呂 楊，宋 超，劉媛媛，3，趙 峰，張 濤，高 宇，莊 平

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇無錫 214182；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；3.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306）

基于16S rRNA基因部分序列的長江口蝦虎魚科魚類系統(tǒng)分類

呂 楊1，2，宋 超2，劉媛媛2，3，趙 峰2，張 濤2，高 宇2，莊 平1，2

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇無錫 214182；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；3.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306）

為了確定線粒體16S rRNA基因在長江口蝦虎魚科魚類系統(tǒng)分類及物種鑒定中的作用，采用16S rRNA基因特異擴增測序及GenBank已有序列聯(lián)合配對分析的方法，對長江口蝦虎魚科9屬11種魚類34個16S rRNA基因片段的序列進行比較和系統(tǒng)分類研究。統(tǒng)計分析顯示，蝦虎魚科魚類該片段的A含量明顯高于其它3個堿基含量，A＋T的平均含量高于G＋C的平均含量，第3密碼子位點G＋C含量最高，其平均值為51.1%，變化范圍為49.8%～53.2%。全部轉(zhuǎn)換位點多于顛換位點，轉(zhuǎn)換/顛換比值為1.45。依據(jù)Maximum Composite Likelihood模型，得出11種蝦虎魚科魚類種間遺傳距離平均值為0.151，種內(nèi)為0.002，種間遺傳距離是種內(nèi)遺傳距離的76倍。通過鄰接法（Neighbor－joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，顯示長江口蝦虎魚科魚類為明顯的單系群，并進一步佐證把傳統(tǒng)形態(tài)分類中彈涂魚科的青彈涂魚（Scartelaos histiophorus）和大彈涂魚（Boleophthalmus pectinirostris）及鰻蝦虎魚科的拉氏狼牙蝦虎魚（Odontamblyopus lacepedii）和紅狼牙蝦虎魚（Odontamblyopus rubicundus）歸屬于蝦虎魚科的合理性。聚類結(jié)果顯示紅狼牙蝦虎魚和拉氏狼牙蝦虎魚聚在一起，其節(jié)點支持率達100%，兩者可能為同種異名。本研究表明，線粒體16S rRNA基因序列作為分子標記對蝦虎魚科魚類進行物種鑒定和系統(tǒng)分類是可行的，可為蝦虎魚類的親緣關(guān)系分析提供基礎(chǔ)資料。

蝦虎魚科；16S rRNA；分子系統(tǒng)分類

蝦虎魚科（Gobiidae）魚類隸屬蝦虎魚亞目，該亞目是現(xiàn)存的鱸形目魚類中最大的一個類群，在全世界約有2 000余種，包括9科270屬［1］。蝦虎魚類大多為暖水性或暖溫性底層小型魚類，生活于近岸海底、淺灣、河口或淡水河流、湖沼中。由于蝦虎魚體型較小，而且形態(tài)上存在著不同程度的器官退化及特化，給傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類工作帶來了較大困難，導(dǎo)致其種類的命名及分類較為混亂，同種異名現(xiàn)象嚴重，系統(tǒng)分類關(guān)系存在較大爭議。線粒體DNA是核外遺傳物質(zhì)，具有結(jié)構(gòu)簡單，進化較快等優(yōu)點，在動物種群的種質(zhì)鑒定和系統(tǒng)分類研究中具有重要作用［2－4］。其中，16S rRNA基因序列具有高度的保守性和特異性，以及較強的種間差異性，已被廣泛應(yīng)用于物種的鑒定及分類研究［5－7］。

本研究利用16S rRNA基因部分序列，對長江口11種蝦虎魚類進行種類鑒定，進一步驗證長江口蝦虎魚類的同種異名現(xiàn)象，為長江口蝦虎魚科魚類系統(tǒng)分類提供分子生物學(xué)依據(jù)，對長江口蝦虎魚科魚類親緣關(guān)系和系統(tǒng)進化等研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本研究所用的雙帶縞蝦虎魚（Tridentiger bifasciatus）、髭縞蝦虎魚（Tridentiger barbatus）、竿蝦虎魚（Luciogobius guttatus）、阿部鯔蝦虎魚（Mugilogobius abei）、爪哇擬蝦虎魚（Pseudogobius javanicus）、斑尾刺蝦虎魚（Acanthogobius ommaturus）、睛尾蝌蚪蝦虎魚（Lophiogobius ocellicauda）、拉氏狼牙蝦虎魚（Odontamblyopus lacepedii）、青彈涂魚（Scartelaos histiophorus）等蝦虎魚科魚類及中國花鱸（Lateolabrax maculatus）和棘頭梅童魚（Collichthys lucidus）均采自長江口水域，現(xiàn)場采樣并保存于95%乙醇。紅狼牙蝦虎魚（O.rubicundus）和大彈涂魚（Boleophthalmus pectinirostris）的序列特征為NCBI中檢索而得。

1.2 DNA提取

利用海洋動物基因組DNA提取試劑盒提取樣品總DNA。具體操作如下：取組織樣品于2.0 mL離心管中，加入200μL LB Buffer、10μL蛋白酶K和600μL NB Buffer，56℃恒溫水浴鍋裂解消化2 h；離心并將上清液全部加入Mini Spin純化柱，離心去除濾過液；向Mini Spin純化柱中加入RPE Buffer，去除蛋白質(zhì)和其它雜質(zhì)；向Mini Spin純化柱中加入Wash Buffer洗脫DNA；將Mini Spin純化柱轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，在吸附膜中加入30μLRNase Free H2O溶液，將DNA溶于雙蒸水（RNase Free H2O）中，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物合成與PCR擴增

引物參照PALUMBI等［8］設(shè)計，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列為：

PCR反應(yīng)總體積為50μL，其中PremixTaq25μL（1.25 U），引物16S ar/16Sbr各1μL（20 μmol·L－1），根據(jù)純度和質(zhì)量加入適量DNA模板，補加雙蒸水至50μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s；55℃退火30 s；72℃延伸1 min；30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min；PCR產(chǎn)物4℃保存?zhèn)溆谩Ｃ看畏磻?yīng)設(shè)置不含DNA模板的空白對照。

1.4 DNA測序和序列下載

將PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后送至上海桑尼生物科技有限公司，經(jīng)ABI PRISMTM3730XL DNA Analyzer測序儀，以16S ar作為測序引物進行單向測定。

從GenBank中下載蝦虎魚科其它魚類16S rRNA基因序列，與本研究所檢測的序列共計9屬11種34個個體的16S rRNA基因進行同源性序列分析，并選擇中國花鱸和棘頭梅童魚共2種5個同源序列作為外群。所分析物種的16S rRNA基因及其相關(guān)信息見表1。

表1 蝦虎魚科11種魚類的16S rRNA基因信息Tab.1 Information of 16S rRNA genes of 11 Gobiidae species

1.5 數(shù)據(jù)分析

將所測序列用NCBI的Blast工具進行相似性檢索，確認所得序列為目的片段。利用Clustal W對本研究所得序列和GenBank下載的相關(guān)序列進行編輯、校對和排序，并輔以人工校正［9］。用MEGA 5.0軟件統(tǒng)計序列的平均堿基組成、變異位點、簡約信息位點、單獨位點、轉(zhuǎn)換與顛換位點的比例，進行系統(tǒng)發(fā)育分析。采用Maximum Composite Likelihood模型計算種內(nèi)和種間遺傳距離，用鄰接法（Neighbor－joining，NJ）構(gòu)建分子系統(tǒng)樹，并采用自展法檢驗（Bootstrap）1 000次重復(fù)檢驗分子系統(tǒng)樹各分支的置信度［10］。

2 結(jié)果與分析

2.1 長江口蝦虎魚科魚類16S rRNA基因序列特征

本研究所測得蝦虎魚科魚類PCR產(chǎn)物大小約為560 bp，采用Clustal W對本研究所測31個 16S rRNA基因序列和3個GenBank中下載的蝦虎魚科魚類16S rRNA同源序列進行比對，保留共有序列，長度492 bp，編碼164個氨基酸。用MEGA 5.0計算這34條序列的堿基組成，其堿基平均含量為：T 21.6%，C 24.7%，A 30.6%，G 23.0%，A的含量明顯高于其它3個堿基的含量。A＋T的平均含量為52.3%，高于G＋C的含量47.7%（表2）。對所研究的11種蝦虎魚科魚類34個16S rRNA基因片段而言，第3密碼子位點平均GC含量最高，A、T、G、C在1、2、3密碼子位點的平均含量差別明顯，可見，16S rRNA序列密碼子的堿基使用頻率存在偏向性。

11種蝦虎魚科魚類16S rRNA基因片段的平均GC含量為48.1%，變化范圍為46.9%～50.3%。其中，第3密碼子位點的平均GC含量高于第1密碼子和第2密碼子，第3個密碼子位點的平均GC含量變化范圍為49.8%～53.2%（表3）。

表2 蝦虎魚科11種魚類的16S rRNA基因部分序列中各堿基平均分布頻率Tab.2 Average nucleotide frequencies of 16S rRNA partial sequence of 11 Gobiidae species （%）

表3 蝦虎魚科11種魚類16S rRNA基因密碼子位點GC含量Tab.3 The GC content of 16S rRNA partial sequence of 11 Gobiidae species in all codon positions

表4所示為所有個體序列核苷酸變異情況，其中不變位點在第3密碼子位點最多，轉(zhuǎn)換和顛換位點均在第2密碼子位點最多，轉(zhuǎn)換位點與顛換位點的比值在第1密碼子位點最小。在全部492個位點中有155個變異位點，約占總數(shù)的32%，33個插入/缺失位點，145個簡約信息位點，10個單獨位點。單倍型的個數(shù)為293個，雙倍型個數(shù)為63個，4倍型個數(shù)為49個。全部位點的轉(zhuǎn)換位點多于顛換位點，轉(zhuǎn)換位點與顛換位點的比值R為1.45。

2.2 蝦虎魚科魚類16S rRNA基因編碼蛋白質(zhì)中氨基酸使用頻率

用MEGA 5.0計算得到11種蝦虎魚科魚類的共有序列編碼164個氨基酸（表5），其中70個發(fā)生變異，占氨基酸總數(shù)的43%。在氨基酸的使用頻率中，最高的為亮氨酸（Leu），其在青彈涂魚中使用頻率最高（13.69%），在拉氏狼牙蝦虎魚中使用頻率最低（9.87%）。其次，使用頻率較高的有蘇氨酸（Thr）和絲氨酸（Ser），而使用頻率最低的為組氨酸（His），其在斑尾刺蝦虎魚、紅狼牙蝦虎魚以及拉氏狼牙蝦虎魚中的使用頻率均為0。另外，酪氨酸（Tyr）和色氨酸（Trp）在11種蝦虎魚類中使用頻率也相對較小。

2.3 種間及種內(nèi)的遺傳距離

用Maximum Composite Likelihood模型計算11種蝦虎魚科魚類的種間和種內(nèi)遺傳距離（表6）。11種蝦虎魚類的種間遺傳距離在0.055～0.221之間，其平均值為0.151，種內(nèi)遺傳距離平均值為0.002，種間遺傳距離為種內(nèi)遺傳距離的76倍。91%以上的種間遺傳距離大于0.100，而種內(nèi)遺傳距離均小于0.010。種內(nèi)遺傳距離較大的為斑尾刺蝦虎魚（0.06）；而種間遺傳距離最大值在拉氏狼牙蝦虎魚和斑尾刺蝦虎魚間（0.221），而最小值在拉氏狼牙蝦虎魚和紅狼牙蝦虎魚間（0.055）。

表4 蝦虎魚科11種魚類16S rRNA基因部分序列各密碼子堿基變異情況Tab.4 Sequence variations of 16S rRNA partial sequence of 11 Gobiidae species

表5 蝦虎魚科11種魚類16S rRNA基因編碼蛋白質(zhì)氨基酸的使用頻率Tab.5 The am ino acid frequency of 16S rRNA gene encoding protein for 11 Gobiidae species（%）

表6 蝦虎魚科11種魚類的種間和種內(nèi)遺傳距離Tab.6 Genetic distance pairw ise-species and w ithin-species in 11 Gobiidae species

2.4 蝦虎魚科魚類的分子系統(tǒng)樹分析

采用NJ法對蝦虎魚科9屬11種34個體及中國花鱸和棘頭梅童魚2種外群的16S rRNA基因序列構(gòu)建分子系統(tǒng)樹（圖1）。整個分子系統(tǒng)樹分為兩個大的分支，第一支由中國花鱸和棘頭梅童魚2外群組成，第二支由11種蝦虎科魚類組成。蝦虎魚類的分子系統(tǒng)樹又分為2支，其中一支由斑尾刺蝦虎魚和睛尾蝌蚪蝦虎魚組成，其余9種蝦虎魚類組成另外一支。在分子系統(tǒng)樹中除了拉氏狼牙蝦虎魚和紅狼牙蝦虎魚聚在一起外，其它9種蝦虎魚科魚類同一種的不同個體均可聚在同一分支內(nèi)，9種蝦虎魚可形成單系（圖1）。拉氏狼牙蝦虎魚和紅狼牙蝦虎魚聚在一起，其自展置信值達100，呈現(xiàn)出非常近的親緣關(guān)系。

3 討論

本研究中蝦虎魚類的16S rRNA基因片段中A＋T含量明顯高于G＋C含量，該結(jié)果與ASAKAWA等［11］提出的后生動物線粒體基因的堿基構(gòu)成具有明顯的偏倚性，A＋T含量通常較為豐富，顯著高于G＋C含量的結(jié)果一致，該特點已在許多魚類中得到了驗證［12－14］。其中，孫希福［15］通過對中國沿海10種蝦虎魚類堿基組成的研究也證實了這一結(jié)論。本研究中蝦虎魚16S rRNA基因全部密碼子位點的轉(zhuǎn)換值與顛換值之比為1.45，表明蝦虎魚類的16S rRNA基因序列的突變已經(jīng)達到飽和狀態(tài)［16］。蝦虎魚類16S rRNA基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸使用頻率中，最高的為亮氨酸，而使用頻率最低的為組氨酸?？梢?，蝦虎魚科魚類16S rRNA基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸使用頻率存在明顯的偏向性。

HEBERT等［17－19］認為COⅠ序列在物種間的遺傳差異通常大于2%，并提出只有當(dāng)種間遺傳距離顯著大于種內(nèi)遺傳距離，并且這種差異達到約10倍以上時，COⅠ基因才可對物種進行有效的鑒定。而對16S rRNA基因在物種鑒定中的應(yīng)用，迄今還未見相應(yīng)的鑒定標準，但可以確定的是較大的種間序列差異是對物種進行準確鑒定的先決條件［20］。本研究中11種蝦虎魚類的種間遺傳距離平均為0.151，種內(nèi)遺傳距離平均為0.002，種間遺傳距離為種內(nèi)遺傳距離的76倍。種內(nèi)具有較高的同源性，而不同種間的多態(tài)性差異比較明顯，表明該基因適用于對長江口蝦虎魚類物種進行種類鑒定［21］。縱觀本研究分子系統(tǒng)樹的拓撲結(jié)構(gòu)，主要分為兩大支，第一大支由中國花鱸和棘頭梅童魚組成，第二大支由11種蝦虎魚類組成。在蝦虎魚類的分支中包括了傳統(tǒng)分類中彈涂魚科的青彈涂魚和大彈涂魚，以及鰻蝦虎魚科的拉式狼牙蝦虎魚和紅狼牙蝦虎魚［22］。從親緣關(guān)系圖譜來看，上述四種魚類與其它蝦虎魚類的親緣關(guān)系密切，均可歸為蝦虎魚科。該研究結(jié)果與伍漢霖等［1］主編的《中國動物志》中把青彈涂魚、大彈涂魚、拉氏狼牙蝦虎魚和紅狼牙蝦虎魚歸屬為蝦虎魚科的分類結(jié)果一致。蝦虎魚類組成的一大支又分為2個分支，其中一個分支由斑尾刺蝦虎魚和睛尾蝌蚪蝦虎魚組成，表明斑尾刺蝦虎魚和睛尾蝌蚪蝦虎魚具有較近的系統(tǒng)進化關(guān)系，該結(jié)果與于亞男等［23］基于線粒體COⅠ基因?qū)﹂L江口蝦虎魚類系統(tǒng)進化的研究結(jié)果一致。在其余9種蝦虎魚類構(gòu)成的另外一支中，又分為2個支系。在其中一個支系中，髭縞蝦虎魚和雙帶縞蝦虎魚為姊妹分支，其遺傳距離只有0.092，說明兩者親緣關(guān)系較近，同屬于縞蝦虎魚屬［1］。竿蝦虎魚和阿部鯔蝦虎魚為姊妹分支，兩者的遺傳距離為0.084，具有較近的親緣關(guān)系；這四種蝦虎魚與爪哇擬蝦虎魚共同組成了一個支系，這五種蝦虎魚類的棲息水域和攝食習(xí)性相近，說明它們具有相似的起源和相近的親緣關(guān)系。在另一個支系中，紅狼牙蝦虎魚和拉氏狼牙蝦虎魚聚在一起，兩者的節(jié)點支持率為100%，其種間遺傳距離在本研究的所有種間遺傳距離中最小為0.055，而在《中國動物志》中把紅狼牙蝦虎魚描述為拉氏狼牙蝦虎魚的別名［1］，說明兩者具有相似的形態(tài)特征和很近的親緣關(guān)系，可能為同種異名；青彈涂魚和大彈涂魚為姊妹分支，兩者的遺傳距離為0.098，表明二者具有較近的系統(tǒng)進化關(guān)系。在傳統(tǒng)的分類中青彈涂魚和大彈涂魚屬于彈涂魚科［22］，本研究中兩種彈涂魚與其它9種蝦虎魚間的平均遺傳距離為0.143小于9蝦虎魚間的平均遺傳距離0.152，進一步佐證了把這2種彈涂魚科魚類歸屬為蝦虎魚科的合理性。

圖1 NJ法構(gòu)建的蝦虎魚科魚類分子系統(tǒng)樹Fig.1 NJ tree from analysis of 16S rRNA gene data of 11 Gobiidae species

線粒體不同基因片段的核苷酸替代速率存在明顯差異，16S rRNA基因是線粒體基因組中研究較多的基因，其進化速度適中，適合于分子系統(tǒng)分類和親緣關(guān)系研究，許多學(xué)者已利用16S rRNA基因部分序列對多種物種進行了種間系統(tǒng)進化關(guān)系分析［24－26］。基于16S rRNA基因構(gòu)建的蝦虎魚科分子系統(tǒng)樹顯示，除了拉氏狼牙蝦虎魚與紅狼牙蝦虎魚聚在一起，兩者可能為同種異名外，同種魚的不同個體均可聚在同一分支內(nèi)，表現(xiàn)出明顯的單系性。總體來講，該分子系統(tǒng)分類結(jié)果與形態(tài)學(xué)的分類單元劃分基本一致，并為新的分類中把青彈涂魚、大彈涂魚、拉氏狼牙蝦虎魚和紅狼牙蝦虎魚歸屬為蝦虎魚科的合理性提供了佐證。線粒體16S rRNA基因作為分子標記獲得的分類結(jié)果與用線粒體COⅠ和核Ryr3等分子標記方法獲得的結(jié)果一致［27］，進一步說明線粒體16S rRNA基因作為分類條形碼適合對蝦虎魚類進行分子鑒定和系統(tǒng)分類研究，為整個蝦虎魚科魚類分子水平的系統(tǒng)發(fā)生和進化等研究提供基礎(chǔ)。

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Phylogenetic analysis of Gobiidae in the Yangtze Estuary based on partial sequence of M itochondrial 16S rRNA

LV Yang1，2，SONG Chao2，LIU Yuan-yuan2，3，ZHAO Feng2，ZHANG Tao2，Gao Yu2，ZHUANG Ping1，2
（1.Wuxi Fisheries College，Nanjing Agricultural University，Wuxi214182，China；2.East China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Shanghai200090，China；3.College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

To determine the role of mitochondrial 16S rRNA genes in classification and identification of species，a total of 34 single individuals from 11 species pertaining to 9 genera of Gobiidae were barcoded by 16S rRNA，and compared with of Gobiidae species recorded in GenBank.Total genomic DNA was extracted from each sample usingmarine animal genome DNA extraction kit.PCR amplification was performed in total volume of 50μL of PCR mixture，and PCR productswere purified and sequenced in single direction using an ABIPRISMTM3 730 XL Automated Sequencer.By statistical analysis of MEGA 5.0 software，the average content of A（30.6%）was significantly higher than that of other three bases，and the average content of A＋T（52.3%）was higher than the G＋C content（47.7%）.The G＋C content of the third position codon was higher than that of the other positions，whose average contentwas 51.1%and the range was from 49.8%to 53.2%.All transitional pairs（si）were slightlymore than that of transversional pairs（sv），and the ratio（R＝si/sv）was 1.45.Based on Maximum Composite Likelihood model，the average distance pairwise-species and within-specieswas 0.151 and 0.002，respectively.The average distance pairwise-species was 76 times that ofwithin-species.According to the neighbor joining（NJ）trees for all34 sequences，itwas demonstrated that Gobiidae in the Yangtze Estuary was amonophyletic group，which further confirmed that the classification ofScartelaos histiophorusandBoleophthalmus pectinirostris，Odontamblyopus lacepediiandOdontamblyopus rubicundus，as Gobiidae was reasonable.O.lacepediiandO.rubicunduswere placed in the same clade with support of a high bootstrap value of 100%，indicating that these two speciesmay be synonyms.Our results highlight that the information from 16S rRNA sequences can not only filter out the synonym of the same species，but also can be used to carry out effective identification for Gobiidae species，which further shows that 16S rRNA is feasible as classification barcode and can provide basis for phylogenetic relationship researches on Gobiidae.

Gobiidae；16S rRNA；molecular systematics

Q 754

A

1004－2490（2016）01－0017－09

2015－04－09

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201203065）

呂 楊（1989－），女，碩士研究生。E-mail：lvyang＿2015＠163.com

莊 平，研究員。E-mail：Pzhuang＠hotmail.com