朱亞平　卜淑蕊

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·綜述·

肝纖維化發(fā)病機(jī)制研究新進(jìn)展

朱亞平卜淑蕊

201508上海復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院消化內(nèi)科

肝纖維化是肝臟持續(xù)發(fā)生組織損傷、修復(fù)反應(yīng)時(shí)因細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)合成降解與沉積不平衡而引起的病理過(guò)程， 是慢性肝病的病理特征，也是進(jìn)一步向肝硬化發(fā)展的主要環(huán)節(jié)。肝星狀細(xì)胞的活化、MMPs/ TIMPs平衡失調(diào)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β)均被證明在導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生過(guò)程中起重要作用，并且三種因素之間可以相互調(diào)節(jié)，形成復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。現(xiàn)就肝纖維化的發(fā)病機(jī)制的研究新進(jìn)展對(duì)尋找緩解和逆轉(zhuǎn)肝纖維化發(fā)生的重要臨床意義綜述如下。

一、肝纖維化病因和影響因素

纖維化( fibrosis)是指纖維連接組織[主要成分是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，如膠原蛋白和纖連蛋白]在損傷部位或炎癥組織的內(nèi)部或其周?chē)倪^(guò)度沉積，長(zhǎng)期纖維化可以導(dǎo)致瘢痕、器官衰竭，甚至死亡，肝臟疾病終末階段、腎病、特發(fā)性肺纖維化、心衰等多種器官損傷均可發(fā)生纖維化[1]。許多可以引起肝損傷的因素都可以導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生，包括病毒性肝炎(尤其是乙肝和丙肝)，酒精性肝病，藥物性損傷，鐵或銅等過(guò)度沉積的代謝性疾病，自身免疫性肝細(xì)胞或膽管上皮損傷，或先天性疾病等。肝纖維化是慢性肝損傷后的一種組織修復(fù)反應(yīng)，若無(wú)有效治療將演變?yōu)楦斡不透伟?。伴隨慢性損傷長(zhǎng)期存在，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白在肝纖維化發(fā)生過(guò)程中起關(guān)鍵作用，并且這是各種不同類(lèi)型慢性肝疾病的共同特征[2]。

細(xì)胞外基質(zhì)通常是由肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast, MF)產(chǎn)生的，肌成纖維細(xì)胞是纖維化器官的細(xì)胞外基質(zhì)的主要來(lái)源。不同細(xì)胞來(lái)源，包括組織特異性纖維母細(xì)胞、骨髓源性祖細(xì)胞、周皮細(xì)胞，和上皮細(xì)胞，均可以演變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞[3]。然而，肝臟中不論任何不同的病因情況下肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell, HSC)毫無(wú)疑問(wèn)是肌成纖維細(xì)胞的主要來(lái)源[4]。

正常情況下，肝臟細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix ，ECM)成分包括膠原蛋白(Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ等)，彈性蛋白，糖蛋白(層粘連蛋白、纖連蛋白等)，蛋白聚糖和透明質(zhì)酸等成分[5]。細(xì)胞外基質(zhì)蛋白成分時(shí)時(shí)刻刻都在被降解、同時(shí)被合成，降解和合成基本處于相互抵消狀態(tài)，某些酶類(lèi)可以降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，其中研究最多的是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)和其抑制劑(TIMPs)。

最近研究表明，肝纖維化是一個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程，涉及多種細(xì)胞因子和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路，包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor beta ，TGF-β)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor, PDGF)、成纖維生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor, FGF)、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor, EGF)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor, CTGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin-like growth factor1,IGF-1)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial cell growth factor, VEGF)等[6]。其中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor beta ，TGF-β)是最強(qiáng)的促纖維化生成因子。

纖維化的形成是一個(gè)復(fù)雜過(guò)程，多種細(xì)胞、蛋白、因子等均參與其調(diào)節(jié)，而且他們之間也是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，互相影響、互相調(diào)節(jié)。

二、MMPs/ TIMPs平衡

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一簇鋅依賴(lài)肽鏈內(nèi)切酶超家族，具有降解ECM所有成分的功能[8]，根據(jù)它們對(duì)ECM底物專(zhuān)一性可分為五種，分別是：膠原酶、明膠酶、膜型、基質(zhì)溶解素和降解素。對(duì)MMP的調(diào)節(jié)是一個(gè)很精細(xì)的過(guò)程，包括轉(zhuǎn)錄前、轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平的調(diào)節(jié)，任何引起MMP失調(diào)的因素都可以導(dǎo)致組織損傷和功能失調(diào)[9]。

MMPs家族既包括抑制纖維化的成分，也包括促進(jìn)纖維化的成分，MMP-1、MMP-2、MMP-8在慢性肝損傷過(guò)程中起保護(hù)作用，可以抑制肝纖維化的發(fā)展；MMP-12對(duì)促進(jìn)肝纖維化效果不明顯；相反，MMP-19似乎在肝損傷早期階段促進(jìn)纖維化發(fā)生[10]。研究表明，MMP-1和MMP-13是屬于膠原酶的一種剪切酶，他們主要負(fù)責(zé)剪切Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型膠原蛋白(是ECM重要組成部分)[11]。

組織金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)是調(diào)節(jié)MMPs活性的超家族，包括至少已知的4種MMP抑制劑[8]，其中，TIMP-1是最主要的MMP抑制劑[12]。理想狀態(tài)下，TIMPs分子和MMPs以1∶1可逆性結(jié)合，MMPs/ TIMPs平衡改變和許多引起基底膜破壞的病理情況相關(guān)，如腫瘤侵襲、血管生成、創(chuàng)傷愈合等[13]。Busk等[14]認(rèn)為MMPs和TIMPs都是由活化的肝臟肌成纖維細(xì)胞(MF)表達(dá)的，MF通過(guò)表達(dá)MMPs促進(jìn)ECM的降解。

活化的肝星狀細(xì)胞上調(diào)TIMPs的表達(dá)，結(jié)果導(dǎo)致TIMPs和MMPs之間平衡打破，從而ECM積聚[15]。MMP-12的活性和它與TIMP-1之間的比率可以調(diào)節(jié)肝纖維化中的彈性蛋白的含量，如果彈性蛋白降解受損會(huì)導(dǎo)致其在纖維化瘢痕中的積聚[16]。研究如何調(diào)節(jié)MMPs/ TIMPs的平衡及比例變化有助于我們尋找逆轉(zhuǎn)肝纖維化的方法，對(duì)治療肝纖維化有廣泛應(yīng)用前景。

三、肝星狀細(xì)胞

最近，有關(guān)肝星狀細(xì)胞的功能及分離方法的研究一直是肝臟相關(guān)研究的熱點(diǎn)。在靜息狀態(tài)下肝星狀細(xì)胞位于肝臟竇周間隙(血竇和肝細(xì)胞之間的空間，較貼近肝細(xì)胞)，其主要功能是廣泛攝取和儲(chǔ)存維生素A[17]，并且合成少量的層粘連蛋白和Ⅳ型膠原蛋白(是ECM的重要組成部分)。但是在病理狀態(tài)下，肝星狀細(xì)胞被慢性刺激或肝臟損傷所激活，然后活化增殖，表達(dá)α-平滑肌激動(dòng)蛋白(α-SMA)，維生素A合成減少，而細(xì)胞外基質(zhì)合成增加[18]。這時(shí)，細(xì)胞形態(tài)學(xué)也發(fā)生變化，從星形轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂忻黠@收縮性的纖維母細(xì)胞或肌成纖維細(xì)胞，且分泌大量細(xì)胞因子和趨化因子，包括促炎因子和粘附分子(如TGF-β、PDGF、VEGF等)，這提示肝星狀細(xì)胞的活化是肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵因素[19]。在這些細(xì)胞因子中，TGF-β被認(rèn)為是促進(jìn)HSC產(chǎn)生膠原蛋白的最重要的分子[20]。

HSC激活并轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞機(jī)制可以總結(jié)為以下級(jí)聯(lián)反應(yīng)步驟[21]：(1)直接旁分泌通路, 各種損傷因素導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷后, 凋亡或壞死的肝細(xì)胞釋放多種絲裂原樣物質(zhì), 始動(dòng)激活HSC轉(zhuǎn)化為MFB；(2)旁分泌活化通路, 肝損傷導(dǎo)致肝內(nèi)炎性細(xì)胞主要是活化的巨噬細(xì)胞以及血小板分泌大量細(xì)胞因子如TGF-β1、TNF-α、EGF、PDGF等, 進(jìn)一步刺激HSC活化轉(zhuǎn)化為MFB；(3)自分泌活化通路, MFB及HSC在轉(zhuǎn)化中可以自分泌TGF-β1、TNF-α等因子, 促進(jìn)自身進(jìn)一步活化, 在炎癥后階段即使去除原來(lái)的肝損傷因素, 也足以持續(xù)肝纖維化形成過(guò)程,此步是最重要的階段。 因此, TGF-β1對(duì)HSC的激活、轉(zhuǎn)化、分化及調(diào)節(jié)具有極其重要的作用, 是最強(qiáng)的促HSC纖維化生成因子。

根據(jù)這些研究，我們希望可以通過(guò)研究肝星狀細(xì)胞的激活和肝臟炎癥的特征來(lái)尋找對(duì)慢性肝病和肝纖維化的患者有效的抗纖維化和肝臟再生治療方法。

四、TGF-β促進(jìn)肝臟纖維化形成

(一) TGF-β的發(fā)展與分類(lèi)TGF曾經(jīng)被稱(chēng)為抑制分化因子(factor inhibiting differentiation)、刺激軟骨生長(zhǎng)因子(stimulating cartilage growth)、腫瘤生長(zhǎng)因子(sarcoma growth factor)等，這可以反應(yīng)他所具有的功能。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)是由Moses HL等于1981年首次命名的，他發(fā)現(xiàn)所謂的轉(zhuǎn)化纖維刺激因子可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化[22]。如今人們已經(jīng)了解TGF具有更為廣泛的功能，并且發(fā)現(xiàn)有TGF-α和TGF-β兩種因子，他們可以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、分化、遷移等，參與完成脂肪形成、軟骨形成、組織重塑、創(chuàng)傷愈合、腫瘤形成等過(guò)程。

哺乳動(dòng)物中TGF-β包括3種不同亞型，TGF-β1、-β2和-β3，其中TGF-β1由390個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，是加強(qiáng)肝星狀細(xì)胞活化和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白合成的關(guān)鍵因子，是含量最多且研究最廣泛的類(lèi)型；而TGF-β2和TGF-β3包含412個(gè)氨基酸殘基，且3種亞型顯示了高度的同源性[23]。人體中幾乎所有的細(xì)胞均可以分泌TGF-β1分子，而TGF-β2主要是由膠質(zhì)瘤細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞所合成分泌的，TGF-β3主要存在于胚胎的心肺組織中，少量存在于肝、腎、脾等器官中。在體外三種亞型有相似的效應(yīng)，但是體內(nèi)他們由于組織分布不同而具有不同的效應(yīng)。肝臟中，不論是正常還是纖維化狀態(tài)，TGF-β1是最常見(jiàn)最重要的亞型[24]。

(二)TGF-β1通過(guò)TGF-β/Smad信號(hào)通路發(fā)揮作用TGF-β1被釋放后，結(jié)合特異性Ⅱ型TGF-β受體，然后反過(guò)來(lái)募集并激活Ⅰ型TGF-β受體。一旦被激活，Ⅰ型TGF-β受體磷酸化Smad2/3蛋白，在與Smad4相互作用并結(jié)合為復(fù)合物后轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，進(jìn)而調(diào)解轉(zhuǎn)錄因子，抑制或激活特定目的基因的表達(dá)[25]。TGF-β/Smad信號(hào)傳導(dǎo)通路可以通過(guò)多種機(jī)制被不同的蛋白緊密調(diào)節(jié)，其中Smad7是一個(gè)關(guān)鍵的負(fù)性調(diào)節(jié)因子。研究證明，TGF-β信號(hào)通路的抑制因子可以通過(guò)肝星狀細(xì)胞中Smad7過(guò)度表達(dá)而抑制HSC的轉(zhuǎn)化并減弱肝纖維化發(fā)生[26 ]。miRNA-30可以減輕纖維化，導(dǎo)致體內(nèi)Smad7大幅度升高，并被定義為T(mén)GF-β信號(hào)傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵抑制因子[27]。

Sakai等[28 ]將TGF-βⅡ型受體敲除后發(fā)現(xiàn)肝纖維化程度明顯減弱，但是與對(duì)照組肝臟及纖連蛋白敲除組肝臟相比仍存在將近45%纖維化。這提示我們雖然TGF-β在肝纖維化過(guò)程中起重要作用，但纖維化過(guò)程可能存在其他的影響因素。

五、總結(jié)

TGF-β1傳遞信號(hào)給Smad3后可誘導(dǎo)TIMP-1表達(dá)，同時(shí)抑制MMP-1表達(dá)；MMP-2表達(dá)則依賴(lài)Smad2[29 ]。在敲除Smad2基因后，TGF-β1通過(guò)Smad-3通路可以上調(diào)TIMP-1表達(dá)、抑制MMP-2表達(dá)，從而抑制基質(zhì)蛋白降解[30]。由CCl4 長(zhǎng)期慢性干預(yù)引起的肝纖維化老鼠模型中，如果終止CCl4干預(yù)可以發(fā)現(xiàn)纖維化降解，其TIMPs水平下調(diào)，而MMP-13水平上調(diào)，同時(shí)肝星狀細(xì)胞凋亡[31]。

在HSC活化時(shí)需要TGF-β刺激，而HSC活化后又可以表達(dá)TGF-β、MMPs/TIMPs，TGF-β又通過(guò)Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)MMPs/TIMPs的表達(dá)?？梢?jiàn)，在纖維化形成過(guò)程中，不論是細(xì)胞水平、分子水平、調(diào)節(jié)因子等是相互影響的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，他們相互調(diào)節(jié)、相互影響，并被研究證實(shí)在肝纖維化形成及調(diào)節(jié)過(guò)程中均具有重要作用。

對(duì)肝纖維化發(fā)病機(jī)制的研究，最終目的是希望能夠優(yōu)化纖維化的臨床治療，干預(yù)或逆轉(zhuǎn)纖維化的發(fā)生。然而, 肝纖維化是一復(fù)雜、多因素參與的過(guò)程，基因調(diào)控也是一個(gè)精密、龐大、復(fù)雜的生物調(diào)控系統(tǒng)，面對(duì)這些問(wèn)題，現(xiàn)有的的生物技術(shù)方法存在限制，但是， 我們相信隨著基礎(chǔ)研究的日益發(fā)展，TGF-β1等引起肝纖維化的具體機(jī)制將得到更深入的探討。隨著纖維化發(fā)病機(jī)制的研究不斷深入， 將會(huì)給臨床治療提供越來(lái)越多的治療靶點(diǎn)。

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(本文編輯：張苗)

通信作者：卜淑蕊，Email: 18930819609@163.com

(收稿日期：2015-11-10)