王丹 楊盛波 黃進華

DNA羥甲基化在惡性黑素瘤的進展

王丹 楊盛波 黃進華

DNA羥甲基化指在TET蛋白酶家族催化下，將5甲基胞嘧啶氧化成5羥甲基胞嘧啶的過程，是DNA主動去甲基化的關鍵中間步驟，主要通過動態(tài)調節(jié)DNA甲基化水平，影響基因表達。DNA羥甲基化過程可被TET蛋白、三羧酸循環(huán)相關酶、維生素C、微小RNA等多種因素調控。研究發(fā)現，和血液系統(tǒng)惡性腫瘤及多種實體腫瘤類似，惡性黑素瘤中同樣存在5羥甲基胞嘧啶含量降低，DNA羥甲基化調控因素異常等現象，提示DNA羥甲基化可能與惡性黑素瘤的發(fā)生發(fā)展及預后等相關。

黑色素瘤；5-甲基胞嘧啶；DNA甲基化；異檸檬酸脫氫酶；DNA羥甲基化

表觀遺傳學最令人矚目的研究進展之一，是發(fā)現TET（ten-eleven translocation）蛋白可將5甲基胞嘧啶（5mC）氧化成為5羥甲基胞嘧啶（5hmC），該過程即為DNA羥甲基化，可通過動態(tài)調節(jié)DNA甲基化水平，影響基因表達，參與機體生長發(fā)育、自身免疫性疾病及多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展等過程。

1 DNA羥甲基化及其調控

1.1 DNA羥甲基化與DNA主動去甲基化：相對于DNA甲基化過程而言，目前對DNA去甲基化機制仍知之甚少。現已知DNA去甲基化方式分為被動去甲基化和主動去甲基化。被動去甲基化過程是指在細胞分裂過程中，因DNA甲基轉移酶（DNMT）1活性降低或識別能力有限等原因，導致新分裂生成的細胞無法維持原有的甲基化狀態(tài)，而導致DNA甲基化程度降低的過程。DNA主動去甲基化過程不依賴于DNA的復制，在酶的催化作用下，以5mC為起始，逐步轉化為未甲基化的胞嘧啶（C）。研究發(fā)現，哺乳動物中TET蛋白家族在鐵離子（Fe2+）及α酮戊二酸（α-KG）存在的條件下，可將5mC氧化為5hmC，實現DNA羥甲基化。目前認為，以DNA羥甲基化為起始的DNA主動去甲基化，可通過以下兩種機制實現：①氧化去甲基化途徑：5hmC可繼續(xù)在TET酶作用下，逐步氧化成5氟胞嘧啶（5fC）和5胞嘧啶羧基（5caC），生成的5fC和5caC均可被胸腺嘧啶DNA糖苷酶識別，并進一步激活堿基切除修復機制實現C的生成［1］；②脫氨基去甲基化途徑：5hmC可以在活化誘導性胞嘧啶脫氨酶/載脂蛋白BmRNA編輯酶催化多肽樣蛋白的脫氨基作用下轉變?yōu)?羥甲基尿嘧啶（5hmU），5hmU可在胸腺嘧啶DNA糖苷酶啟動的堿基切除修復機制下轉變?yōu)?胞嘧啶。DNA羥甲基化在機體中發(fā)揮作用可能主要通過參與DNA主動去甲基化，從而動態(tài)調節(jié)5mC水平，最終影響基因表達。一般認為，基因調控序列（尤其是啟動子區(qū)域）的甲基化可抑制基因轉錄，反之去甲基化則激活基因轉錄。其次，DNA羥甲基化可能直接通過5hmC來發(fā)揮生物學作用。5hmC被喻為繼5mC之后、基因組中的“第六類堿基”，是另外一種重要的DNA堿基修飾形式，5hmC可能通過取代5mC而解除后者所行使的生物學功能，或自身招募其他效應蛋白來調節(jié)基因轉錄。

作者單位：410013 長沙，中南大學湘雅三醫(yī)院皮膚科

1.2 DNA羥甲基化的調控：DNA羥甲基化過程存在復雜的調控機制，目前認為該過程主要可被TET蛋白、異檸檬酸脫氫酶（IDH）、維生素C、miRNA等多種因素調控。TET蛋白在DNA羥甲基化過程中起關鍵作用。TET蛋白本質上是一種加氧酶，該家族主要包括3個成員：TET1-3，相對應的編碼基因分別位于10q21、4q24、2p13，彼此在羧基末端催化結構域享有高度同源性，均可催化5mC進行氧合修飾合成5hmC［2］。TET1和TET3蛋白中均含有一段保守的CXXC（Cys-Xaa-Xaa-Cys）氨基酸序列，該區(qū)域對密集的非甲基化CpG雙核苷酸有著很強的親和力，可能是其與DNA結合的關鍵部位。由于在進化過程中染色體發(fā)生倒置，TET2的CXXC保守序列位于基因的上游，已演變成為功能較獨立的基因，稱之為CXXC4/5，能結合未甲基化的CpG二核苷酸，可直接與TET2的催化域相互作用［3］。研究表明，CXXC4/5可下調TET2蛋白的表達，并呈劑量依賴性，從而減少 5hmC 的生成［4］。

IDH主要包括IDH1、IDH2兩個成員，可催化異檸檬酸脫氫生成TET酶的關鍵輔因子α-KG。惡性腫瘤中IDH突變不僅使TET酶所需輔因子α-KG減少，而且可增加α-KG的同分異構體2-羥基戊二酸的合成［5］。2-羥基戊二酸可競爭性抑制α-KG與靶蛋白的結合，從而干擾依賴α-KG因子的多種酶的活性，包括TET酶及組蛋白去甲基化酶等［6］。最新研究發(fā)現，三羧酸循環(huán)中另外兩種重要的酶琥珀酸脫氫酶和延胡索酸酯酶的突變可通過類似機制干擾TET酶的活性，且通常高甲基化基因更容易被影響［7-8］。此外，近年研究發(fā)現，生理水平的維生素C極有可能作為TET蛋白活化的輔因子，促進5mC轉化為 5hmC［9］。同樣，miR-125b、miR-29b、miR-29c、miR-101和miR-7等多種miRNA可在轉錄后水平，通過靶向干擾TET mRNA的表達來參與調節(jié)DNA 羥甲基化過程［10］。

2 DNA羥甲基化與皮膚惡性黑素瘤

惡性黑素瘤是一種起源于黑素細胞的腫瘤，惡性程度高，易遠處轉移，在所有皮膚腫瘤中致死率最高。近年研究發(fā)現，惡性黑素瘤中存在5hmC含量降低，以及TET蛋白表達降低、IDH突變、維生素C轉運異常等導致DNA羥甲基化異常的因素，提示DNA羥甲基化可能與惡性黑素瘤的發(fā)生發(fā)展及預后密切相關。

2.1 5-hmC與惡性黑素瘤：近年，多位學者運用免疫組化、免疫熒光等方法比較不同病理分期的惡性黑素瘤及良性痣組織切片中5hmC含量，發(fā)現惡性黑素瘤中5hmC總體含量較良性痣顯著降低［11-13］，并且惡性程度越高，5hmC含量越低［11-12］。研究發(fā)現，5hmC總體含量下降的程度與惡性黑素預后相關指標Breslow深度、局部皮膚潰瘍以及總體生存率等均有明顯的正相關性［11］。淋巴結內良性痣細胞與惡性黑素瘤轉移淋巴組織病理表現高度相似，常規(guī)HE染色切片常難以鑒別。Lee等［14］應用5hmC特異性免疫組化及免疫熒光比較兩者間5hmC含量，發(fā)現惡性黑素瘤轉移淋巴結組織切片中5hmC水平均明顯下降。進一步研究發(fā)現，肢端型、黏膜型等常見的黑素瘤疾病亞型中，5hmC含量較Spitz痣等良性痣明顯降低。以上研究提示，臨床上對皮膚惡性黑素瘤組織切片5hmC含量的測定，可有效地指導早期診斷及預后評估。此外，Uchiyama等［13］還發(fā)現，惡性黑素瘤組織無論是否取自光暴露部位，5hmC均表現出相似的低水平，提示5hmC低含量與常見的環(huán)境危險因素紫外線可能無明顯關聯。

Lian等［11］用DNA羥甲基化免疫共沉淀-芯片檢測全基因組DNA羥甲基化狀態(tài)，發(fā)現在惡性黑素瘤全基因組中，無論啟動子、外顯子、內含子還是基因間結構中均可見到5hmC含量較低。KEGG pathway數據庫分析顯示，羥甲基化差異基因多涉及細胞間粘著連接、Wnt信號通路、腫瘤相關信號通路、黑素合成等信號通路。Gene Ontology數據庫顯示，羥甲基化異常改變的基因多與基因轉錄調節(jié)、細胞代謝、發(fā)育等內容相關。

2.2 TET與惡性黑素瘤：TET2在多種血液系統(tǒng)惡性腫瘤中存在突變，部分TET2突變導致該酶表達下調或失活［15］。Lian 等［11］用反轉錄 PCR 研究發(fā)現，在惡性黑素瘤中TET1、2、3表達均明顯下調，且TET2下降最明顯。Gambichler等［12］用免疫組化方法研究發(fā)現，TET2的表達量在不同病理分期惡性黑素瘤中均顯著降低，且腫瘤惡性程度越高，TET2表達水平越低，同時5hmC含量越低。提高體外惡性黑素瘤細胞A2058中TET2表達可有效地提高其全基因組5hmC含量，分析發(fā)現，5hmC含量顯著改善的基因多與細胞間信息傳遞、基因表達調控等相關，用TET2過表達的A2058細胞構建裸鼠移植瘤模型，發(fā)現TET2過表達可明顯抑制移植瘤體的生長［11］。Song等［16］復制了與惡性黑素瘤危險度相關的13個基因位點，單核苷酸多態(tài)性研究發(fā)現，其中名為rs4698934的核苷酸，位于TET2內含子的第106139387個位點上，部分患者該位點發(fā)生突變，因此，TET2該位點的突變可能與惡性黑素瘤發(fā)生相關。

2.3 IDH與惡性黑素瘤：IDH1/2已被證明在多種血液系統(tǒng)惡性腫瘤及實體腫瘤中存在突變，且常伴有 2-HG 表達的異常上調［15］。Shibata 等［17］發(fā)現，惡性黑素瘤中IDH1/2突變率可高達10%，且常伴有原癌基因BRAF和KIT基因的突變。研究發(fā)現，惡性黑素瘤中IDH2蛋白的表達也顯著下調，但IDH1蛋白的表達變化并不明顯［11-12］。在斑馬魚黑素瘤模型中，提高IDH2的表達，不僅可逆轉5-hmC的低表達，而且能有效延長其無瘤生存期［11］。提示IDH基因突變等其他因素可能導致IDH蛋白的表達下調或者功能異常，參與惡性黑素瘤的發(fā)生。

近年來體外實驗研究發(fā)現的多種IDH1和IDH2特異性抑制劑，均可有效地減少2-HG的產生，并誘導細胞正常分化，逆轉腫瘤的惡性傾向［15］。為研發(fā)特異性改善異常DNA羥甲基化的藥物提供更多可能性，不僅給惡性黑素瘤，更為各種惡性腫瘤的靶向治療帶來了希望。

2.4 維生素C與惡性黑素瘤：體外培養(yǎng)惡性黑素瘤細胞中鈉依賴性維生素C轉運受體表達顯著下調，補充生理劑量維生素C可提高惡性黑素瘤細胞中5hmC的含量，并有效抑制其惡性轉化［9］。

3 結語

雖然惡性黑素瘤中，全基因組5-hmC缺少已經比較明確，但具體基因如細胞周期調節(jié)基因、凋亡相關基因等特異性DNA羥甲基化異常尚待進一步研究。多種逆轉DNA羥甲基化異常的特異性抑制劑及補充維生素C等手段，目前僅被證明在體外實驗中發(fā)揮作用。開展更多更深入的研究認識DNA羥甲基化在惡性黑素瘤中的作用及具體機制，將有助于惡性黑素瘤的診斷與治療。

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DNA hydroxymethylation in malignant melanoma

Wang Dan,Yang Shengbo,Huang Jinhua.Department of Dermatology,Third Xiangya Hospital,Central South University,Changsha 410013,China

DNA hydroxymethylation refersto a chemicalmodification processin which 5-methylcytosine （5mC） is converted to 5-hydroxymethylcytosine （5hmC） by the ten-eleven translocation （TET）protein family.This conversion is an important intermediate step in active DNA demethylation,which can influence gene expressions by dynamically regulating DNA methylation levels.DNA hydroxymethylation can be modulated by TET proteins,the Krebs cycle-related enzymes,vitamin C,miRNAs,etc.Like patients with hematological malignancies or other solid cancers,those with cutaneous malignant melanoma have been reported to have decreased 5-hydroxymethylcytosine levels and abnormal DNA hydroxymethylation,hinting that DNA hydroxymethylation is related to the occurrence,development and prognosis of cutaneous malignant melanoma.

Melanoma;5-Methylcytosine;DNA methylation;Isocitratedehydrogenase;DNA hydroxymethylation

Jinhua Huang,Email:huangjinhua60@126.com

2015-04-27）

10.3760/cma.j.issn.1673-4173.2016.02.018

黃進華，Email:huangjinhua60@126.com

本文主要縮寫：5mC：5甲基胞嘧啶，5hmC：5羥甲基胞嘧啶，DNMT：DNA甲基轉移酶，α-KG：α酮戊二酸，5fC：5氟胞嘧啶，5caC：5胞嘧啶羧基，5hmU：5羥甲基尿嘧啶，IDH：異檸檬酸脫氫酶