黃剛哲　姜　華

(延邊大學(xué)附屬醫(yī)院老年病科，吉林　延吉　133000)

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老年胃癌患者外周血樹(shù)突細(xì)胞功能

黃剛哲姜華1

(延邊大學(xué)附屬醫(yī)院老年病科，吉林延吉133000)

〔摘要〕目的探討樹(shù)突細(xì)胞(DCs)在胃癌疾病的發(fā)病機(jī)制。方法健康對(duì)照者與老年胃癌患者各50例，收集外周血，體外給予10 ng/ml巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)及白細(xì)胞介素(IL)-4的血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，第7天DCs收集細(xì)胞及上清，運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)DCs表型表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)方法檢測(cè)細(xì)胞上清腫瘤壞死因子(TNF)-α、 IL-12含量變化，同種混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)檢測(cè)DCs刺激淋巴細(xì)胞增殖和分化的能力。結(jié)果與對(duì)照組相比，胃癌組外周血DCs表面表達(dá)的CD80、CD86、CD40及主要組織相容性(MHC)Ⅱ數(shù)量明顯低(P<0.05)；DCs分泌的TNF-α、 IL-12明顯低(P<0.05)；DCs吞噬能力明顯增加(P<0.05)；DCs刺激淋巴細(xì)胞增殖及分化能力明顯低(P<0.05)。結(jié)論老年胃癌患者外周血DCs呈現(xiàn)未成熟狀態(tài)，提示DCs與胃癌疾病具有很大的相關(guān)性。

〔關(guān)鍵詞〕樹(shù)突細(xì)胞；胃癌；成熟

1延邊大學(xué)附屬醫(yī)院中醫(yī)科

第一作者：黃剛哲(1964-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事老年病研究。

胃癌致病機(jī)制至今未明，但多種研究認(rèn)為其與免疫因素密切相關(guān)〔1〕。樹(shù)突細(xì)胞(DCs)作為機(jī)體內(nèi)最重要的抗原遞呈細(xì)胞(APC)，在機(jī)體起著重要作用。成熟DCs可以高表達(dá)多種共刺激因子，如CD86，CD80，CD40，主要組織相容性復(fù)合體(MHC)Ⅱ等，高分泌多種細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素(IL)-12，腫瘤壞死因子(TNF)-α，誘導(dǎo)幼稚的T細(xì)胞分化成熟，促進(jìn)T細(xì)胞向TH1/TH2極化，從而激活免疫應(yīng)答〔2~4〕。本研究旨在探討DCs在胃癌疾病發(fā)生發(fā)展中的意義。

1資料與方法

1.1一般資料2013年6月到2015年1月我院消化內(nèi)科就診的老年胃癌患者50例為胃癌組，其中男30例，女20例，年齡60～77歲，平均(67.6±11.5)歲。經(jīng)術(shù)后病理檢查確診為胃癌，術(shù)前未接受抗腫瘤治療，且患者心肝功能基本正常，排除自身存在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性血管炎等其他風(fēng)濕性免疫性疾病，病毒性肝炎、心梗、糖尿病等影響免疫系統(tǒng)的疾病的患者。健康志愿者50例為對(duì)照組，其中男28例，女22例，年齡61～79歲，平均(68.2±10.5)歲。健康志愿者不存在胃癌的臨床癥狀，并且影像學(xué)檢查未見(jiàn)異常，心肝功能基本正常。兩組性別、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本調(diào)查符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，患者與家屬知情同意。

1.2標(biāo)本采集分別收集血液標(biāo)本8 ml，肝素抗凝。

1.3DCs的分離培養(yǎng)將血液標(biāo)本與磷酸鹽緩沖液(PBS)倍比稀釋混勻，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行步驟操作，將混合液輕輕置于淋巴細(xì)胞分離液上，4℃，3 000 r/min，離心30 min。輕輕取出離心管，此時(shí)會(huì)出現(xiàn)分層，將第二層白膜細(xì)胞洗出置于另一離心管中，加入PBS清洗，獲得單個(gè)核細(xì)胞備用。配置含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，并加入巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)及IL-4細(xì)胞因子(均購(gòu)于Peprotech公司)，終濃度均為10 ng/ml。將獲得的單個(gè)核細(xì)胞用上述聯(lián)合培養(yǎng)基重懸，于6孔板中培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后全量換液，棄去漂浮的細(xì)胞，并再加入上述聯(lián)合培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，隔天進(jìn)行半量換液。繼續(xù)培養(yǎng)至第7天，收集細(xì)胞及上清用于實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

1.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表型收集培養(yǎng)第7天的細(xì)胞，與用異硫氰酸酯(FITC)或藻紅沅素(PE)標(biāo)記的流式抗體CD80、CD86、CD40及MHCⅡ(均購(gòu)于ebioscience公司)混合，4℃孵育30 min，PBS洗滌2次后，每管加入300 μl的PBS溶液重懸后，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，記錄結(jié)果為陽(yáng)性細(xì)胞所占的比例。

1.5細(xì)胞因子檢測(cè)收集培養(yǎng)第7天細(xì)胞上清，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，應(yīng)用IL-10、 IL-12、IL-2及干擾素(IFN)-γ 酶聯(lián)免疫試劑盒(ebioscience公司)，檢測(cè)上清細(xì)胞因子含量。

1.6吞噬功能檢測(cè)收集培養(yǎng)第7天的細(xì)胞，與用異硫氰酸酯(FITC)標(biāo)記的抗體右旋糖苷混合，將抗體右旋糖苷作為外來(lái)抗原，以吞噬此抗原的細(xì)胞含量比例為檢測(cè)吞噬功能的指標(biāo)。4℃孵育50 min，PBS洗滌2次后，每管加入300 μl的PBS溶液重懸后，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，記錄結(jié)果為陽(yáng)性細(xì)胞所占的比例。

1.7同種混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)取健康志愿者外周血10 ml，經(jīng)過(guò)淋巴細(xì)胞分離液梯度離心后獲取單個(gè)核細(xì)胞，PBS洗滌后，于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，24 h后收集懸浮細(xì)胞，視其為淋巴細(xì)胞。將收集培養(yǎng)第7天的DCs用絲裂霉素C 25 μg/ml，處理 45 min后用PBS洗滌收集細(xì)胞，用10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml，取100 μl置于96孔板中。并將淋巴細(xì)胞也用10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml，也取100 μl置于96孔板中，使DCs與淋巴細(xì)胞混合的最終容積為200 μl，然后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h。于培養(yǎng)結(jié)束時(shí)進(jìn)行下續(xù)實(shí)驗(yàn)：①向每孔加入20 μl的MTS/PMS混合液，培養(yǎng)3 h后，應(yīng)用光密度儀進(jìn)行光密度檢測(cè)，以O(shè)D值來(lái)反映淋巴細(xì)胞增殖程度；②取細(xì)胞上清細(xì)胞因子分泌來(lái)檢測(cè)T淋巴細(xì)胞分化狀況。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1各組外周血DCs表面共刺激分子表達(dá)胃癌組外周血DCs表面表達(dá)的CD80、CD86、CD40及MHCⅡ明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.2各組外周血DCs細(xì)胞因子分泌胃癌組外周血DCs分泌的TNF-α、 IL-12明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.3各組對(duì)象外周血DCs吞噬能力胃癌組吞噬能力(2.5±0.6)%，對(duì)照組(1.1±0.9)%，外周血DCs吞噬能力明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。

2.4各組外周血DCs刺激淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)胃癌組OD值(1.6±0.5)，對(duì)照組(3.2±0.6)，外周血DCs刺激淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)能力明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。

2.5各組外周血巨噬細(xì)胞刺激T淋巴細(xì)胞分化胃癌組外周血巨噬細(xì)胞刺激T淋巴細(xì)胞分泌IL-2含量及IFN-γ含量明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1　兩組外周血DCs表面共刺激分子、細(xì)胞因子分泌、外周血巨噬細(xì)胞刺激T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子表達(dá)變化±s,n=50)

與對(duì)照組比較:1)P<0.05

3討論

研究認(rèn)為胃癌患者體內(nèi)機(jī)體的免疫功能多低下或被抑制，腫瘤對(duì)機(jī)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生逃逸。免疫細(xì)胞、表皮生長(zhǎng)因子受體、細(xì)胞因子及細(xì)胞黏附分子及其他因素均參與發(fā)病〔5〕。其中，T淋巴細(xì)胞作為一種重要的免疫細(xì)胞，直接參與機(jī)體的腫瘤免疫調(diào)節(jié)。研究表明，胃癌患者外周血的增殖性T細(xì)胞能力明顯降低；控制腫瘤生長(zhǎng)的CD8+T明顯降低，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞顯著升高〔6,7〕。

近年來(lái)，隨著 DCs 生物學(xué)特性和功能的深入研究，發(fā)現(xiàn)DCs 的成熟狀態(tài)是決定其有效呈遞抗原的關(guān)鍵因素，會(huì)直接影響免疫應(yīng)答的反應(yīng)，從而影響機(jī)體的各種生命活動(dòng)〔8，9〕。正常機(jī)體絕大多數(shù)DCs處于未成熟狀態(tài)，多位于實(shí)體器官及非淋巴組織的上皮，具有較強(qiáng)的抗原攝取能力，但抗原遞呈及表達(dá)協(xié)同刺激分子能力較弱。未成熟DCs攝取抗原后，遷移到引流淋巴結(jié)，逐漸發(fā)育成熟，成為成熟DCs，高表達(dá)MHC類(lèi)分子及CD80，CD86，CD40等共刺激分子，分泌IL-12、TNF-α等炎性細(xì)胞因子，激活T細(xì)胞應(yīng)答，誘導(dǎo)免疫反應(yīng)〔10〕。然而，DCs也可以分泌抗炎性細(xì)胞因子，如IL-10，可通過(guò)誘導(dǎo)免疫耐受，或是促進(jìn)Th2細(xì)胞分化來(lái)影響免疫反應(yīng)〔11〕。

本研究提示，胃癌患者外周血DCs呈現(xiàn)未成熟的狀態(tài)，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖及分化能力降低，推測(cè)其在調(diào)節(jié) Th1/Th2平衡中可能起到重要作用，但仍需進(jìn)一步研究探討。

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〔2014-11-19修回〕

(編輯苑云杰)

基金項(xiàng)目：延邊地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目(81160476)

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R735.2

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)04-0804-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.04.015