冀敏 郭新菊

丙型肝炎病毒抗體雙抗原夾心法的臨床研究

冀敏 郭新菊

目的探討丙型肝炎病毒(HCV)抗體雙抗原夾心法的臨床作用。方法190份血液篩查陰性標(biāo)本及190份質(zhì)控血液標(biāo)本,應(yīng)用雙抗原夾心法對(duì)HCV抗體進(jìn)行檢測(cè),分析其檢測(cè)效果。結(jié)果ChironRIBA確認(rèn)試劑檢測(cè)127份HCV抗體陽性標(biāo)本中通過雙抗原夾心法顯示陽性126份,1份陰性,敏感性為99.21%。結(jié)論HCV抗體雙抗原夾心法檢測(cè)具有較高準(zhǔn)確性,敏感性高,值得臨床推廣應(yīng)用。

丙型肝炎病毒抗體；雙抗原夾心法

HCV是在輸血后導(dǎo)致肝炎發(fā)生的一個(gè)重要因素,往往經(jīng)血液或血液制品進(jìn)行傳播,經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn),HCV感染具有世界性分布特點(diǎn),為了能夠避免HCV通過血液進(jìn)行擴(kuò)散,需對(duì)每個(gè)獻(xiàn)血者實(shí)施抗-HCV指標(biāo)檢測(cè)［1］。通常選取間接酶聯(lián)免疫法進(jìn)行檢測(cè),此方法操作時(shí)包被抗原的組成及質(zhì)量具有關(guān)鍵作用［2］。目前對(duì)抗-HCV間接酶聯(lián)免疫法試劑進(jìn)行單獨(dú)檢測(cè)時(shí)顯現(xiàn)陽性,且處于臨界值相鄰樣本,以雙抗原夾心酶聯(lián)免疫法試劑進(jìn)行檢測(cè)時(shí)則呈現(xiàn)陰性,伴隨臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展,雙抗原夾心酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)對(duì)于HCV血清學(xué)診斷具有較為顯著的改善作用,效果明顯［3］。本文選取190份血液篩查陰性標(biāo)本,分析雙抗原夾心法作用,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料 選取本院2012年6月～2014年12月190份血液篩查陰性標(biāo)本,同時(shí)采集190份質(zhì)控血液標(biāo)本。

1.2方法 將所選取的380份血液標(biāo)本進(jìn)行嚴(yán)格檢測(cè),應(yīng)用雙抗原夾心法檢測(cè)HCV抗體。在檢測(cè)時(shí)所應(yīng)用試劑有吉比愛、Ortho丙肝病毒抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑,ChironRIBA確認(rèn)試劑。

1.2.1抗原制備 嵌合表位抗原經(jīng)包涵體的形式表達(dá),采取離子交換層析措施進(jìn)行純化,然后通過SephadexG-50柱凝膠完成過濾采集,應(yīng)用SDS-PAGE將抗原蛋白進(jìn)行仔細(xì)鑒定。

1.2.2雙抗原夾心法 應(yīng)用50 mmol/L碳酸鹽緩沖液對(duì)抗原予以稀釋處理,多肽抗原具體濃度為：結(jié)構(gòu)處多肽151 g/ml,NS4處多肽0.51 g/ml,NS5處多肽0.251 g/ml,所應(yīng)用到的基因工程表達(dá)抗原具體濃度有c7應(yīng)用1 g/ml,C11應(yīng)用1 g/ml。每個(gè)孔內(nèi)均加進(jìn)100 μl,在37℃狀態(tài)中持續(xù)保存1 h,然后放置到4℃冰箱內(nèi)過夜,應(yīng)用30%小牛血清PBST實(shí)施封閉處理,在每個(gè)孔內(nèi)加進(jìn)200 μl,37℃狀態(tài)中保存1 h,然后去除封閉液,應(yīng)用50 μl樣品稀釋液,每個(gè)孔內(nèi)加進(jìn)5 μl,37℃狀態(tài)中保存30 min,然后應(yīng)用PBST進(jìn)行5次沖洗。選擇最為適宜酶稀釋度,通過棋盤滴定方法在每個(gè)孔內(nèi)加進(jìn)50工作濃度的酶標(biāo)記抗原,37℃條件下放置15 min,經(jīng)PBST沖洗5次,每孔加入50 μl底物緩沖液及50 μl顯色劑,在37℃狀態(tài)中保存10 min,使之能夠完全顯色。然后在每個(gè)孔內(nèi)加進(jìn)50 μl 2 mol/L硫酸,停止反應(yīng),應(yīng)用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)條件下實(shí)施吸光度效果檢測(cè),若檢測(cè)結(jié)果≥臨界值者則表示陽性,反之則表示陰性。

2 結(jié)果

應(yīng)用雙抗原夾心法檢測(cè)標(biāo)本,顯示126份為陽性標(biāo)本,1份為陰性標(biāo)本,應(yīng)用ChironRIBA確認(rèn)試劑檢測(cè)顯示其均呈現(xiàn)陽性,雙抗原夾心法檢測(cè)敏感性為99.21%。見表1。

表1 雙抗原夾心法檢測(cè)結(jié)果分析(n)

3 討論

對(duì)患者HCV抗體進(jìn)行檢測(cè)是確定其是否發(fā)生感染的初步階段,主要有用作篩檢工作的酶免疫檢測(cè)(EIA)以及用作確證工作的重組免疫印跡試驗(yàn)(RIBA),其中RIBA由于需要較高費(fèi)用且并未建立嚴(yán)格試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn),目前在臨床診療中并無較多應(yīng)用［4］。由于EIA存在較為明顯的便利性及穩(wěn)定性、自動(dòng)化功能強(qiáng)、價(jià)格較低等優(yōu)點(diǎn),在臨床中應(yīng)用到血液篩查及檢測(cè)工作較為廣泛。目前EIA發(fā)展至第三代,依然實(shí)施間接法予以檢測(cè),因其方法學(xué)存在一定固有缺陷性,極易導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)假陽性及漏檢情況［5］。目前在臨床中將雙抗原夾心ELISA法檢測(cè)試劑作為發(fā)展方向具有較為明顯應(yīng)用價(jià)值,夾心法可使得酶標(biāo)記的特異性抗原將間接法檢測(cè)時(shí)酶標(biāo)記的抗體進(jìn)行取代由此完成整個(gè)檢測(cè),與間接ELISA法進(jìn)行比較,其對(duì)于樣品檢測(cè)存在雙特異性選擇特點(diǎn),可以將血清內(nèi)出現(xiàn)的抗HCV的總抗體完成檢測(cè),有效防止間接ELISA法所存在的檢測(cè)弊端,確保檢測(cè)結(jié)果具有更高的敏感性與特異性,而且因?yàn)镠CV抗原所具有的分子量較小,以酶進(jìn)行HCV抗原的直接性標(biāo)記,往往使得空間位阻情況發(fā)生,導(dǎo)致抗體與抗原無法輕易結(jié)合,存在較為明顯抑制作用,因此HCV抗原的標(biāo)記是建立抗HCV抗體的雙抗原夾心ELISA檢測(cè)方法的一個(gè)較為重要的難點(diǎn)［6］。

在本文研究中,雙抗原夾心法檢測(cè)顯示陽性為126份,陰性為1份,雙抗原夾心法檢測(cè)無需對(duì)血清產(chǎn)品予以稀釋,也不會(huì)因類風(fēng)濕因子等不良因素而受到干擾,存在較為理想的特異性,而且能夠?qū)ρ逯懈鞣N抗體予以檢測(cè),尤其免疫球蛋白M(IgM)類抗體可以明顯減少自病毒感染至應(yīng)用ELISA法檢測(cè)到抗體間的“窗口期”。所以采取雙抗原夾心ELISA法檢測(cè)確保HCV感染診斷試劑存在較高特異性,其檢出率明顯上升,有效縮短檢測(cè)時(shí)間,具有較高臨床推廣應(yīng)用價(jià)值。

［1］李文新.不同方法試劑檢測(cè)丙型肝炎病毒抗體結(jié)果分析.中國輸血雜志,2014,27(6):622-624.

［2］龍宏洋,葉玉芬,朱學(xué)強(qiáng),等.丙型肝炎病原學(xué)不同檢測(cè)方法的臨床應(yīng)用價(jià)值對(duì)比分析.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床,2015,12(5):597-599.

［3］孟慶玲,魯健,邱豐,等.丙型肝炎IgG抗體ELISA診斷試劑比對(duì)分析.中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志,2013,27(3):221-223.

［4］鮮玉萍,楊紅英.丙型肝炎核心抗原檢測(cè)的臨床意義.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床,2012,9(18):2320-2321.

［5］張健,劉宜仲,楊珊,等.HCV核心抗原檢測(cè)在血液篩查中的初步研究.現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2012,27(2):110-111.

［6］趙璐,馮悅,夏雪山.HCV基因型的差異性流行與進(jìn)化.遺傳,2012,34(6):666-672.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.04.013

2015-05-07］

453000 河南省新鄉(xiāng)市婦幼保健院檢驗(yàn)科