王宏歸++黃晨++陳鵬++姜雅++張婭++唐冬英++趙小英++劉選明 ????

摘 要：為研究CONSTANS-LIKE 7 （COL7）在調(diào)控植物開花方面的功能，以定量PCR，GUS染色等方法，研究光及生物鐘對COL7表達的影響，以及COL7對擬南芥開花的影響.實驗結(jié)果顯示：光及生物鐘參與調(diào)控COL7的表達；過表達COL7在長日照條件下抑制CONSTANS （CO）以及FLOWERING LOCUS T （FT）的表達，進而抑制擬南芥開花；col7突變體不論是在長日照下還是短日照下都沒有明顯的開花表型，說明COL7在調(diào)控擬南芥開化方面可能與其家族基因中的其它成員存在功能冗余.

關(guān)鍵詞：基因表達；擬南芥；CONSTANS-LIKE 7；開花

中圖分類號：Q786 文獻標(biāo)識碼：A

The Analysis of CONSTANS-LIKE 7 Regulateing

Arabidopsis Flowering Time

WANG Hong-gui1，HUANG Chen1，CHEN Peng1，JIANG Ya1，

ZHANG Ya1，TANG Dong-ying2，ZHAO Xiao-ying2，LIU Xuan-ming2

（1.School of Environmental Science and Engineering， Yangzhou Univ， Yangzhou， Jiangsu 225127， China；

2.Hunan Provence Key Laboratory of Plant Functional Genomics and Developmental Regulation，

College of Biology， Hunan Univ， Changsha， Hunan 410082， China）

Abstract：To discover the function of CONSTANS-LIKE 7 （COL7） in regulating plant flowering， we used qPCR， GUS staining， et al， to study the light and circadian regulating the expression of COL7， and COL7 regulating Arabidopsis flowering time. The results showed that COL7 was regulated by light and circadian， and the overexpressing COL7 transgenic lines inhibited Arabidopsis flowering time under long-day （LD） condition through down-regulating CONSTANS （CO） and FLOWERING LOCUS T （FT）， and the col7 mutant had no obvious flowering phenotype under LD or SD conditions. So COL7 may have redundant functions with other CONSTANS-LIKEs （COLs） in controlling the flowering time of Arabidopsis.

Key words：gene expression； arabidopsis； CONSTANS-LIKE 7； flowering

擬南芥是長日照植物，長日照促進其開花[ 1].擬南芥從生殖生長到營養(yǎng)生長的轉(zhuǎn)變，是由內(nèi)部及外部因素共同決定的[ 2].目前在擬南芥中，主要有4條開花信號途徑：1）光周期途徑，2）自主途徑，3）赤霉素途徑、4）春化途徑[ 3-7].內(nèi)部及外部信號通過這4條途徑被傳遞至共同的整合子基因，如：FLOWERING LOCUST （FT），SUPPRESSION OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1 （SOC1）以及LEAFY （LFY），從而構(gòu)成一個復(fù)雜的開花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[ 6， 8-9].光周期途徑是由光受體、生物鐘及生物鐘輸出途徑組成，光信號通過光受體（如：CRYPTOCHROMES （CRY） 1與2、FLAVIN-BINDING， KELCH REPEAT， F-BOX1 （FKF1），ZEITLUPE（ZTL），PHYTOCHROMES （PHY） A to E等傳遞至生物鐘[ 10， 11].光周期途徑調(diào)控植物開花是通過CO，F(xiàn)T模式實現(xiàn)[ 12].CO的表達受光及生物鐘調(diào)控，其蛋白在光下穩(wěn)定，但在黑暗下被降解[ 13-15].CYCLING DOF FACTOR 1（CDF1）通過結(jié)合到CO的啟動子上抑制CO的表達，進而抑制FT的表達[ 16].FKF1與GIGANTEA（GI）形成復(fù)合體可以將CDF1降解，從而解除CDF1對CO抑制，促進FT的表達[ 17-19].

湖南大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）2015年

第12期王宏歸等：CONSTANS-LIKE 7基因?qū)M南芥開花的調(diào)控分析

在擬南芥中，CO家族有17個成員，且都含有CCT （CO， COL， and TIMING OF CAB1 EXPRESSION1 （TOC1））結(jié)構(gòu)域與鋅指結(jié)構(gòu)域[ 20-21].CCT結(jié)構(gòu)與蛋白的核定位有關(guān)，同時也可以與HAP3及HAP5相互作用進而調(diào)控擬南芥的生長發(fā)育[ 3， 21-22].鋅指結(jié)構(gòu)域在蛋白與蛋白相互作用中起著重要的作用[ 3， 21-22].根據(jù)鋅指結(jié)構(gòu)域的差異，可以將CO家族分成3組：第1組，CO，COL1～COL5，它們都含有兩個鋅指結(jié)構(gòu)；第2組，COL6～COL8以及COL16它們只含有一個鋅指結(jié)構(gòu)；第3組，COL9～COL15它們都含有一個鋅指結(jié)構(gòu)域以及一個分化的鋅指結(jié)構(gòu)域[ 20-21].

在CO基因家族中，只有CO，COL1，COL2，COL3，COL5，COL7及COL9被報道.CO是光周期開花途徑中的關(guān)鍵基因，其通過結(jié)合到FT的啟動子上激活FT的表達，進而調(diào)控開花[ 12].COL1，COL2的表達是受生物鐘調(diào)控，而且對擬南芥開花只有微弱的影響[ 23].COL3突變體不論在長日照條件下還是在短日照條件下都具有晚花表型，此外，COL3還參與調(diào)控側(cè)根的形成，以及影響芽的伸長與側(cè)枝的形成[ 24].過表達COL5只有在短日照下才能促進FT的表達，進而促進短日照下擬南芥開花[ 25].COL7它參與植物的遮陰反應(yīng)[ 26]；過表達COL9抑制開花，因其抑制CO與FT的表達[ 27].除了目前已經(jīng)被報道的CO及COLs基因外，其他COLs的功能目前還不清楚.在本研究中，將介紹COL7在調(diào)控擬南芥開花方面的功能.

1 材料與方法

1.1 植物材料及生長條件

本研究所用的野生型擬南芥（Wild type，WT）為哥倫比亞（Columbia，Col）.col7 突變體（GABI-639C04）由 Bernd Weisshaar提供（MPI for Plant Breeding Research； Cologne， Germany）.COL7過量表達轉(zhuǎn)基因株系COL7-OX-10 和COL7-OX-11是本實驗室保存材料.擬南芥種子用10%的NaClO溶液侵泡10 min，無菌水洗5次，然后播在Murashige and Skoog medium（MS）培養(yǎng)基上，于4 ℃春化72 h后，分別轉(zhuǎn)移到長日照（16 h光照，8 h黑暗）（100 μmol·m 2·s 1）、短日照（8 h光照，16 h黑暗）（100 μmol·m 2·s 1）、黑暗、紅光（10 μmol·m 2·s 1）、遠紅光（0.8 μmol·m 2·s 1）、藍光（30 μmol·m 2·s 1）下培養(yǎng).擬南芥培養(yǎng)溫度為 22±2 ℃.

1.2 實時定量PCR分析

總的RNA提取使用IllustraRNAspin Mini Kit （GE Healthcare）試劑盒，cDNA的合成是利用2 μg總RNA以及SuperScript first-strand cDNA synthesis system （Invitrogen）試劑盒.qPCR分析使用的試劑、儀器分別是Platinum SYBR Green qPCR Supermix-UDG （Invitrogen）與MX3000 System （Stratagene）.本研究中使用的定量PCR引物見表1.

1.3 COL7的亞細胞定位

利用基因槍將構(gòu)建好的35S：：GFP-COL7質(zhì)粒轟擊洋蔥表皮細胞，然后在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)12～24 h，取洋蔥表皮，于Olympus Confocal FluoView IX 70激光共聚焦顯微鏡下觀察.

2 結(jié)果與分析

2.1 COL7的亞細胞定位分析

CO基因家族都是轉(zhuǎn)錄因子，而轉(zhuǎn)錄因子是在細胞核內(nèi)調(diào)節(jié)特定基因的轉(zhuǎn)錄.COL7含有CCT結(jié)構(gòu)域，其與蛋白的核定位有關(guān).為明確COL7的亞細胞定位，利用35S：：GFP-COL7質(zhì)粒去轟擊洋蔥表皮細胞，經(jīng)過12～24 h的培養(yǎng)后，取上表皮細胞在顯微鏡下觀察，綠色熒光在轟擊的洋蔥表皮細胞核中被檢測到（圖1），這說明COL7是核定位的蛋白.

1：明場，2：色熒光，3：API染色，4：1，2與3的疊加圖

圖1 GFP-COL7融合蛋白的核定位

Fig.1 Localization of GFP-COL7 fusion protein

2.2 COL7過量表達或者缺失對擬南芥開花時間

的影響

目前在已報道的CO基因家族中，部分參與調(diào)控擬南芥開花.COL7參與調(diào)控擬南芥遮陰反應(yīng)，那么COL7是否參與調(diào)控植物開花呢？為此，分別將COL7的過表達株系COL7-OX-10，COL7-OX-11，以及col7突變體、WT種在長日照與短日照條件下，觀察開花表型.經(jīng)過統(tǒng)計分析開花葉片數(shù)以及開花時間發(fā)現(xiàn)：過量表達COL7在長日照下抑制擬南芥開花，其開花時間與野生型相比大約要晚10 d（圖2（a）～（c）），而過量表達COL7在短日照下無抑制開花的作用（圖2（d）～（e）），COL7不論在長日照還是在短日照下，其開花表型與野生型無顯著差異（圖2（a）～（e））.這說明COL7在調(diào)控開花方面與其家族基因存在功能冗余.

2.3 COL7過量表達或者缺失對開花關(guān)鍵基因CO，

FT表達的影響

FT是“成花素”也是整合子基因，他可將來自光周期以及其他開花途徑的信號整合，進而調(diào)控植物開花.COL7抑制開花，那么其是否通過抑制FT表達進而抑制開花？因此，將WT，COL7和COL7-OX種籽播種在MS培養(yǎng)基上，長日照下培養(yǎng)7 d，然后每4 h取樣，共取1 d.提取樣品的RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后利用定量PCR分析，實驗結(jié)果顯示：FT在COL7-OX株系中的表達明顯下降（圖3（a））.抑制FT表達的基因有很多，那么COL7抑制FT的表達是直接抑制FT的表達還是通過其他基因來實現(xiàn)呢？為此，通過定量PCR分析樣品中CO基因的變化.定量PCR結(jié)果顯示：CO在COL7-OX株系里的表達是受抑制的，但是相對于野生型CO的表達變化不是特別大（圖3（b））.因此，COL7-OX株系里的FT的變化不僅僅是由CO引起的，即說明：COL7抑制CO與FT的表達.在目前的報道中，同時參與調(diào)控CO，F(xiàn)T表達的基因還有GI，F(xiàn)KF1，且GI，F(xiàn)KF1是光周期開花途徑中的正調(diào)控基因.那么COL7是否有可能通過抑制GI或FKF1來間接調(diào)控CO，F(xiàn)T？為此，利用定量PCR分析COL7-OX株系里GI，F(xiàn)KF1的表達情況，結(jié)果顯示：COL7不影響GI，F(xiàn)KF1的表達（圖3（c）～（d））.因此，COL7抑制開花是通過其自身抑制CO，F(xiàn)T的表達來實現(xiàn).

2.4 COL7組織器官表達特異性分析

35S啟動子驅(qū)動的COL7抑制韌皮部基因CO，F(xiàn)T的表達，那么COL7是否在韌皮部有表達？因此，COL7的組織表達對研究COL7的功能非常重要.以PCOL7：：GUS轉(zhuǎn)基因植株來研究COL7的組織表達.取在長日照條件下生長5 d的PCOL7：：GUS轉(zhuǎn)基因幼苗進行GUS染色.實驗結(jié)果顯示：COL7不僅在葉肉里表達，同時也在韌皮部里表達（圖4（a））.此外，為了明確COL7在擬南芥各組織器官里的表達情況，取在長日照條件下生長35 d的野生型植株的各個組織器官，利用定量PCR的方法進行分析COL7的表達，實驗結(jié)果顯示：COL7在葉片、花里面表達比較多，而在根，莖，果夾中表達較少（圖4（b））.2.5 COL7時空表達模式分析

因為COL7是光周期途徑中的開花抑制因子，分析COL7在不同發(fā)育階段的表達情況，對揭示COL7的基因功能有很重要的作用.所以，收集在長日照條件下生長7，15，25和35 d的野生型植株，提取樣品RNA，利用定量PCR分析COL7的表達情況，定量PCR結(jié)果顯示：COL7的表達從第7 d到第15 d這個過程中有明顯的增加，而在15 d以后基本上保持相同的水平，因此，COL7的表達具有一定的時間性（圖5（a））.COL7在葉片的表達量最高，那么COL7在不同的葉片中的表達量是否相同呢？以在長日照條件下生長35 d的WT為材料，分別取子葉、第1片真葉、第4片真葉、第7片真葉、頂葉，然后利用定量PCR的方法分析COL7的表達情況，實驗結(jié)果顯示：COL7在最低層的葉片中表達最少，而在最頂端的葉片中表達最多，即在離地面越遠的葉片中COL7表達量越高（圖5（b））.因此，COL7的表達具有空間性.

（a）在長日照下生長10 d的PCOL7：：GUS轉(zhuǎn)基因 （b）在長日照條件下生長35 d的野生型的

植株的GUS染色 各組織器官里的COL7的表達水平

2.6 光對COL7基因表達的影響

以上實驗結(jié)果顯示：COL7在光周期途徑中參與調(diào)控擬南芥開花，那么COL7是否受光調(diào)控呢？分別取在長日照條件下生長7 d、短日照條件下生長15 d的野生型幼苗，每4 h取一次樣，共取一天，然后利用定量PCR分析COL7的表達情況.實驗結(jié)果顯示：COL7主要在白天表達，且其在開燈后第4 h表達量最高，無論是在長日照還是短日照下COL7的表達都受光誘導(dǎo)（圖5（c））.因此，光誘導(dǎo)：COL7表達.白光是由不同的單色光組成，那么紅光、遠紅光、藍光是否同樣會誘導(dǎo)COL7的表達呢？將野生型幼苗在黑暗下培養(yǎng)7 d，然后轉(zhuǎn)移到紅光、遠紅光、藍光下，并分別在0，0.5，1，2，4，8 h取樣，再利用定量PCR分析紅光、遠紅光、藍光對COL7表達的影響.實驗結(jié)果顯示：紅光、遠紅光、藍光也都會誘導(dǎo)COL7的表達（圖5（d））.

3 討 論

過量表達COL7只在長日照條件下抑制擬南芥開花.因此，COL7抑制擬南芥開花與光照時間密切相關(guān).COL7無論是在長日照還是短日照條件下，其開花時間與WT沒有顯著的差異.這說明COL7在調(diào)控開花方面與其家族基因存在功能冗余.COL7過表達的晚花表型是通過抑制CO，F(xiàn)T表達時實現(xiàn)的.FT是整合子基因，它可以將來自光周期途徑的信號以及其它途徑的信號整合，進而調(diào)控植物開花.光周期途徑是通過介導(dǎo)光以及環(huán)境中的一些臨時信號來調(diào)控一系列的開花基因的表達，從而調(diào)控植物開花.GI，F(xiàn)KF1即參與調(diào)控CO的表達，同時也參與調(diào)控FT的表達.然而COL7抑制CO，F(xiàn)T的表達并不是通過GI，F(xiàn)KF1，因為COL7不影響GI，F(xiàn)KF1的表達.過表達COL7晚花是因為CO，F(xiàn)T的表達受到抑制，目前CO家族中已經(jīng)報道的基因只有COL9與COL7在調(diào)控開花方面具有相似的功能，COL9在長日照下抑制開花，其也是通過抑制CO，F(xiàn)T的表達.光信號在光周期其途徑中起著很重要的作用，COL7的表達受光的調(diào)控，且COL7抑制開花受光照時間調(diào)控.COL7是開花抑制子，但是COL7有可能不是單獨起作用，可能與其他基因一起參與調(diào)控開花.因為，一般情況下開花抑制因子在從營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)入生殖生長后其表達量是下降的，然而COL7的時空表達情況說明，COL7在擬南芥從營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)入生殖生長的過程中其表達是上升的，而且在新生的葉片中表達量最高，因此，COL7可能是與其他因子相互作用參與調(diào)控開花，而這些因子隨著植物的生長逐漸減少，進而導(dǎo)致COL7對開花的抑制減弱，其確切的機制還需要進一步研究.

總之，通過本研究首次發(fā)現(xiàn)：COL7是開花負調(diào)控因子，而且其通過抑制CO，F(xiàn)T的表達進而抑制開花；COL7在韌皮部有表達，且COL7的表達具有時空特異性；COL7的表達受光調(diào)控，此外，COL7只在長日照下抑制開花，這說明COL7調(diào)控植物開花的功能與日照時間密切相關(guān).因此，光不僅參與調(diào)控COL7的表達，同時也影響COL7調(diào)控開花的功能.

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