張　笛　晉瓊玉

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院　四川省人民醫(yī)院消化內(nèi)科，四川　成都　610072)

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失代償期乙型肝炎肝硬化患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)自體外周血淋巴細(xì)胞及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群增殖的影響

張笛晉瓊玉1

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院四川省人民醫(yī)院消化內(nèi)科，四川成都610072)

〔摘要〕目的研究乙型肝炎肝硬化失代償期患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)對(duì)其外周血中淋巴細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群(Tregs)增殖的影響。方法12例乙型肝炎肝硬化失代償期患者骨髓分離培養(yǎng)出間充質(zhì)干細(xì)胞，采用倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)后的貼壁細(xì)胞形態(tài)、采用流式細(xì)胞儀技術(shù)觀察間充質(zhì)細(xì)胞免疫表型；在植物血凝素(PHA)刺激下、自體血清作為培養(yǎng)基，實(shí)施BMSCs和患者自體外周血淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，分為A組(BMSCs+淋巴細(xì)胞+PHA接觸培養(yǎng))、B組(BMSCs+淋巴細(xì)胞+PHA非接觸培養(yǎng))、C組(淋巴細(xì)胞+PHA培養(yǎng))、D組(淋巴細(xì)胞)，均72 h后觀察BMSCs對(duì)外周血淋巴細(xì)胞增殖及Tregs細(xì)胞表達(dá)的影響。結(jié)果流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示：培養(yǎng)3代后的間充質(zhì)干細(xì)胞主要高表達(dá)T細(xì)胞亞群(Tregs)中的CD44(95.26%)、CD29(92.18%)，低表達(dá)CD34(1.27%)、CD25(1.33%)。 C組淋巴細(xì)胞增殖率顯著高于A、B、D組(P<0.05),A、B兩組顯著高于D組(P<0.05),但A、B兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 A、B、C組Tregs細(xì)胞表達(dá)率顯著高于D組(P<0.05),A、B兩組顯著高于C組(P<0.05),A、B兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論乙型肝炎肝硬化失代償期患者BMSCs對(duì)其外周血中淋巴細(xì)胞增殖具有抑制作用、同時(shí)調(diào)上調(diào)T細(xì)胞亞群表達(dá)，BMSCs可能具有免疫抑制作用。

〔關(guān)鍵詞〕乙型肝炎肝硬化；失代償期；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；淋巴細(xì)胞；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞

1四川省郫縣人民醫(yī)院內(nèi)科

第一作者：張笛(1980-)，女，主治醫(yī)師，主要從事慢性肝病研究。

充質(zhì)干細(xì)胞為中胚層或者外胚層來源的具有多向分化潛能的干細(xì)胞，在部分誘導(dǎo)因子的刺激下可以分化為脂肪、肌肉、骨骼及部分內(nèi)臟器官組織，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)為最早發(fā)現(xiàn)的多向分化潛能干細(xì)胞，具有自我增殖、免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)造血及促進(jìn)干細(xì)胞植入的作用〔1,2〕，近年來部分學(xué)者通過BMSCs治療失代償期肝硬化，并認(rèn)為BMSCs可以通過在肝臟組織細(xì)胞損傷部位重新分化增殖為正常干細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)肝臟新生組織細(xì)胞再生，改善患者的臨床癥狀〔3,4〕。BMSCs對(duì)于局部肝臟細(xì)胞免疫抑制及抗炎作用可能發(fā)揮了較為重要的作用，本文擬通過了解乙肝肝硬化失代償期患者BMSCs對(duì)其外周血中淋巴細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群(Tregs)增殖的影響，進(jìn)一步了解BMSCs對(duì)乙肝肝硬化失代償期患者治療的作用機(jī)制。

1資料與方法

1.1一般資料2014年3~12月12例乙肝肝硬化失代償期患者，男8例，女4例，年齡52～71歲，平均(64.2±8.7)歲，肝功能Child-Pugh評(píng)分(12.6±2.3)分，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)(33.6±21.5)U/L，總膽紅素(TBIL)(42.2±22.7)μmol/L。符合2010 年版“慢性乙型肝炎防治指南”中關(guān)于失代償期乙型肝炎肝硬化的診斷標(biāo)準(zhǔn)；近期未使用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等藥物；均知情同意。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器與藥品兔抗CD44、CD29、CD34及CD25抗體均購自南京凱基生物科技有限公司，間充質(zhì)干細(xì)胞及淋巴細(xì)胞分離液購自江蘇太生生物科技有限公司。

1.3檢測方法卵巢細(xì)胞株培養(yǎng)至融合度為50%時(shí)，接種于干細(xì)胞培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，孵育24 h后用胰蛋白酶消化液〔不含乙二胺四乙酸(EDTA)〕消化細(xì)胞，離心收集細(xì)胞后用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞1次(2 000 r/min，5 min)，加入CD44、CD29、CD34及CD25抗體，室溫孵育20 min，生理鹽水洗滌3次，每次5 min，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測各標(biāo)記抗體細(xì)胞群分布。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SAS9.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1BMSCs培養(yǎng)結(jié)果鑒定均成功分離培養(yǎng)出原代BMSCs，培養(yǎng)至第3代，其純度可達(dá)到95%，BMSCs細(xì)胞多于12 h后開始貼壁生長，倒置顯微鏡下觀察可見BMSCs呈貼壁梭形、多角，呈平行排列或呈漩渦狀，見圖1。培養(yǎng)3代后的BMSCs主要高表達(dá)Tregs中的CD44(95.26%)、CD29(92.18%)，低表達(dá)

CD34(1.27%)、CD25(1.33%)。見圖2。

2.2BMSCs對(duì)外周血淋巴細(xì)胞增殖的影響作用C組淋巴細(xì)胞增殖率(63.18%±8.14%)顯著高于A(32.57%±6.84%)、B(34.72%±5.25%)、D組(5.26%±1.74%)(F=28.93，P<0.001),A、B兩組顯著高于D組(P<0.05),A、B兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3BMSCs對(duì)外周血Tregs細(xì)胞亞群的影響作用A、B、C組Tregs細(xì)胞表達(dá)率(48.05%±9.22%、46.25%±7.20%、21.47%±5.50%)顯著高于D組(4.26%±1.52%)(F=21.096，P<0.01),A、B兩組顯著高于C組(P<0.05),A、B兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1　BMSCs原代培養(yǎng)(倒置顯微鏡，×40)

圖2　流式細(xì)胞儀檢測BMSCs表面抗原分子

3討論

肝硬化晚期可表現(xiàn)為腹水、低蛋白血癥、凝血功能障礙及較為嚴(yán)重的門脈高壓癥狀，部分患者可因肝性腦病的發(fā)生而引起病死率的上升〔5〕。近年來BMSCs已廣泛應(yīng)用于治療失代償期肝硬化，考慮BMSCs可以通過抑制IL-6及腫瘤壞死因子(TNF)-α等炎癥趨化因子進(jìn)而抑制級(jí)聯(lián)式的炎癥反應(yīng)，并通過抑制Toll樣受體四種亞型進(jìn)而抑制其進(jìn)入干細(xì)胞線粒體導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，另外部分學(xué)者認(rèn)為BMSCs可對(duì)金屬基質(zhì)蛋白酶(MMP)-9及MMP-6的生成調(diào)節(jié)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞外纖維成分的降解，減輕纖維化的肝臟組織〔6,7〕。但迄今為止，對(duì)于BMSCs對(duì)免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的探討較少，僅有部分學(xué)者通過建立動(dòng)物模型進(jìn)而發(fā)現(xiàn)BMSCs可以通過調(diào)節(jié)CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞及TH1/TH2淋巴細(xì)胞平衡，進(jìn)而參與失代償期肝硬化的治療過程〔8〕，Yu等〔9〕通過雌激素刺激BMSCs治療的肝硬化組織后發(fā)現(xiàn)，其細(xì)胞內(nèi)Toll樣受體3的表達(dá)明顯上調(diào)，并認(rèn)為雌激素可能通過抑制雌激素受體(ER)/Cyclin信號(hào)通路進(jìn)而參與抑制IL-6炎癥介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)炎癥反應(yīng)。

部分學(xué)者認(rèn)為在失代償性肝硬化的發(fā)生發(fā)展過程中，D44+CD29+Treg干細(xì)胞呈現(xiàn)出了降低的趨勢(shì)，但并無明顯的相關(guān)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)如血清白蛋白及凝血功能指標(biāo)的依賴性〔10〕，本研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)3代后的間充質(zhì)干細(xì)胞主要高表達(dá)Tregs中的CD44+CD29+，證實(shí)了MSCs可能通過逆轉(zhuǎn)或者恢復(fù)CD44+CD29+Treg淋巴細(xì)胞進(jìn)而促進(jìn)干細(xì)胞再生，在BMSCs的刺激下淋巴細(xì)胞的增殖能力并不依賴植物血凝素的影響，貼壁或者不貼壁生長均不能顯著影響淋巴細(xì)胞的增殖效能，考慮BMSCs對(duì)于淋巴細(xì)胞增殖的影響可能通過可溶性細(xì)胞因子如可溶性雌激素末端磷酸化產(chǎn)物而起效〔11〕，而無BMSCs刺激的淋巴細(xì)胞增殖率明顯增高，提示了BMSCs對(duì)于淋巴細(xì)胞增殖率的抑制作用，這與Xu等〔12〕認(rèn)為的BMSCs通過抑制除了抗原提呈細(xì)胞(APC)在內(nèi)的多數(shù)淋巴細(xì)胞增殖進(jìn)而促進(jìn)局部細(xì)胞再生觀點(diǎn)較為相似。另外，BMSCs對(duì)外周血Tregs細(xì)胞亞群的影響較為明顯，提示BMSCs對(duì)于Tregs細(xì)胞表達(dá)的上調(diào)作用，Xu等〔12〕認(rèn)為轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β及IL-10的調(diào)節(jié)作用參與免疫抑制過程，Jang等〔10〕通過探討35例肝硬化患者的臨床資料后也認(rèn)為，Tregs細(xì)胞表達(dá)陽性率伴隨了肝硬化門靜脈高壓期發(fā)展的全過程。

綜上所述，BMSCs對(duì)于乙肝肝硬化失代償期患者外周血中淋巴細(xì)胞增殖具有抑制作用，同時(shí)可上調(diào)Tregs細(xì)胞表達(dá)陽性率，可能進(jìn)而發(fā)揮其促進(jìn)肝細(xì)胞再生及緩解肝纖維化的作用。本次研究的例數(shù)較少，需進(jìn)一步擴(kuò)大研究樣本。

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〔2014-11-23修回〕

(編輯苑云杰)

Effect of bone marrow mesenchymal stem cells on proliferation and Tregs subsets of peripheral blood lymphocytes in patients with chronic hepatitis B cirrhosis

ZHANG Di,JIN Qiong-Yu.

Department of Gastroenterology，Sichuan Academy of Medical Science & Sichuan Provincial People's Hospital，Chengdu 610072，Sichuan，China

【Abstract】ObjectiveTo study the effect of bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs)on the value of T cells in the peripheral blood of patients with cirrhosis of liver cirrhosis.Methods12 patients with hepatitis B liver cirrhosis decompensation period were selected,and their BMSCs were separated and cultured.Adherent cells morphology were observed by inverted microscope,immunophenotype of BMSCs were detected by flow cytometry instrument technique.BMSCs and autologous peripheral blood lymphocytes were co-cultured in autologous serum and phytohemagglutinin(PHA)stimulation.Groups were divided into:group A(BMSCs+ lymphocytes +PHA culture in contact),group B(BMSCs+ lymphocytes +PHA culture non-contact),group C(lymphocytes +PHA culture),and group D(lymphocytes).Effects of BMSCs on peripheral blood lymphocyte proliferation and Tregs were observed after cultured for 72 h.ResultsFlow cytometric analysis results showed that the culture after 3 generations of mesenchymal stem cells mainly highly expressed T cell subsets(Tregs)of CD44(95.26%),CD29-(92.18%)and lowly expressed CD34(1.27%),CD25(1.33%).Lymphocyte proliferation rate in Group C was significantly higher than that of group A,B and D(P<0.05).Lymphocyte proliferation rate in Group A,B was significantly higher than that of group D(P<0.05).There was no significant difference in lymphocyte proliferation rate between group A and B(P>0.05).Tregs expression rate in group A,B and C was significantly higher than that of group D(P<0.05),Tregs expression rate in group A,B was significantly higher than that of group C(P<0.05).There was no significant difference in Tregs expression rate between group A and B(P>0.05).ConclusionsBMSCs in the patients with chronic hepatitis B cirrhosis decompensation period have inhibition effect on the proliferation of peripheral blood,and could up-regulate the expression of T cells in the same time.BMSCs might have immunosuppressive effect.

【Key words】Hepatitis B cirrhosis;Decompensation;Bone marrow mesenchymal stem cells;Lymphocytes;Regulatory T cells

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.50063753)；四川省衛(wèi)生廳基金項(xiàng)目(No.110184)

〔中圖分類號(hào)〕R575.2

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)04-0792-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.04.009