譚 陽，尹 銳，徐亞維

(吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院生物工程學(xué)院，吉林 吉林 132101)

結(jié)核分枝桿菌不同RNA提取方法的對比

譚 陽，尹 銳，徐亞維

(吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院生物工程學(xué)院，吉林 吉林 132101)

分別采用玻璃珠處理法、超聲破碎和甲醇裂解法對結(jié)核菌細(xì)胞壁處理后進(jìn)行提取。結(jié)果表明：甲醇裂解法提取的RNA濃度和純度較高，完整性也最好。玻璃株法次之，超聲波法有降解。雖然三種方法提取的RNA都能直接用于下一步實(shí)驗(yàn)操作，但甲醇裂解法效果更好。

結(jié)核桿菌；RNA；提取

結(jié)核桿菌是引起人畜共患傳染病結(jié)核病的主要病原菌，可通過空氣和畜產(chǎn)品等途徑傳給人或其他動物，尤其是牛結(jié)核病不但會給畜牧業(yè)帶來嚴(yán)重影響，也威脅人類健康[1]。由于傳統(tǒng)檢測結(jié)核病診斷方法的局限性，不利于快速準(zhǔn)確地診斷肺結(jié)核及其療效，急需開發(fā)快速準(zhǔn)確的檢測方法[2]。

近年來，分子診斷技術(shù)為結(jié)核桿菌檢測開辟了一條新路，如環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增檢測技術(shù)、RNA恒溫擴(kuò)增技術(shù)、基因芯片技術(shù)等。但這些技術(shù)的應(yīng)用都是以獲得高質(zhì)量結(jié)核桿菌的DNA和RNA為前提，而結(jié)核分枝桿菌的mRNA半衰期極短，細(xì)胞壁脂質(zhì)含量又很高且細(xì)胞壁裂解困難，這些加大了結(jié)核分枝桿菌RNA提取的難度[3]。本研究分別采用玻璃珠處理法、超聲破碎法和甲醇裂解法對結(jié)核菌細(xì)胞壁處理后進(jìn)行提取，探討三種方法對結(jié)核分枝桿菌RNA提取的效果，以期獲得一種簡單、高效的結(jié)核分枝桿菌RNA提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

結(jié)核分枝桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株(吉林市結(jié)核病防治研究所)；Trizol試劑(Invitrogen)；直徑0.5mm玻璃珠(美國Sigma)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 結(jié)核分枝桿菌菌懸液的制備

取H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株，接種于改良羅氏培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)28～42d[4]。稱取9份濕重約30mg的H37Rv標(biāo)本，分別標(biāo)記為玻璃珠法、超聲波法和甲醇裂解法，每組設(shè)三個平行對照。

1.2.2 結(jié)核分枝桿菌總RNA的提取前處理

各加入1 mL Trizol 后渦旋振蕩混勻，分別用三種破壁方法進(jìn)行前處理。玻珠法加玻珠0.2 g，靜止5 min；超聲波法先-80℃放置10 min，沸水速融后240 W超聲波處理3次，每次3 min，間歇15 s；分別加入200 μL氯仿，渦旋振蕩1 min，冰置10 min。甲醇裂解法加入1 mL新配置的氯仿甲醇溶液(氯仿∶甲醇=3∶1)，渦旋振蕩1 min，冰置10 min[5]。

1.2.3 結(jié)核分枝桿菌總RNA的提取

4℃，12 000×g離心15 min，取上層水相加入等量的異丙醇混勻，-20℃靜置1 h。4℃，10 000×g離心10 min棄上請，70%乙醇洗2次，干燥后加DEPC水溶解。

1.2.4 結(jié)核分枝桿菌總RNA鑒定

取5 μL RNA樣品進(jìn)行1%的變性瓊脂糖凝膠檢測，判斷RNA的完整性；并取1.5 μLRNA樣品用快速微量紫外測定儀測定RNA的濃度和純度。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)核分枝桿菌RNA的濃度和純度檢測

由表1可知，三種方法均能獲得一定濃度的RNA。其中甲醇裂解法提取的RNA濃度最高，為115.05 ng/μL，其OD260/280值甲醇裂解法最好，在1.9～2.0，OD260/230在2.0～2.3，說明此法提取的樣品中，蛋白質(zhì)、鹽類等基本去除干凈。其次為玻璃珠法，超聲波法提取的RNA濃度最低，可能是產(chǎn)生了熱量影響了RNA得率。

表1 三種方法提取結(jié)核分枝桿菌總RNA濃度和純度測定Tab.1 Three extraction methods on total RNA concentration and purity determination from mycobacterium tuberculosis

2.2 結(jié)核分枝桿菌RNA的完整性檢測

采用1%變性瓊脂糖凝膠電泳對提取的結(jié)核分枝桿菌RNA進(jìn)行完整性檢測，圖1中三種方法均看到了23SrRNA、16SrRNA和5SrRNA三條帶，但超聲法中條帶發(fā)生彌散現(xiàn)象，說明高熱量導(dǎo)致RNA降解；而甲醇裂解法條帶更明亮清晰，且23S近乎16S條帶濃度的2倍，說明RNA較完整，無降解現(xiàn)象。玻璃珠法雖不如甲醇法好，但也可用于結(jié)核桿菌RNA的提取。

Lane 1: 甲醇裂解法；Lane 2:玻璃珠法；Lane 3:超聲波法 Lane 1: methanolysis method; Lane 2: glass bead method; Lane 3: ultrasonic disruption圖1 三種方法提取的結(jié)核分枝桿菌RNA完整性比較Fig.1 Comparison of the RNA integrity of mycobacterium tuberculosis extracted by three methods

3 結(jié)論

結(jié)核分枝桿菌由于其細(xì)胞壁脂質(zhì)含量高，很難像其他細(xì)菌細(xì)胞一樣用通用的裂解劑將結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞快速裂解。本研究采用三種方法處理結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁，并用Trizol進(jìn)行 RNA提取，結(jié)果超聲波法由于產(chǎn)生較大熱量影響了RNA得率和完整性，玻璃珠法雖不如甲醇裂解法好，但避免了甲醇的毒性。甲醇裂解細(xì)胞壁法提取的結(jié)核分枝桿菌RNA 的得率明顯高于其他兩種方法，因?yàn)榧状寄苎杆偃芙庵|(zhì)，瞬間穿透并破壞結(jié)核分枝桿菌的脂質(zhì)細(xì)胞壁，使細(xì)胞質(zhì)中的RNA釋放[3]。因此，甲醇裂解法和玻璃珠法均可以用于RNA的提取，但甲醇裂解法更好。

[1] Shamim Akhtar，Sampa Sarkar，Abhishek Mishra，Dhiman Sarkar. A method to extract intact and pure RNA from mycobacteria[J]. Analytical Biochemistry，2011，(417)：286-288.

[2] M.D. Bashyam，A.K. Tyagi. An efficient and high yielding method for isolation of RNA from mycobacteria[J]. Biotechniques，1994，(17)：834-836.

[3] 賈紅彥，李自慧，杜博平，等.結(jié)核分枝桿菌總RNA提取方法的比較研究[J].臨床肺科雜志，2012，17(7)：1246-1248.

[4] 羅影殊，高文鳳，黃偌穎，等.不同破壁方法提取結(jié)核分枝桿菌總RNA的比較[J].中國防癆雜志，2013，35(3)：183-186.

[5] 俞埡美，王姍姍，褚麗花，等.適用于結(jié)核分枝桿菌RNA抽提的實(shí)驗(yàn)方法學(xué)研究[J].臨床肺科雜志，2016，21(4)：609-612.

Comparison of different methods of RNA isolation from mycobacterium tuberculosis

TAN Yang, YIN Rui, XU Ya-wei

(School of Bioengineering, Jilin Agricultural Science and Technology College, Jilin 132101, China)

The cell wall ofmycobacteriumtuberculosiswas extracted by glass bead treatment, ultrasonic disruption and methanolysis method respectively. The results showed that the concentration and purity of RNA extracted by methanolysis method was higher and the integrity was the best. Glass bead method was the second and ultrasonic method has the appearance of degradation. Although the three methods of RNA extraction can be directly used in the next step of the experimental operation, methanolysis method is better.

Mycobacteriumtuberculosis; RNA; Extraction

2016-09-15

吉林省科技廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20140101021JC)；微生物學(xué)校級重點(diǎn)學(xué)科項(xiàng)目(吉農(nóng)院合字2015第012號)；大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目(吉農(nóng)院合字2014第023號)

譚陽(1992-)，女，學(xué)士。

徐亞維(1974-)，女，副教授，博士，e-mail：xuyaweilucky@163.com。

R446.5

B

1674-8646(2016)23-0016-02