陳翠 蔡麗敏 王永晨

黑素瘤與DNA甲基化研究進(jìn)展

陳翠 蔡麗敏 王永晨

黑素瘤作為一種侵襲性強(qiáng)的皮膚惡性腫瘤，在發(fā)病率和死亡率方面都在上升，目前仍缺乏較為有效的治療手段。近年來，隨著人們對(duì)黑素瘤認(rèn)識(shí)的逐漸深入，黑素瘤的表觀遺傳學(xué)修飾特別是在DNA甲基化方面的研究也受到廣泛關(guān)注。DNA甲基化在腫瘤細(xì)胞中的改變相對(duì)較常見，包括黑素瘤細(xì)胞。因此，DNA甲基化相關(guān)基因可以作為黑素瘤早期篩查、診斷、預(yù)后、治療分期以及治療后監(jiān)測的生物標(biāo)記。

黑色素瘤；DNA甲基化；后成說，遺傳；分子靶向治療；基因

黑素瘤又稱惡性黑素瘤，是來源于黑素細(xì)胞、惡性程度較高的一種皮膚腫瘤，其轉(zhuǎn)移發(fā)生早、死亡率高，且發(fā)病率和死亡率都在上升［1］。因皮膚癌死亡的人數(shù)中，黑素瘤所占比例高達(dá)70%［2］。在全球范圍內(nèi)，黑素瘤發(fā)生率的增長速度比其他任何腫瘤都要快，特別是處于疾病Ⅳ期的大部分患者都會(huì)在2年內(nèi)死亡，只有少數(shù)能夠長期存活［3］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，黑素瘤的發(fā)生發(fā)展不僅取決于遺傳因素，同時(shí)也受到表觀遺傳修飾尤其是DNA甲基化的影響。DNA甲基化并不涉及DNA堿基序列的改變，其主要是影響DNA與其他分子間的相互作用，并且可以通過細(xì)胞分裂和細(xì)胞增殖的方式進(jìn)行遺傳。

1 DNA甲基化的作用機(jī)制

Esteller［4］發(fā)現(xiàn)，雖然表觀遺傳學(xué)修飾存在多種形式，但到目前為止，DNA甲基化是唯一直接作用于DNA并在多種腫瘤中頻繁發(fā)生的修飾方式。DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的修飾途徑之一，是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化，以S腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，DNA的CG兩個(gè)核苷酸的胞嘧啶被選擇性地添加甲基，形成5甲基胞嘧啶。正常細(xì)胞CpG島通常處于非甲基化或低甲基化狀態(tài)，DNA甲基化主要出現(xiàn)在CpG二核苷酸序列。大量研究表明，DNA甲基化能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而控制基因表達(dá)，并且可以通過細(xì)胞分裂和細(xì)胞增殖進(jìn)行遺傳，常見于基因的5′-CG-3′序列。DNA甲基化會(huì)導(dǎo)致某些區(qū)域DNA構(gòu)象變化，從而影響蛋白質(zhì)與DNA的相互作用，不利于轉(zhuǎn)錄的起始，進(jìn)而導(dǎo)致基因失活。CpG島是指基因組的轉(zhuǎn)錄活性區(qū)富含CpG二核苷酸成高密度聚集狀態(tài)［5］，其特征是同時(shí)存在的多種基因具有腫瘤特異性的CpG島甲基化，位于DNA啟動(dòng)子區(qū)的CpG島甲基化在腫瘤細(xì)胞中較常見，包括黑素瘤細(xì)胞［6］。Baylin 和 Jones［7］研究發(fā)現(xiàn)，在正常組織中，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶被抑制，而在腫瘤細(xì)胞中，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活化可引起表觀遺傳學(xué)改變。由于DNA甲基化引起腫瘤抑制基因轉(zhuǎn)錄失活，在許多人腫瘤中都能夠被發(fā)現(xiàn)，因此有人提出這種機(jī)制在黑素瘤進(jìn)展中起著主要作用［8］。

作者單位：150001 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科

2 黑素瘤與DNA甲基化

2.1 腫瘤壞死因子超家族（TNFRSF）10D基因：Gudrun等發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化可能會(huì)使某些基因發(fā)生不可逆的沉默，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。TNFRSF10D 屬于 TNFRSF 中的一員［9］。Bonazzi等［10］利用PCR熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)，TNFRSF10D基因的異常與黑素瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),他們的研究表明，72%黑素瘤患者的腫瘤細(xì)胞中，TNFRSF10D基因不表達(dá)相應(yīng)的mRNA，該基因的啟動(dòng)子區(qū)甲基化與其轉(zhuǎn)錄呈負(fù)相關(guān)。TNFRSF10D基因所編碼的蛋白質(zhì)是TNFRSF中的一員，這個(gè)受體超家族含有TNF相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體結(jié)構(gòu)域和一個(gè)胞質(zhì)死亡結(jié)構(gòu)域。Sheikh 和 Fornace［11］研究發(fā)現(xiàn)，TNF 受體并不能直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而是通過在TNF相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡機(jī)制中發(fā)揮作用。但需進(jìn)一步的研究來闡明TNFRSF10D基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與黑素瘤的預(yù)后以及侵襲性的關(guān)系。此外，還需深入研究黑素瘤患者血清樣本中該基因的甲基化是否可以成為黑素瘤預(yù)后不良的指標(biāo)。

2.2 p16ink4A 基因:Venza 等［12］發(fā)現(xiàn)，表觀遺傳學(xué)修飾是影響基因表達(dá)的常見障礙，而DNA5′端甲基化是p16ink4A基因失活的主要機(jī)制。研究表明，p16ink4A作為一種腫瘤抑制基因，能夠誘導(dǎo)一個(gè)依賴CDK4/6的自主衰老程序，在細(xì)胞周期蛋白D-CDK4/6-pRb-E2F細(xì)胞周期調(diào)節(jié)途徑中起負(fù)反饋?zhàn)饔?。在黑素瘤?xì)胞中，p16ink4A基因由于啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化而喪失了這種能力，導(dǎo)致這種調(diào)節(jié)途徑失控使細(xì)胞過度增殖，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。大量黑素瘤患者樣本顯示，該基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化能導(dǎo)致染色體結(jié)構(gòu)紊亂和轉(zhuǎn)錄基因沉默，從而引起基因表達(dá)失活［13］。DNA甲基化抑制劑地西他濱屬于核苷酸抑制劑，其能夠使失活的p16ink4A基因重新活化，有學(xué)者提出，該類藥物可能成為治療黑素瘤較為有效的藥物［14-16］，但是缺乏足夠的數(shù)據(jù)來證明針對(duì)p16ink4A為治療靶點(diǎn)的有效性。

2.3 胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白（IGFBP）7基因:IGFBP7屬于IGFBP家族成員，是由腫瘤抑制基因表達(dá)，可能是通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞衰老等機(jī)制抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究表明，皮膚黑素瘤中IGFBP7的表達(dá)受到抑制，而DNA啟動(dòng)子區(qū)CpG島異常甲基化可導(dǎo)致癌基因沉默。IGFBP7在多數(shù)人腫瘤中表達(dá)下調(diào)。對(duì)人體組織樣本的分析表明，IGFBP7的表達(dá)沉默是導(dǎo)致黑素瘤發(fā)生的關(guān)鍵步驟。Wajapeyee等［17］在研究小鼠黑素瘤動(dòng)物模型時(shí)，發(fā)現(xiàn)IGFBP7能夠抑制黑素瘤的生長，推測IGFBP7在轉(zhuǎn)移性腫瘤的治療中起作用。使用DNA甲基化抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷處理黑素瘤細(xì)胞后，可使IGFBP7的mRNA和蛋白表達(dá)恢復(fù)，證明IGFBP7表達(dá)的恢復(fù)與該基因的啟動(dòng)子區(qū)去甲基化有一定相關(guān)性，因此認(rèn)為，5-氮雜-2-脫氧胞苷在黑素瘤的治療有一定的前景。另外，一些研究發(fā)現(xiàn)，正常黑素細(xì)胞會(huì)通過旁分泌或自分泌表達(dá)低水平的IGFBP7，并通過抑制BRAF-MEK-ERK通路信號(hào)來調(diào)控細(xì)胞增殖，而在黑素瘤細(xì)胞中IGFBP7表達(dá)缺失，該通路無法被IGFBP7抑制，因而細(xì)胞增殖失控進(jìn)展為惡性腫瘤。

2.4 H11/HspB8基因:是一種具有特殊功能的小熱休克蛋白（Hsp），雖然其保留著小Hsp的α晶狀體球蛋白特性，但在生物學(xué)和功能性質(zhì)方面卻與典型的Hsp家族成員不同。Smith等［18］首先在實(shí)驗(yàn)室克隆了這種蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其能夠誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞和心肌細(xì)胞增殖，但在黑素瘤細(xì)胞中會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯。H11/HspB8在正常黑素細(xì)胞中是一種生長調(diào)節(jié)劑，在大部分黑素瘤細(xì)胞中，該基因由于甲基化而沉默。研究表明，H11/HspB8基因表達(dá)恢復(fù)后會(huì)通過激活依賴TAK-1死亡通路的機(jī)制來抑制黑素瘤細(xì)胞的生長，H11/HspB8能激活死亡通路的這種能力，使得其能夠成為一種新的治療靶點(diǎn)［19］。H11/HspB8基因啟動(dòng)區(qū)含有豐富的CpG島，5雜氮胞苷作為一種甲基化抑制劑，其誘導(dǎo)黑素瘤細(xì)胞死亡的程度與H11/HspB8甲基化水平密切相關(guān)。因此，H11/HspB8甲基化可以作為5雜氮胞苷治療黑素瘤療效的潛在標(biāo)記。

2.5 PTEN基因:PTEN基因（gene of phosphate and tension homology deleted on chromosome ten，PTEN）是一種腫瘤抑制基因，定位于第10號(hào)染色體的q23.3區(qū)，其編碼的蛋白質(zhì)是通過負(fù)性調(diào)控PKB/Akt通路來發(fā)揮細(xì)胞周期調(diào)控和抑制細(xì)胞凋亡的功能。Li等［20］認(rèn)為，PTEN基因CpG島異常甲基化是該基因失活的一種替代機(jī)制，并在多種類型的腫瘤中均會(huì)發(fā)生，如肺癌、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌、腦瘤、宮頸癌及黑素瘤。Alireza等［21］利用甲基化抑制劑5雜氮胞苷來處理黑素瘤細(xì)胞后，PTEN蛋白的表達(dá)相應(yīng)增加，進(jìn)而抑制細(xì)胞周期和促進(jìn)細(xì)胞凋亡。雖然在黑素瘤細(xì)胞中PTEN基因突變率很低，但是63%原發(fā)性黑素瘤患者PTEN蛋白表達(dá)缺失。與之截然相反的是，在黑素細(xì)胞痣患者中只有8%表達(dá)缺失［22］。因此，甲基化后失活的PTEN基因可以成為黑素細(xì)胞痣向黑素瘤進(jìn)展的一個(gè)重要標(biāo)志。

2.6 其他相關(guān)基因:鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1（V-rafmurine sarcoma viraloncogene homolog B1，BRAF）基因突變在惡性黑素瘤很常見，并且BRAF抑制劑在治療因BRAF基因突變引起的惡性黑素瘤中取得了較好的臨床療效［23］。但Wang等［24］發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)患者最終會(huì)出現(xiàn)藥物抵抗，并在對(duì)BRAF抑制劑抵抗的細(xì)胞中表皮生長因子受體基因因甲基化而表達(dá)上調(diào)，他們研究顯示，表皮生長因子受體抑制劑在治療對(duì)BRAF抑制劑抵抗的黑素瘤患者也有效。MITF基因在黑素瘤細(xì)胞中屬于一種系列特異性腫瘤基因，這種基因的擴(kuò)增與黑素瘤的預(yù)后不良有關(guān)。Lauss等［25］認(rèn)為，MITF基因的表達(dá)被DNA甲基化所控制，并且這種甲基化狀態(tài)對(duì)了解黑素瘤發(fā)生發(fā)展起根本性作用。三重基序蛋白（tripartite motif protein，TRIM）16屬于三重基序蛋白家族中的一員。Sutton等［26］研究發(fā)現(xiàn)，由于DNA甲基化與蛋白穩(wěn)定性變小，與正常黑素細(xì)胞相比TRIM16蛋白表達(dá)在黑素瘤細(xì)胞中明顯減少，并且首次提出TRIM16基因可以作為黑素瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的標(biāo)記和新的治療靶點(diǎn)。Hallberg等［27］研究發(fā)現(xiàn)，在晚期黑素瘤中，轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白2A（TFAP2A）基因啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化會(huì)促使該基因沉默。Zeng等［28］研究表明，在乳腺癌細(xì)胞中，TFAP2A基因可以通過抑制CpG島甲基化而被甲基化抑制劑重新激活，因此，TFAP2A可以成為一種臨床相關(guān)生物標(biāo)記物來評(píng)估表觀遺傳學(xué)藥物對(duì)轉(zhuǎn)移性黑素瘤的藥效。

3 結(jié)語

黑素瘤的治療選擇少且療效不理想，因此，更好地理解腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制來提高治療策略是迫切的。DNA甲基化可以作為一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)，因?yàn)镈NA啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化在腫瘤細(xì)胞中的改變相對(duì)較常見，包括黑素瘤細(xì)胞。因甲基化而沉默的基因幾乎參與了引起腫瘤發(fā)生發(fā)展的所有關(guān)鍵路徑，因而可作為疾病早期篩查、診斷、預(yù)后、治療分期以及治療后監(jiān)測的生物標(biāo)記［29］。

［1］van den Hurk K,Niessen HE,Veeck J,et al.Genetics and epigenetics of cutaneous malignant melanoma:a concert out of tune［J］.Biochim Biophys Acta,2012,1826（1）:89-102.DOI:10.1016/j.bbcan.2012.03.011.

［2］Kudchadkar RR,Smalley KS,Glass LF,et al.Targeted therapy in melanoma ［J］.Clin Dermatol,2013,31 （2）:200-208.DOI:10.1016/j.clindermatol.2012.08.013.

［3］Gershenwald JE,Soong SJ,Balch CM,et al.2010 TNM staging system for cutaneous melanoma...and beyond ［J］.Ann Surg Oncol,2010,17 （6）:1475-1477.DOI:10.1245/s10434-010-0986-3.

［4］Esteller M.Cancer epigenomics:DNA methylomes and histonemodification maps ［J］.Nat Rev Genet,2007,8 （4）:286-298.DOI:10.1038/nrg2005.

［5］Johnson C,Warmoes MO,Shen X,et al.Epigenetics and cancer metabolism［J］.Cancer Lett,2015,356（2 Pt A）:309-314.DOI:10.1016/j.canlet.2013.09.043.

［6］Schinke C,Mo Y,Yu Y,et al.Aberrant DNA methylation in malignant melanoma ［J］.Melanoma Res,2010,20 （4）:253-265.DOI:10.1097/CMR.0b013e328338a35a.

［7］Baylin SB,Jones PA.A decade of exploring the cancer epigenome-biological and translational implications［J］.Nat Rev Cancer,2011,11（10）:726-734.DOI:10.1038/nrc3130.

［8］Howell PM,Liu S,Ren S,et al.Epigenetics in human melanoma［J］.Cancer Control,2009,16（3）:200-218.

［9］Ratzinger G,Mitteregger S,Wolf B,et al.Association of TNFRSF10D DNA-methylation with the survival of melanoma patients ［J］.Int J Mol Sci,2014,15 （7）:11984-11995.DOI:10.3390/ijms150711984.

［10］Bonazzi VF,Nancarrow DJ,Stark MS,et al.Cross-platform array screening identifies COL1A2,THBS1,TNFRSF10D and UCHL1 as genes frequently silenced by methylation in melanoma［J/OL］.PLoS ONE,2011,6 （10）:e26121.［2011-10-20］.http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0026121.DOI:10.1371/journal.pone.0026121.

［11］Sheikh MS,Fornace AJ.Death and decoy receptors and p53-mediated apoptosis［J］.Leukemia,2000,14（8）:1509-1513.

［12］Venza M,Visalli M,Biondo C,et al.Epigenetic regulation of p14ARF and p16INK4A expression in cutaneous and uveal melanoma［J］.Biochim Biophys Acta,2015,1849（3）:247-256.DOI:10.1016/j.bbagrm.2014.12.004.

［13］Kovatsi L,Leda K,Georgiou E,et al.p16 promoter methylation in Pb2+-exposed individuals［J］.Clin Toxicol （Phila）,2010,48（2）:124-128.DOI:10.3109/15563650903567091.

［14］Sigalotti L,Covre A,Fratta E,et al.Epigenetics of human cutaneous melanoma:setting the stage for new therapeutic strategies ［J］.J Transl Med,2010,8:56.DOI:10.1186/1479-5876-8-56.

［15］Landreville S,Agapova OA,Matatall KA,et al.Histone deacetylase inhibitors induce growth arrest and differentiation in uveal melanoma ［J］.Clin Cancer Res,2012,18 （2）:408-416.DOI:10.1158/1078-0432.CCR-11-0946.

［16］Venza I,Visalli M,Oteri R,et al.Class II-specific histone deacetylase inhibitors MC1568 and MC1575 suppress IL-8 expression in human melanoma cells［J］.Pigment Cell Melanoma Res,2013,26（2）:193-204.DOI:10.1111/pcmr.12049.

［17］Wajapeyee N,Serra RW,Zhu X,et al.Oncogenic BRAF induces senescence and apoptosis through pathways mediated by the secreted protein IGFBP7［J］.Cell,2008,132（3）:363-374.DOI:10.1016/j.cell.2007.12.032.

［18］ Smith CC,Li B,Liu J,et al.The Levels of H11/HspB8 DNA methylation in human melanoma tissues and xenografts are a critical molecular marker for 5-Aza-2′-deoxycytidine therapy［J］.Cancer Invest,2011,29 （6）:383-395.DOI:10.3109/07357907.2011.584588.

［19］Smith CC,Lee KS,Li B,et al.Restored expression of the atypical heat shock protein H11/HspB8 inhibits the growth of genetically diverse melanoma tumors through activation of novel TAK1-dependent death pathways ［J］.Cell Death Dis,2012,3:e371.DOI:10.1038/cddis.2012.108.

［20］Li J,Gong P,Lyu X,et al.Aberrant CpG island methylation of PTEN is an early event in nasopharyngeal carcinoma and a potential diagnostic biomarker ［J］.Oncol Rep,2014,31 （5）:2206-2212.DOI:10.3892/or.2014.3061.

［21］Mirmohammadsadegh A,Marini A,Nambiar S,et al.Epigenetic silencing of the PTEN gene in melanoma ［J］.Cancer Res,2006,66（13）:6546-6552.DOI:10.1158/0008-5472.CAN-06-0384.

［22］ Tsao H,Mihm MC,Sheehan C.PTEN expression in normal skin,acquired melanocytic nevi,and cutaneous melanoma ［J］.J Am Acad Dermatol,2003,49 （5）:865-872.DOI:10.1016/S0190-9622(03)02473-3.

［23］Hauschild A,Grob JJ,Demidov LV,et al.Dabrafenib in BRAF-mutated metastatic melanoma:a multicentre,open-label,phase 3 randomised controlled trial［J］.Lancet,2012,380（9839）:358-365.DOI:10.1016/S0140-6736（12）60868-X.

［24］ Wang J,Huang SK,Marzese DM,et al.Epigenetic changes of EGFR have an important role in BRAF inhibitor-resistant cutaneous melanomas［J］.J Invest Dermatol,2015,135（2）:532-541.DOI:10.1038/jid.2014.418.

［25］Lauss M,Haq R,Cirenajwis H.Genome-Wide DNA methylation analysis in melanoma reveals the importance of CpG methylation in MITF regulation［J］.J Invest Dermatol,2015,135（7）:1820-1828.DOI:10.1038/jid.2015.61.

［26］ Sutton SK,Koach J,Tan O,et al.TRIM16 inhibits proliferation and migration through regulation ofinterferon beta 1 in melanoma cells ［J］.Oncotarget,2014,5 （20）:10127-10139.DOI:10.18632/oncotarget.2466.

［27］Hallberg AR,Vorrink SU,Hudachek DR,et al.Aberrant CpG methylation of the TFAP2A gene constitutes a mechanism for loss of TFAP2A expression in human metastatic melanoma ［J］.Epigenetics, 2014, 9 （12）: 1641-1647. DOI: 10.4161/15592294.2014.988062.

［28］ Zeng L,Jarrett C,Brown K,et al.Insulin-like growth factor binding protein-3 （IGFBP-3）plays a role in the anti-tumorigenic effects of 5-Aza-2′-deoxycytidine （AZA） in breast cancer cells［J］.Exp Cell Res,2013,319 （14）:2282-2295.DOI:10.1016/j.yexcr.2013.06.011.

［29］ Smith E,Ruszkiewicz AR,Jamieson GG,et al.IGFBP7 is associated with poor prognosis in oesophageal adenocarcinoma and is regulated by promoter DNA methylation ［J］.Br J Cancer,2014,110（3）:775-782.DOI:10.1038/bjc.2013.783.

DNA methylation in melanoma

Chen Cui,Cai Limin,Wang Yongchen.Department of Dermatology,First Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150001,China

Melanoma is a highly aggressive malignant cutaneous tumor that has been increasing in incidence and mortality.Effective therapeutic approaches are unavailable currently.With further insights into melanoma,epigenetic modification,especially DNA methylation,in melanoma has drawn extensive attention in recent years.Changes in DNA methylation are relatively common in tumor cells,including melanoma cells.Thus,DNA methylation-related genes may serve as biomarkers for early screening for,as well as diagnosis,prediction of prognosis,staging,treatment,and post-therapeutic surveillance of melanoma.

Melanoma;DNA methylation;Epigenesis,genetic;Molecular targeted therapy;Genes

Wang Yongchen,Email:yongchenwang@163.com

2015-03-15）

黑龍江省博士后科研啟動(dòng)金（LBH-Q14109）

Fund program:Postdoctoral Scientific Research Foundation of Heilongjiang Province of China（LBHQ14109）

10.3760/cma.j.issn.1673-4173.2016.02.019

王永晨，Email:yongchenwang@163.com