胡元春　河南省新鄉(xiāng)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心　453000

豬圓環(huán)病毒地方株的分離與測(cè)定

胡元春河南省新鄉(xiāng)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心453000

豬圓環(huán)病毒病 （PCVD）是由豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）引起的豬傳染性疾病，該病的主要特征為患豬體質(zhì)下降、消瘦、貧血、黃疸、生長(zhǎng)發(fā)育不良、腹瀉、呼吸困難和母豬繁殖障礙。豬圓環(huán)病毒是目前發(fā)現(xiàn)的一種最小的哺乳動(dòng)物病毒，包括兩個(gè)血清型，即PCV1和PCV2，其中PCV2有致病性。

現(xiàn)有6份臨床癥狀疑似PCVD的病毒料，需要分離病毒，建立PCR及ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)。

1　材料與方法

（1）試驗(yàn)材料。試驗(yàn)病料來自不同地區(qū)疑似被PCV2感染豬的肺、淋巴結(jié)和肝等器官的組織病料。試驗(yàn)試劑及主要儀器有胰酶、D-hanks液PCR擴(kuò)增儀、低溫高速離心機(jī)、臺(tái)式離心機(jī)、電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)。

（2）試驗(yàn)方法。細(xì)胞培養(yǎng)于37℃、5%CO2的環(huán)境中。細(xì)胞生長(zhǎng)液為含8%血清的DMEM培養(yǎng)液，維持液為含4%的DMEM培養(yǎng)液。2天傳代1次。將病料組織剪碎，用Hanks液研磨并制成5～10倍乳懸液反復(fù)凍融，離心 0.22μm微孔過濾后-20℃保存。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿50%～70%左右，將處理好的病毒上清液滴入細(xì)胞瓶?jī)?nèi)，在37℃、5%CO2培養(yǎng)半小時(shí)，倒掉病毒液，然后加入4%DMEM維持液。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，細(xì)胞傳代方法操作換8%DMEM維持液，盲傳3代，未出現(xiàn)細(xì)胞病變。含有病毒液的細(xì)胞瓶存放于-20℃冰柜中，凍融3次后，收取病毒液密封凍存于-20℃?zhèn)溆?。從病毒液上清中提取DNA，加入PCR反應(yīng)體系中。體系為25μl。上游引物P1：5’-TTCGGTACCAGCTATGACGTATCCAAG-3’；下游引物P2：5’-GCCAAGCTTTCACTTCGTAATGGTTTT-3’；片段751bp。94℃ 3分鐘，94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 1分鐘，循環(huán)35次。72℃最后延伸10分鐘。

本實(shí)驗(yàn)按照參考文獻(xiàn)的方法介紹，處理待測(cè)樣品。用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)OD值。

2　結(jié)果與分析

樣品在1%瓊脂糖凝膠電泳后，得到750bp左右的特異性核苷酸片段，與實(shí)驗(yàn)預(yù)期結(jié)果一致。實(shí)驗(yàn)病毒料的OD值與陰性樣本的OD值之比為2∶7，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽性，與實(shí)驗(yàn)預(yù)期結(jié)果一致。

3　討論

仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）和多種疫病都與PCV2相關(guān)聯(lián)?，F(xiàn)在主要應(yīng)用PCR等分子生物學(xué)方法診斷PCV2，因此對(duì)不同地區(qū)來源的PCV2毒株基因組序列確定其基因序列變異程度，可以為建立有效的PCV研究方法提供依據(jù)。

PCV2單獨(dú)感染時(shí)的癥狀和病變并無特征性，必須借助實(shí)驗(yàn)室手段才能進(jìn)行確診。目前研究較多的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)有間接免疫熒光（IFA）、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、免疫過氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)（IPMA）、單克隆抗體以及多種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)等。與傳統(tǒng)方法相比，PCR具有較高的敏感性和特異性，而且操作簡(jiǎn)便，是最常見的診斷方法。本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果為陽性，初步鑒定該病毒為豬圓環(huán)病毒。但有關(guān)該病毒料的其他一些生物學(xué)特性尚待進(jìn)一步鑒定。