(diào)。微孔水凝膠能加強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)交換，為封裝入的干細(xì)胞提供更大的空間以快速生成集落和胚體。相比于單層細(xì)胞培養(yǎng)，3D培養(yǎng)產(chǎn)生的尿素和白蛋白明顯增加，也證實(shí)此系統(tǒng)的優(yōu)越性。

四、問(wèn)題與展望

目前人工肝臟研究進(jìn)展緩慢，肝細(xì)胞來(lái)源問(wèn)題是主要瓶頸之一，肝細(xì)胞移植技術(shù)也同樣面臨此問(wèn)題。iPSCs因其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)已成為移植用肝細(xì)胞的理想來(lái)源。雖然iPSC-Heps促進(jìn)肝臟再生作用顯著,但iPSCs的誘導(dǎo)效率和安全性、iPSC-Heps的功能、移植時(shí)間窗、途徑等問(wèn)題仍需重視。目前已經(jīng)有學(xué)者研究出微型肝臟，如“肝芽”，但規(guī)模仍太小且結(jié)構(gòu)并不完整。如何使“肝芽”發(fā)育成熟、結(jié)構(gòu)功能完善(膽管生成)將是急需解答的課題。

隨著研究的深入，iPSCs臨床推廣所面臨的障礙必將一一掃除，在肝細(xì)胞再生方面的應(yīng)用必將給終末期肝病患者帶來(lái)福音。

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(本文編輯：張苗)

基金項(xiàng)目：上海市科委國(guó)際科技合作基金(14430721400)

通信作者：張嵐，Email: rjzhanglan@sjtu.edu.cn

(收稿日期：2015-12-20)