馬紅梅，于 靜，戴 明，張 帆

（1. 新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院 烏魯木齊 830054；2. 新疆醫(yī)科大學(xué)維醫(yī)學(xué)院 烏魯木齊 830054；3. 川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 南充 637000）

適用于冬蟲夏草和新疆蟲草鑒別的DNA條形碼技術(shù)研究＊

馬紅梅1，于 靜2，戴 明1，張 帆3＊＊

（1. 新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院 烏魯木齊 830054；2. 新疆醫(yī)科大學(xué)維醫(yī)學(xué)院 烏魯木齊 830054；3. 川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 南充 637000）

目的：應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)對青海冬蟲夏草和新疆蟲草進(jìn)行鑒別，考查ITS序列和18S序列作為DNA條形碼的可行性。方法：利用ITS序列和18S序列對冬蟲夏草和新疆蟲草的DNA提取物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測序，并與GenBank數(shù)據(jù)庫中下載的共23條近緣蟲草的ITS序列和18S序列進(jìn)行比對；利用MEGA 6.0分析軟件計算的K-2-P距離，構(gòu)建蟲草樣品和參比序列的18S、ITS序列的NJ樹。結(jié)果：通過遺傳距離和NJ樹分析可知，本研究所用20份青海冬蟲夏草和新疆蟲草樣本確定為蟲草類，與其近緣蟲草各自聚為一支；ITS序列構(gòu)建的NJ樹能夠從種屬水平上將青海冬蟲夏草和新疆蟲草成功鑒別開來。結(jié)論：ITS序列較18S序列更適合作為冬蟲夏草和新疆蟲草的條形碼進(jìn)行鑒定研究。

冬蟲夏草 新疆蟲草 DNA條形碼 ITS序列和18S序列

冬蟲夏草是中國特有的名貴中藥材，主產(chǎn)于海拔3 000-5 000 m的高山草甸區(qū)，多產(chǎn)于四川、青海、西藏、云南、貴州等地，冬蟲夏草Cordyceps sinensis（Berk.）Sacc是麥角菌科真菌寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座及其幼蟲尸體的復(fù)合體，具有壯陽滋陰、滋補(bǔ)身體的功效，還具有調(diào)節(jié)免疫、內(nèi)分泌、呼吸系統(tǒng)功能、肝臟功能等多種藥理作用[1]。新疆蟲草以阿爾泰山森林帶和伊犁地區(qū)為主要產(chǎn)地，哈薩克民間習(xí)用，一般多是僵蟲。新疆蟲草為麥角科蟲草屬真菌新疆蟲草菌Cordyceps grsacilis（Grev.）Dur et Mont的子座及其寄主蝙蝠蛾科阿爾泰蝠蛾昆蟲幼蟲及幼蟲尸體的復(fù)合體[2]。新疆蟲草與冬蟲夏草為同屬真菌，從親緣關(guān)系上是中國各種蟲草和蛹草中最接近冬蟲夏草的藥材，臨床功用相似。

近年來，蟲草市場常出現(xiàn)以次充好、摻假充真的混亂現(xiàn)象，常見用價格相對較為便宜的新疆蟲草冒充冬蟲夏草，或以偽品冒充冬蟲夏草正品。這些影響了蟲草藥材規(guī)范管理，也嚴(yán)重影響了消費者身體健康。新疆蟲草和冬蟲夏草的鑒定成為首要解決的問題，建立快速鑒別、鑒定新疆蟲草與冬蟲夏草的方法是中藥材市場規(guī)范化丞待解決的需求。

本研究運用在菌物條形碼中應(yīng)用較多的ITS[3，4]、18S兩種序列對冬蟲夏草和新疆蟲草進(jìn)行鑒定研究，考察兩種DNA條形碼候選序列的鑒定能力，為冬蟲夏草種屬DNA分子鑒定研究提供參考依據(jù)。

1 儀器材料和方法

1.1 儀器和材料

TGL-16B臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器制造廠），GL-88B漩渦混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司），K20干式恒溫器（杭州美盛儀器有限公司），K5500核酸蛋白定量儀（北京凱奧科技發(fā)展有限公司），DYY-6C電泳儀電源（北京市六一儀器廠），DYCZ-21電泳槽（北京市六一儀器廠），MyCycler Thermal Cycler梯度PCR儀（美國Bio-Rad公司），凝膠成像系統(tǒng)BioDoc-IT Imaging System（美國UVP公司）；CTAB（北京中生瑞泰科技有限公司，批號：20120416247），DYCP-31DN及DYY-6C型 水平電泳儀及電源（北京市六一儀器廠），移液器（德國Eppendorf公司，10 -1 000 μL）。

NaCl（天津福晨化學(xué)試劑廠，批號：XK13-011-00030），EDTA（AMRESCO，批號：1926B030），瓊脂糖（上海生工有限公司，批號：AB0013），異丙醇（天津市富宇精細(xì)化工有限公司），無水乙醇（天津市富宇精細(xì)化工有限公司），氯仿（天津市富宇精細(xì)化工有限公司），異戊醇（天津市富宇精細(xì)化工有限公司），50×TAE（生工生物工程股份有限公司，批號：SD8101-500 mL），Tris-HCl（北京索萊寶科技有限公司，批號：201203169521），Marker DL2000（日 本 Takara公 司，批 號：3427A），6×Loading buffer（日本Takara公司，批號：9156），Pfu DNA Polymerase（北京天根生化科技有限公司，批號：EP101），Super Pure dNTP Mix（北京天根生化科技有限公司，批號：CD111），Agarose（生工生物工程股份有限公司，批號：AB0013-250 g），50×TAE buffer（生工生物工程股份有限公司，批號：SD8101-500 mL），Ethidium Bromide（美 國Sigma公司，批號：E8751），PCR引物由上海生工有限公司合成。

實驗所用青海冬蟲夏草（10份，編號：QH-11至QH-20），新疆蟲草（10份，編號XJ-1至XJ-10）購自烏魯木齊市百草堂醫(yī)藥連鎖有限公司，分別由新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院李永和教授鑒定來源分別為冬蟲夏草Cordyceps sinensis（Berk.）Sacc、新疆蟲草Cordyceps grsacilis（Grev.）Dur et Mont。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品DNA提取

取30 mg蟲草，加入液氮充分研磨，采用CTAB法提取蟲草DNA基因組[5]。

1.2.2 DNA的純度、濃度檢測

取將DNA提取液適當(dāng)稀釋后，用核酸蛋白定量儀及瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.2.3 PCR擴(kuò)增和測序

實驗采用兩對正反向引物（ITS5、ITS4），（18SF、18SR）。

（1）PCR反應(yīng)體系

反應(yīng)體系為30 μL，分別包含10×Pfu Buffer 3 μL、dNTP Mix（10 mM） 0.6 μL、Primer F（10 μM）0.6 μL、Primer R（10 μM）0.6 μL、Template 0.6 μL、Pfu DNA Polymerase（2.5 U·μL-1）0.3 μL、ddH2O224.3 μL。

（2）PCR反應(yīng)程序（序列ITS5、ITS4）

循環(huán)參數(shù)為變性95℃ 30 s，退火58℃ 30 s，延伸 72℃ 60 s，40個循環(huán)。首次循環(huán)前預(yù)變性95℃ 5 min，最后一個循環(huán)后 72℃延伸5 min。

（3）PCR反應(yīng)程序（序列18SF、18SR）

循環(huán)參數(shù)為變性95℃ 30 s，退火60℃ 30 s，延伸 72℃ 60 s，40個循環(huán)。首次循環(huán)前預(yù)變性95℃ 5 min，最后一個循環(huán)后72℃延伸5 min。

（4）PCR產(chǎn)物檢測與測序

PCR產(chǎn)物電泳后使用凝膠成像儀觀察，將擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物送到上海生工有限公司測序。

1.2.4 種間及種內(nèi)序列差異比較[6]

用ClustalX 2.0 校對拼接，去除低質(zhì)量序列及引物區(qū)，進(jìn)行多序列比對并人工校驗，得到完整的各DNA條形碼序列。利用DNA-STAR軟件分析得到各序列長度及堿基組成，進(jìn)行序列比對，在數(shù)據(jù)庫NCBI中查找冬蟲夏草同屬真菌的ITS序列和18S序列作為參比序列，用MEGA 6.0計算K-2-P距離，對不同序列種間、種內(nèi)變異大小進(jìn)行比較，構(gòu)建其NJ樹，評價不同序列的鑒定能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA純度及濃度檢測結(jié)果

經(jīng)CTAB法提取DNA的純度在（1.90±0.10）之間，見表1。結(jié)果表明：CTAB法提取的DNA樣品符合后續(xù)PCR擴(kuò)增要求。

2.2 PCR產(chǎn)物檢測

對20個樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時增加陰性對照[7]， 樣品ITS擴(kuò)增成功率達(dá)100%，PCR純化產(chǎn)物均在600 bp左右，特異性片段大小適中，便于測序以及后續(xù)的序列分析（圖1）。20個樣品的18S擴(kuò)增成功率達(dá)95%，PCR純化產(chǎn)物均在2 000 bp左右（圖2）。

表1 新疆蟲草和冬蟲夏草樣品的濃度檢測結(jié)果

圖1 ITS引物對20個蟲草樣本的PCR擴(kuò)增圖譜

圖2 18S引物對20個蟲草樣本的PCR擴(kuò)增圖譜脫曲線

2.3 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹

利用MEGA 6.0分析軟件計算的K-2-P距離，構(gòu)建蟲草樣品和參比序列的18S、ITS序列的NJ樹。在GenBank數(shù)據(jù)庫中下載的共23條新疆蟲草和冬蟲夏草樣品的18S、ITS參比序列。應(yīng)用MEGA6.0軟件對ITS序列、18S序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3、圖4）。

由圖3和圖4可知，在ITS序列構(gòu)建的NJ樹中，青海冬蟲夏草樣品QH-12、QH-13、QH-19和甘肅冬蟲夏草（EU570952.1）、四川冬蟲夏草（EU570959.1）聚為一支，支持率為86%；QH-11、QH-15和QH-17聚為一支，支持率為96%；QH-16、QH-18和QH-20聚為一支，支持率為98%；新疆蟲草XJ-7、XJ-9聚為一支，支持率為91%；新疆蟲草XJ-2、XJ-6、XJ-10與挪威細(xì)蛇形蟲草（AJ786563.1、AJ786564.1）聚為一支，支持率為92%。在18S序列構(gòu)建的NJ樹中， XJ-1、XJ-9和XJ-10聚為一支，支持率為99%；XJ-4、XJ-8和XJ-7聚為一支，支持率為100%。青海冬蟲夏草和新疆冬蟲夏草的ITS序列和18S序列的NJ樹中可以看到它們均可各自與親緣關(guān)系較近的同屬蟲草或近緣屬蟲草聚為一支而得以區(qū)分鑒別，但是18S序列構(gòu)建的NJ樹與參比序列支持率較低，聚類結(jié)果不理想。

圖3 利用ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖4 利用18S序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

DNA條形碼技術(shù)廣泛應(yīng)用于動植物的鑒別研究，而真菌類生物的條形碼研究尚處于初級階段。目前，本研究中的新疆蟲草和冬蟲夏草，在早期研究中采用的是生藥學(xué)特征、形態(tài)學(xué)[1]、理化顯微鑒別、特異性PCR鑒定[8]、RAPD多態(tài)性分析[9]等鑒別方法，現(xiàn)在則是應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)進(jìn)行鑒別。如陳抒云等[10]結(jié)合ITS序列和COI序列的DNA條形碼技術(shù)鑒定涼山蟲草與其近緣物種及其混偽品。王薇等[11，12]將ITS序列作為DNA條形碼在蟲草鑒定及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系中的研究和應(yīng)用中，認(rèn)為ITS序列作為蟲草DNA條形碼是可行的。Xiang L等[13]將ITS作為DNA條形碼序列進(jìn)行分析和評估快速，準(zhǔn)確鑒定了131份冬蟲夏草樣品和12種常見近緣偽品。張文娟等[14]將ITS1作為DNA條形碼用于冬蟲夏草與其近緣種的鑒別，以達(dá)到借助ITS1序列鑒定冬蟲夏草及其同屬的混偽品的目的。本研究在參考文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，重點解決新疆蟲草和冬蟲夏草的鑒別問題以及兩種藥材的真假問題。本實驗采用DNA條形碼技術(shù)，選取ITS序列和18S序列進(jìn)行分析，比較兩種序列的鑒定能力，最終選取適合于新疆蟲草和冬蟲夏草的特征序列片段，建立針對新疆蟲草和冬蟲夏草的快速、準(zhǔn)確鑒別方法。

DNA條形碼序列鑒定方法的準(zhǔn)確性，是指無論根據(jù)ITS序列構(gòu)建的NJ樹，還是各物種的種內(nèi)、種間的遺傳距離，均能準(zhǔn)確鑒定其基原物種并進(jìn)行聚類區(qū)分。各蟲草物種的ITS序列雖長度不同，但種內(nèi)變異小，種間差異比較大，從而使種間與種內(nèi)變異有個很好的界定，能將冬蟲夏草與其他蟲草區(qū)分開來[10]。本研究所用青海冬蟲夏草和新疆冬蟲夏草從NJ樹種可知，實驗樣本來源于蟲草類，與其近緣蟲草各自聚為一支。通過對其進(jìn)行ITS序列和18S序列作為條形碼的研究，發(fā)現(xiàn)ITS序列作為冬蟲夏草和新疆蟲草的條形碼較18S序列更為適合，ITS序列的有效長度為600 bp左右，片段長度大小適宜，擴(kuò)增與測序成功率為100%；基于ITS序列構(gòu)建的青海冬蟲夏草及新疆蟲草的NJ樹可以看出：青海蟲草各自聚為一支，新疆蟲草各自聚為一支，兩者可以得到區(qū)分，這說明基于ITS序列構(gòu)建的NJ進(jìn)化樹能很好地區(qū)分冬蟲夏草及新疆蟲草。

本研究以青海冬蟲夏草、新疆蟲草及其親緣關(guān)系較近的同屬蟲草、近緣屬蟲草為例，構(gòu)建系統(tǒng)樹，篩選出較好區(qū)分冬蟲夏草和新疆蟲草的ITS序列，該方法可應(yīng)用于藥材市場中青海冬蟲夏草與新疆蟲草的鑒別，為保障臨床安全用藥提供了新的技術(shù)手段。

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11 王薇,王利麗,熊莉麗,等. ITS序列作為DNA條形碼在蟲草鑒定及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系中的研究與應(yīng)用.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報,2012,28(3): 680-682.

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14 張文娟,魏鋒,馬雙成. ITS1作為DNA條形碼用于冬蟲夏草與其近緣種的鑒別. 藥物分析雜志,2015,35(10): 1716-1720.

Study on DNA Barcoding Technology of Qinghai Cordyceps Sinensis and Xinjiang Cordyceps Grsacilis for Identification

Ma Hongmei1,Yu Jing2,Dai Ming1,Zhang Fan3

(1. Chinese Medicine College,Xinjiang Medical University,Urumqi 830000,China; 2. Traditional Uighur Medicine College,Xinjiang Medical University,Urumqi 830000,China; 3.School of Pharmacy,North Sichuan Medical College,Nanchong 637000,China)

This study aimed to identify Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc from Qinghai Province and Cordyceps grsacilis (Grev.) Dur et Mont from Xinjiang Uygur Autonomous Region by DNA barcoding method. The feasibility of ITS sequence and 18S sequence was examined as a DNA barcoding. The DNA samples were extracted and purified. The PCR amplification and bidirectional sequencing of the materials were carried out to obtain ITS and 18S sequences. Then ITS and 18S sequences achieved together with 23 ITS and 18S sequences from GenBank database were aligned. MEGA program (version 6.0) was employed to calculate K2P and built NJ trees of ITS and 18S sequences. From the analysis of the experimental data,the 20 samples in this study were almost clustered together as its closely related genera formed a monophyletic group. The NJ tree constructed by ITS sequencescan identify the two species of Cordyceps in the species’ level. It was concluded that the ITS sequence was more suitable for the identification of Qinghai Cordyceps sinensis and Xinjiang Cordyceps grsacilis compared with the 18S sequence.

Cordyceps sinensis,Cordyceps grsacilis,DNA barcoding,ITS and 18S sequences

10.11842/wst.2016.05.018

R282.5

A

（責(zé)任編輯：馬雅靜，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2016-01-11

修回日期：2016-02-24

＊ 國家自然基金委地區(qū)科學(xué)基金項目（81460637）：利用“組分中藥”模式探討哈薩克藥材準(zhǔn)噶爾烏頭在體內(nèi)的毒性標(biāo)記物，負(fù)責(zé)人：張帆；新疆醫(yī)科大學(xué)校級科研創(chuàng)新基金項目（XJC201312）：基于DNA條形碼技術(shù)的新疆蟲草、冬蟲夏草的鑒定，負(fù)責(zé)人：馬紅梅。

＊＊ 通訊作者：張帆，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：民族藥綜合利用。