陶 智，鄭小利，薛 莎，楊文強(qiáng)，馬 威＊＊

（1.武漢市新洲區(qū)人民醫(yī)院 武漢 431400；2.武漢科技大學(xué)醫(yī)院 武漢 430065；3.武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室 武漢 430030）

不同補(bǔ)腎方對(duì)卵巢摘除術(shù)后骨質(zhì)疏松大鼠Wnt信號(hào)表達(dá)的影響＊

陶 智1，鄭小利2，薛 莎3，楊文強(qiáng)3，馬 威3＊＊

（1.武漢市新洲區(qū)人民醫(yī)院 武漢 431400；2.武漢科技大學(xué)醫(yī)院 武漢 430065；3.武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室 武漢 430030）

目的：比較3種補(bǔ)腎方對(duì)卵巢摘除骨質(zhì)疏松大鼠Wnt通路β-Catenin mRNA表達(dá)的影響。方法：雌性SD大鼠70只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、龜鹿二仙膠組、二仙湯組、補(bǔ)腎活血組、雌二醇組、仙靈骨葆組，每組10只。雙側(cè)卵巢摘除術(shù)復(fù)制骨質(zhì)疏松模型，術(shù)后30天進(jìn)行相應(yīng)的給藥實(shí)驗(yàn)，假手術(shù)組和模型組給予灌服等量的生理鹽水。12周后測定各組大鼠血清中I型膠原羧基端肽（β-Crosslaps）、I型前膠原氨基端延長肽（P1NP）含量；以雙能X線骨密度測定儀測定大鼠股骨的骨密度；用RT-PCR檢測右側(cè)股骨髓LRP5、Wnt2、β-Catenin mRNA表達(dá)，用Western blot方法檢測LRP5、Wnt2、β-Catenin蛋白表達(dá)。結(jié)果：與sham組比較，模型組股骨骨密度、血液PINP濃度、β-Catenin mRNA、LRP5 mRNA、Wnt2 mRNA表達(dá)均顯著降低（P＜0.01），β-Crosslaps濃度顯著增高（P＜0.01）。與模型組比較，3組中藥組骨密度、血液PINP濃度、LRP5 mRNA、β-Catenin mRNA、Wnt2 mRNA及蛋白表達(dá)顯著增高（P＜0.05），血液β-Crosslaps濃度顯著降低（P＜0.01），補(bǔ)腎活血組骨密度及β-Catenin mRNA及蛋白表達(dá)高于其他兩補(bǔ)腎方劑組。結(jié)論：補(bǔ)腎方通過Wnt信號(hào)通路促進(jìn)去卵巢大鼠成骨細(xì)胞增殖而改善骨質(zhì)疏松癥，補(bǔ)腎活血組方效果更為明顯。

骨質(zhì)疏松 雙側(cè)卵巢摘除術(shù) 補(bǔ)腎 補(bǔ)腎活血 Wnt信號(hào) β-連接蛋白

骨質(zhì)疏松癥（Osteoporosis，OP）是以骨組織顯微結(jié)構(gòu)退化，骨量減少，骨脆性增加，骨折危險(xiǎn)性增加的一種全身性骨病，主要臨床表現(xiàn)為疼痛、身長縮短，駝背、骨折等，與中醫(yī)的“骨痿”、“骨痹”相似。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，骨與腎的關(guān)系最為密切，腎虛是骨痿及骨痹的主要病機(jī)，是骨質(zhì)疏松的病機(jī)關(guān)鍵[1]。如《素問·宣明五氣篇》有言：“腎主骨”，《素問·痿論》有言：“腎主身之骨髓”，“腎藏精，主骨生髓，其充在骨”，可見補(bǔ)腎是骨質(zhì)疏松癥治療的關(guān)鍵。本文比較滋補(bǔ)肝腎、滋陰補(bǔ)腎及補(bǔ)腎活血等3種補(bǔ)腎方藥對(duì)卵巢摘除大鼠骨質(zhì)疏松癥療效的差異，并探討其對(duì)Wnt信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠70只，雌性，體質(zhì)量230-270 g，購于湖北省實(shí)驗(yàn)物研究中心[SCXK（鄂）2008-0005]，動(dòng)物合格證編號(hào)：No.42000600000069。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)完成于武漢市第一醫(yī)院SPF動(dòng)物室內(nèi)[SYXK（鄂）2008-0030]，湖北省動(dòng)物設(shè)施使用證編號(hào)：No.00115584。動(dòng)物室溫度20-22℃，濕度40%-70%，12 h-12 h晝夜交替，大鼠喂飼已輻照消毒的維持飼料（北京華阜康公司），自由飲去離子水。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

陽性對(duì)照藥物戊酸雌二醇片（法國DELPHARM Lille S.A.S.公司，批號(hào)：253A）在用前配制成0.02 mg·mL-1水溶液。陽性中藥對(duì)照仙靈骨葆膠囊（貴州同濟(jì)堂制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：1303041）?！褒斅苟赡z”出自《醫(yī)便》，由鹿角膠500 g、龜板膠250 g、人參45 g、枸杞子90 g組成?！岸蓽背鲎粤喉灻吨嗅t(yī)方劑臨床手冊》，由仙茅9 g、仙靈脾9 g、巴戟天9 g、當(dāng)歸9 g、黃柏6 g、知母6 g組成?！把a(bǔ)腎活血方”出自我院名老中醫(yī)管競環(huán)教授經(jīng)驗(yàn)方，由鹿角膠15 g、巴戟天9 g、熟地9 g、續(xù)斷9 g、丹參9 g、黨參9 g組成。上述中藥材均購于湖北天濟(jì)中藥飲片有限公司，按傳統(tǒng)方法煎煮后濃縮為1.0 g·mL-1生藥的水煎液。以上藥液配制后冷藏備用。

1.3 主要試劑與儀器

意大利產(chǎn)GK Vnigamma plus compact雙能X線骨密度儀檢測骨密度；β-Crosslaps及PINP均為羅氏C601電化學(xué)發(fā)光儀電化學(xué)發(fā)光法檢測，試劑（羅氏公司，批號(hào)分別為00172416、 00172419）；引物合成于上海生工，PCR試劑（Fermentas公司）；抗體Wnt2（美國Santa Cruz公司，批號(hào)：SC-50361）、β-actin（美國Santa Cruz公司，批號(hào)：SC-130657）、LRP5（英國Abcam公司，ab187756）、β-catenin（美國Bioworld公司，批號(hào)：BS3603），水合氯醛（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20120116）用于動(dòng)物麻醉，其他手術(shù)器械等。

1.4 實(shí)驗(yàn)步驟

1.4.1 模型制備

上述動(dòng)物隨機(jī)分為2組，造模組60只，行雙側(cè)卵巢摘除術(shù)[2]；假手術(shù)組10只，暴露卵巢組織并摘除卵巢旁脂肪組織。

1.4.2 動(dòng)物分組及藥物干預(yù)治療

造模第31天時(shí)，將造模組60只動(dòng)物按體重分層隨機(jī)分為6組（每組10只），為龜鹿二仙膠組（Guiluerxian Glue Group，GLEX group）、 二 仙湯組（Erxian Decoction Group，EX group）、補(bǔ)腎活血組（BSHX Group）、雌二醇組（Estradiol valerate Group，EV group）、仙靈骨葆組（XLGB Group）、模型組（Model Group），各治療組分別按0.01 mL·g-1劑量給于相應(yīng)的藥物灌胃，模型組及假手術(shù)組（Sham Operation Group） 作為對(duì)照組，分別按0.01 mL·g-1劑量灌胃生理鹽水。連續(xù)給藥12周。

1.4.3 樣本采集

治療結(jié)束后，首先檢測骨密度，然后以10%水合氯醛麻醉，心臟采血后（分離血清備用），灌注生理鹽水300-500 mL，直至流出清亮液體。取右側(cè)股骨骨骺，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 指標(biāo)檢測

1.5.1 骨密度檢測

動(dòng)物麻醉后四肢展開平置于雙能X線吸收測量儀平臺(tái)上進(jìn)行BMD檢測。由華中科技大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科完成檢測。

1.5.2 骨代謝指標(biāo)檢測

血清β膠原特殊序列（β-Crosslaps）、血清I型前膠原氨基端延長肽（Procollagen Type I aminoterminal Propeptide，PINP）含量于武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗(yàn)部檢測。

1.5.3 Wnt2、LRP5及β-catenin mRNA的RT-PCR檢測

參照Trizol說明書提取各組大鼠右側(cè)股骨中骨髓的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后，進(jìn)行RT-PCR，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析儀采集電泳圖像并分析各組條帶灰度，并以β-actin為內(nèi)參照，計(jì)算各指標(biāo)與內(nèi)參的比值作為該指標(biāo)的相對(duì)含量。

1.5.4 Western Blot法 檢 測 Wnt2、LRP5及·-catenin蛋白表達(dá)

組織按1:5比例加入裂解緩沖液，超速勻漿后以10 000 rpm·min-1的速度4℃離心50 min，取上清液；經(jīng)蛋白定量后，調(diào)整使樣本蛋白濃度相同，沸水煮5 min變性；SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印至醋酸纖維素膜上；5%脫脂奶粉封閉；分別加一抗Wnt2（1:1 000）、LRP5（1:3 000）、β-catenin（1:500）、β-actin（1:2 000）4℃過夜；加二抗室溫作用2 h；ECL顯色，以內(nèi)參β-catin含量為參照，用IPP 6.0軟件對(duì)免疫印跡條帶的灰度值（光密度）進(jìn)行半定量分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 各組動(dòng)物股骨骨密度比較

如表1所示，與Sham組比較，Model組股骨BMD顯著降低（P=0.000）；與Model組BMD比較，EV組BMD顯著增高（P=0.003），XLGB組顯著增高（P=0.000），GLEX組顯著增高（P=0.000），EX組顯著增高（P=0.000），BSHX組顯著增高（P=0.000）；與EV組BMD比較，XLGB、GLEX及BSHX組顯著增高（P均為0.000）；與XLGB組比較，EX組顯著降低（P=0.007）；與BSHX組比較，GLEX及EX組顯著降低（P均為0.010）。這說明各治療組均能增加模型動(dòng)物骨密度含量，且補(bǔ)腎活血中藥優(yōu)于龜鹿二仙膠及二仙湯。

2.2 各組骨代謝指標(biāo)比較

如表1所示，與Sham組比較，Model組β-Crosslaps含量顯著增高（P=0.000），PINP含量顯著降低（P=0.048）;與Model組比較，EV組β-Crosslaps顯著降低（P=0.008），XLGB組β-Crosslaps顯著降低（P=0.000），GLEX組β-Crosslaps顯著降低（P=0.001），EX組β-Crosslaps顯 著 降 低（P=0.000），BSHX組β-Crosslaps含量顯著降低（P=0.000），EV組PINP含量顯著增高（P=0.001），XLGB組PINP含量顯著增高（P=0.001），GLEX組PINP含量顯著增高（P=0.000），EX組PINP含量顯著增高（P=0.000），BSHX組PINP含量顯著增高（P=0.005）；與EV組比較，EX組β-Crosslaps含量顯著降低（P=0.002）、BSHX組PINP含量顯著增高（P=0.015）；與XLGB組比較，BSHX組PINP含量顯著增高（P=0.021）；與BSHX組比較，EV組PINP含量顯著降低（P=0.015），GLEX組與BSHX組之間β-Crosslaps沒有差異（P=0.155）。這說明各中藥治療組骨形成（骨膠原合成）增強(qiáng)顯著，其中補(bǔ)腎活血組骨形成作用優(yōu)于二仙湯組，與龜鹿二仙膠組沒有差異。

2.3 股骨Wnt2、LRP5、β-catenin mRNA表達(dá)比較

Wnt2、LRP5及β-catenin mRNA擴(kuò)增的引物序列及退火溫度見表2。經(jīng)35個(gè)循環(huán)擴(kuò)增后結(jié)果如表3所示（圖1），與Sham組比較，Model組Wnt2 mRNA表達(dá)顯著降低（P=0.000），LRP5 mRNA表達(dá)顯著降低（P=0.000），β-catenin mRNA表達(dá)顯著降低（P=0.000）；與Model組比較，EV、XLGB、GLEX、EX及BSHX組Wnt2mRNA表達(dá)均顯著增高（P均為0.000），β-catenin mRNA表達(dá)亦顯著增高（P均為0.000），XLGB、GLEX、EX及BSHX組LRP5mRNA表達(dá)顯著增高（P均為0.000）；與EV組比較，XLGB組Wnt2 mRNA表達(dá)顯著增高（P=0.001），GLEX組Wnt2 mRNA表達(dá)顯著增高（P=0.003），EX組Wnt2 mRNA表達(dá)顯著增高（P=0.001），BSHX組Wnt2 mRNA表達(dá)顯著增高（P=0.000），XLGB組LRP5 mRNA表達(dá)顯著增高（P=0.033），GLEX組LRP5 mRNA表達(dá)顯著增高（P=0.000），EX組LRP5 mRNA表達(dá)顯著增高（P=0.000），BSHX組LRP5 mRNA表達(dá)顯著增高（P=0.000），XLGB組β-catenin mRNA表達(dá)顯著增高（P=0.001），GLEX組β-catenin mRNA表達(dá)顯著增高（P=0.000），EX組β-catenin mRNA表達(dá)顯著增高（P=0.000），BSHX組β-catenin mRNA表達(dá)顯著增高（P=0.000）；與XLGB組比較，BSHX組LRP5及β-catenin mRNA表達(dá)均顯著增高（P=0.000，0.002）；與BSHX組比較，GLEX及EX組LRP5 mRNA表達(dá)顯著降低（P=0.000，0.000）。這說明補(bǔ)腎中藥通過上調(diào)Wnt經(jīng)典通路中部分基因表達(dá)而促進(jìn)骨質(zhì)疏松癥的改善，以補(bǔ)腎活血組最明顯。

表1 各組動(dòng)物BMD，β-Crosslaps，PINP比較（ n=10）（±s）

表1 各組動(dòng)物BMD，β-Crosslaps，PINP比較（ n=10）（±s）

注：與sham組比較，*P＜0.05,**P＜0.01；與model組比較，#P＜0.05,##P＜0.01；與EV組比較，△P＜0.05,△△P＜0.01；與XLGB組比較，▲P＜0.05,▲▲P＜0.01；與BSHX組比較，□P＜0.05,□□P＜0.01。

F value（P） 7.702（0.000） 8.034（0.000） 35.935（0.000）

表2 PCR所檢測基因引物序列

表3 各組動(dòng)物股骨β-catenin、LRP5、Wnt2 mRNA表達(dá)比較（ n=8）（±s）

表3 各組動(dòng)物股骨β-catenin、LRP5、Wnt2 mRNA表達(dá)比較（ n=8）（±s）

注：與Control組比較，P＜0.05,**P＜0.01；與Model組比較，#P＜0.05,##P＜0.01；與EV組比較，△P＜0.05,△△P＜0.01；與XLGB組比較，▲P＜0.05,▲▲P＜0.01；與BSHX組比較，□P＜0.05,□□P＜0.01。

Group Wnt2 β-catenin LRP5 Sham 組 1.03±0.20 1.95±0.16 1.63±0.51 Model組 0.53±0.11** 1.05±0.18** 0.96±0.24**EV組 1.23±0.12## 1.62±0.17## 1.14±0.23 XLGB組 1.50±0.14##△△ 1.82±0.20##△ 1.62±0.19##△△GLEX組 1.48±0.15##△△ 2.06±0.17##△△▲□ 1.91±0.23##△△▲□□EX組 1.52±0.19##△△ 1.96±0.20##△△□ 1.51±0.18##△△□□BSHX組 1.58±0.20##△△ 2.32±0.20##△△▲ 2.63±0.22##△△▲▲F值（P） 44.520（0.000） 32.565（0.000） 30.448（0.000）

圖1 各組β-actin、Wnt2、β-catenin、LRP5 mRNA表達(dá)比較

2.4 股骨Wnt2、LRP5、β-catenin 蛋白表達(dá)比較

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見表4、圖2）顯示，與Sham組比較，Model組Wnt2，β-catenin，LRP5顯著降低（P均為0.000）；與Model組比較，XLGB、GLEX、EX及BSHX組Wnt2蛋白顯著增高（P均為0.000），EV組β-catenin蛋白顯著增高（P=0.002），XLGB、GLEX、EX及BSHX組β-catenin含量顯著增高（P均為0.000），XLGB、GLEX，EX及BSHX組LRP5含量增高（P均為0.000）；與BSHX組比較，GLEX及EX組Wnt2含量顯著降低（P=0.001，0.000），β-catenin含量降低（P均為0.000），LRP5含量亦顯著降低（P均為0.000）。

3 討論

中醫(yī)學(xué)普遍認(rèn)為腎虛為“骨痿”、“骨痹”的根本，其癥狀與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的骨質(zhì)疏松癥相似[3]?！夺t(yī)經(jīng)精義·臟腑所合》有言：“腎藏精，精生髓，髓生骨，故骨者，腎之所合也。髓者，腎精所生，精足則髓足，髓在骨內(nèi)，髓足者骨強(qiáng)”，可見腎與骨的關(guān)系最密切。腎藏精，主骨生髓。骨精充足，骨髓生化有源，骨骼才得以滋養(yǎng)，若腎精虧虛，骨髓失養(yǎng)，則易出現(xiàn)骨質(zhì)疏松。因此，補(bǔ)腎是治療骨質(zhì)疏松癥的關(guān)鍵所在。作為先天之本的腎，如果功能失常，則骨骼失養(yǎng)，行血無力，易形成血瘀；而血瘀使骨髓不能得到滋養(yǎng)，髓少筋枯引發(fā)骨痿（骨質(zhì)疏松）[4]，當(dāng)治以溫腎陽、滋腎陰、活血化瘀。龜鹿二仙膠陰陽并補(bǔ)，氣血兼顧，方中鹿角膠溫腎壯陽益精補(bǔ)血，龜板膠填精補(bǔ)髓滋陰養(yǎng)血，人參補(bǔ)后天脾胃之氣，枸杞子益肝腎，補(bǔ)精血。二仙湯滋陰補(bǔ)腎，方中仙茅、仙靈脾、巴戟天溫腎陽，補(bǔ)腎精；黃柏、知母瀉腎火、滋腎陰；當(dāng)歸溫潤養(yǎng)血，調(diào)理沖任。補(bǔ)腎活血方補(bǔ)腎活血，方中鹿角膠溫補(bǔ)肝腎益精養(yǎng)血，巴戟天、續(xù)斷補(bǔ)腎陽，強(qiáng)筋骨，熟地養(yǎng)陰填精益髓，黨參健脾益氣，丹參活血祛瘀生新。三方相較，龜鹿二仙膠重在陰陽并補(bǔ)，二仙湯在于補(bǔ)瀉結(jié)合，經(jīng)驗(yàn)方在于補(bǔ)腎活血。

表4 各組動(dòng)物股骨β-catenin、LRP5、Wnt2蛋白表達(dá)比較（ n=5）（±s）

表4 各組動(dòng)物股骨β-catenin、LRP5、Wnt2蛋白表達(dá)比較（ n=5）（±s）

注:與Sham組比較，*P＜0.05,**P＜0.01；與Model組比較，#P＜0.05,##P＜0.01；與EV比較，△P＜0.05,△△P＜0.01；與XLGB組比較，▲P＜0.05,▲▲P＜0.01；與BSHX組比較，□P＜0.05,□□P＜0.01。

Wnt2 β-catenin LRP5 Group Sham組 0.858±0.067 0.713±0.094 0.608±0.089 Model組 0.460±0.063** 0.326±0.080** 0.262±0.063**EV組 0.513±0.074 0.543±0.088## 0.362±0.084 XLGB組 0.794±0.105##△△ 0.820±0.083##△△ 0.671±0.098##△△GLEX組 0.836±0.111##△△□□ 0.814±0.082##△△□□ 0.577±0.107##△△□EX組 0.770±0.087##△△□□ 0.672±0.091##△▲□□ 0.547±0.119##△△□BSHX組 1.054±0.124##△△▲▲ 1.099±0.148##△△▲▲ 0.712±0.112##△△F Value（P） 24.507（0.000） 30.651（0.000） 24.507（0.000）

Wnt是一種分泌型、富含半胱氨酸的蛋白，Wnt信號(hào)通路十分保守，在各種生物之間其成員具有高度同源性[5]。研究表明，經(jīng)典wnt/β-catenin信號(hào)途徑在成骨細(xì)胞分化增殖中發(fā)揮重要作用，LRP5作為Wnt的共同受體，Wnt蛋白與其胞外區(qū)結(jié)合，再與Fzd受體結(jié)合形成復(fù)合物而將信號(hào)從胞外傳導(dǎo)至胞內(nèi)，在LRP5功能獲得性突變小鼠G171V中發(fā)現(xiàn)大量成骨細(xì)胞存在，且堿性磷酸酶表達(dá)和礦化能力也隨之增強(qiáng)[6，7]，成骨細(xì)胞膜上的LRP5作為Wnts的輔助受體可以誘導(dǎo)成骨細(xì)胞內(nèi)的一系列信號(hào)傳遞，人類LRP5基因功能獲得性突變可引起骨密度增加，而其功能缺失性突變將引起骨質(zhì)疏松-假神經(jīng)膠質(zhì)瘤綜合征的發(fā)生[8]。β-catenin是Wnt經(jīng)典信號(hào)通路中的關(guān)鍵因子，它在Wnt信號(hào)通路被激活時(shí)與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子（TCG/LET）DNA結(jié)合改變DNA的結(jié)構(gòu)，啟動(dòng)下游靶基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化與增殖。β-catenin基因缺失的動(dòng)物I性膠原、骨鈣素表達(dá)的明顯減少，骨形成和骨礦化能力衰減[9]。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松主要是雌激素缺乏引起的，雌激素缺乏導(dǎo)致對(duì)破骨細(xì)胞有抑制作用減弱；除雌激素受體通路外，它也通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路影響成骨細(xì)胞的增殖與分化。研究顯示在雌激素缺乏的動(dòng)物模型中應(yīng)用雌激素受體阻斷劑后，β-catenin表達(dá)降低，且成骨細(xì)胞標(biāo)志物減少；另外在骨髓基質(zhì)細(xì)胞ST-2體外培養(yǎng)環(huán)境中加入雌激素會(huì)引起骨保護(hù)素蛋白和mRNA表達(dá)增高，繼而抑制破骨細(xì)胞的分化與增殖[10，11]。

圖2 各組β-actin、Wnt2、β-catenin、LRP5 蛋白表達(dá)比較（Western Blot）

本實(shí)驗(yàn)顯示，補(bǔ)腎方對(duì)骨形成有促進(jìn)作用，這從去勢動(dòng)物骨密度增加得到證明；三組補(bǔ)腎方β-catenin、LRP5、Wnt2 mRNA表達(dá)均較模型組顯著增高（P＜0.01），說明均能通過Wnt經(jīng)典通路改善去勢動(dòng)物骨質(zhì)疏松癥狀；補(bǔ)腎活血組骨密度高于二仙湯組和龜鹿二仙膠組（P＜0.05），且作為Wnt經(jīng)典信號(hào)通路關(guān)鍵的β-catenin mRNA表達(dá)亦高于其他兩組（P＜0.01），提示補(bǔ)腎活血方能更好地通過Wnt經(jīng)典通路改善去勢大鼠骨質(zhì)疏松癥。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果僅來源于體內(nèi)試驗(yàn)，還需要更多的拆方及體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)闡明補(bǔ)腎活血方通過Wnt經(jīng)典通路防治骨質(zhì)疏松癥的機(jī)制。

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Effects of Different Prescriptions of Tonifying Kidney on Wnt Signaling in Ovariectomy-Induced Osteoporosis Rats

Tao Zhi1,Zheng Xiaoli2,Xue Sha3,Yang Wenqiang3,Ma Wei3
(1. Clinical Laboratory,Wuhan Xinzhou District People’s Hospital,Wuhan 431400,China; 2. Integrated Department,Hospital of Wuhan University of Science and Technology,Wuhan, 430060,China; 3. Center of Experimental Medicine,Wuhan Integrated TCM & Western Medicine Hospital,Wuhan,430022,China)

This study aimed to explore the effects of three differenct prescriptions of tonifying kidney on the expression of β-Catenin mRNA of Wnt signaling pathway in osteoporosis rats. In this experiment,70 female SD rats with the weight of 250±20 g were randomly divided into seven groups: the sham-operation group （the control group）,the model group,the Guilu Erxian glue group,the Erxian decocotion group,the torifying kidney and promoting blood flow treatment group （TCM group）,the estradiol treatment group （the E group） and Xianlin Gubao group,with 10 rats for each group. The osteoporosis model was established by bilateral ovariectomy. The control group underwent sham surgery,while the other six groups administered by bilateral ovariectomy. Rats had been given corresponding treatments for 30 days after the operation. And twelve weeks later,the femoral bone mineral density （BMD） was detected by dual-energy X-ray absorptiometry,and plasma type I collagen carboxy-terminal peptide （β-Crosslaps） and amino-terminal propeptide of type I procollagen （PINP）,the mRNA and protein expression of Wnt2,LRP5 and β-catenin extracted from the right femoral bone marrow weretested by RT-PCR and western blot,respectively. It was found that compared with the control group,BMD,plasma PINP level and the mRNA and protein expressions of Wnt2,LRP5 and β-Catenin in the model group were decreased significantly （P ＜ 0.01）,while the β-Crosslaps expression increased （P ＜ 0.01）. Compared with the model group,BMD,PINP and the mRNA and protein expressions of Wnt2,LRP5 and β-Catenin in the three groups treated by three different tonifying-kidney prescriptions were increased obviously （P ＜ 0.05）,while the expression of β-Crosslaps attenuated （P ＜ 0.01）,and the BMD,the mRNA expression of β-Catenin in the TCM group was higher than that in the Guilu Erxian glue group and the Erxian decocotion group. In conclusion,the three torifying-kidney related prescriptions may improve the state of osteoporosis through regulating Wnt signaling pathway. Thus,the osteoblast proliferation in osteoporosis rats was promoted by the prescription of tonifying kidney and activating blood circulation.

Osteoporosis,ovariosteresis,tonifying kidney,traditional Chinese medicine of enriching kidney and promoting blood flow,Wnt signaling pathway,β-catenin

10.11842/wst.2016.05.020

R68

A

（責(zé)任編輯：馬雅靜，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2015-12-15

修回日期：2016-03-07

＊ 武漢市衛(wèi)生局中西醫(yī)結(jié)合課題（武衛(wèi)[2005]294號(hào)）: 辨證論治與元素含量優(yōu)化組方對(duì)骨質(zhì)疏松癥干預(yù)的實(shí)驗(yàn)研究，負(fù)責(zé)人：馬威。

＊＊ 通訊作者：馬威，副主任技師，主要研究方向：中藥藥理與分子生物學(xué)。