桂瑞豐,胡文輝
(1.黃岡市中心醫(yī)院檢驗科,湖北 黃岡 438000;
2.鄂州市中心血站質(zhì)量管理科,湖北 鄂州 436000)
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miRNA在肝癌患者血清中的表達及意義
桂瑞豐1,胡文輝2
(1.黃岡市中心醫(yī)院檢驗科,湖北 黃岡438000;
2.鄂州市中心血站質(zhì)量管理科,湖北 鄂州436000)
摘要:目的探討肝細胞性肝癌(HCC)患者血清中miR-27a、miR-30a、miR-106b、miR-490這四種miRNAs的表達變化及臨床意義。方法選取50例肝癌患者為研究組、50例慢性肝病患者及50例健康體檢者為對照組,應用實時熒光定量PCR法檢測各組血清四種miRNAs表達水平,并比較其與患者臨床病理特征之間的關(guān)系,應用受試者回歸(ROC)曲線分析miRNA對于肝癌診斷的價值。結(jié)果血清miR-27a、miR-30a、miR-490在HCC患者、慢性肝病患者及健康對照中表達無顯著差異(P>0.05),HCC患者血清miR-106b表達水平較正常對照組及慢性肝病組均顯著升高(P<0.05);血清miR-106b表達水平在不同腫瘤分化程度及臨床分期有顯著差異(P<0.05);ROC曲線分析顯示血清miR-106b區(qū)分肝癌與慢性肝病及正常人的臨界值為0.038,曲線下面積( AUC)為0.782,診斷敏感度為0.82,特異度為0.75。結(jié)論miR-106b在肝癌患者血清中表達升高顯著,可作為肝癌診斷與預后評估的有效指標。
關(guān)鍵詞:肝細胞性肝癌;miRNA;血清水平
細胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)簡稱肝癌是最常見的惡性腫瘤之一,也為肝臟最主要的惡性腫瘤,在所有癌癥中死亡率排名第三[1]。肝癌的早期癥狀不明顯,大多數(shù)肝癌患者發(fā)現(xiàn)時已是晚期,且其復發(fā)率較高,手術(shù)后極易復發(fā),故肝癌患者的總體5年生存率極低[2]。近年來對于肝癌診斷的特異性標志物的研究一直是國內(nèi)外的研究熱點之一,微小RNA(microRNAs, miRNAs)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展的密切關(guān)系已被證實,其正在成為腫瘤標志物研究的新熱點[3]?,F(xiàn)有的研究表明miR-27a、miR-30a、miR-106b與miR-490與惡性腫瘤高度相關(guān),miR-27a與miR-30a異常表達在食管癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌等多種腫瘤中[4-6],miR-106b與miR-490在肝癌患者組織或細胞中表達異常,并與肝癌的病理學特征具有一定關(guān)系[7-8],為了了解這四種miRNAs在HCC患者血清中的表達水平,并分析它們的在臨床應用的實際意義,報道如下。
1資料與方法
1.1一般資料選取2014年2—12月來黃岡市中心醫(yī)院初診的50例肝癌患者為研究組,年齡25~67歲,平均年齡(51.4±12.8)歲,男32例,女18例,入組標準:知情同意,首次確診為HCC,未接受任何手術(shù)、化療、放療治療,并排除既往有腫瘤病史患者;選取同期來我院就診的50例慢性乙肝或慢性乙肝所致肝硬化患者為慢性肝病對照組,其中男35例,女15例,年齡(54.3±11.7)歲;選取同期來我院體檢中心進行健康體檢的健康成年人為健康對照組,其中男34例,女16例,年齡(52.7±12.4)歲,各組的一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
1.2儀器與試劑RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及Real-Time PCR(SYBR Green)試劑盒均購自上海羅氏公司,miR-27a、miR-30a、miR-106b、miR-490及內(nèi)參miR-16引物均由上海生工設計合成。熒光定量PCR儀為美國Applied Biosystems公司 ABI 7500 Real time PCR儀。
1.3實驗方法
1.3.1血清標本的采集與保存采集患者及健康對照靜脈血標本3~5 mL,排除黃疸、脂濁及溶血標本,常溫靜置30 min,待其充分凝結(jié)析出血清后4℃下3 000 r·min-1離心20 min,吸出上清液4℃下16 000 r·min-1離心10 min,小心吸取上清血清放入無RNA酶的1.5 mL EP管中-80℃超低溫冰箱保存。
1.3.2總RNA的提取將血清標本于超低溫冰箱中取出并迅速置于37℃水浴中解凍,取200 μL血清按照RNA提取試劑盒說明書提取總RNA,與RNA保存液置于無RNA酶的1 mL EP管中,立即進行逆轉(zhuǎn)錄PCR。
1.3.3逆轉(zhuǎn)錄PCR按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進行操作,由于miRNA分子較短,故選用加尾法逆轉(zhuǎn)錄,并在無RNA酶的PCR管中進行PCR反應,反應結(jié)束后將獲得的cDNA分裝保存于-80℃超低溫冰箱備用。
1.3.4熒光定量PCR按照Real-Time PCR(SYBR Green)檢測試劑盒說明書操作,反應體系20 μL,反應條件95℃15 s,55℃30 s,70℃34 s,共40循環(huán),并于70℃時采集熒光信號,反應重復三次取平均值為最終結(jié)果。
1.3.5結(jié)果判定記錄反應Ct值,以miR-16為定量參照,以2-△Ct表示各miRNA的相對表達,△Ct= CtmiRNA-CtmiR-16。
1.4統(tǒng)計學分析應用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析,miRNA的相對表達量用中位數(shù)(四分位數(shù))表示,組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。此外,受試者回歸曲線(Receiver operating characteristics,ROC)分析使用SAS 6.12軟件進行。顯著性水準α=0.05。
2結(jié)果
2.1miRNAs的表達情況熒光定量PCR反應擴增曲線見圖1,研究組、慢性肝病對照組及健康對照組的各miRNA相對表達情況見表1。miR-27a、miR-30a與miR-490的相對表達量各組間無顯著差異(P>0.05),研究組miR-106b相對表達量顯著大于健康對照組(P<0.05),而慢性肝病對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
2.2HCC患者血清miRNA表達水平與臨床病理特征的關(guān)系HCC患者的miR-27a、miR-30a與miR-490的血清相對表達量在患者性別、年齡、腫瘤直徑、分化程度以及TNM分期中的比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),miR-106b在HCC患者臨床病理特征中的不同表達見表2,miR-106b在年齡、性別、腫瘤直徑上表達無顯著差異(P>0.05),腫瘤細胞分化程度低的患者的血清miR-106b相對表達明顯高于分化程度高、中的患者(P<0.05),TNM分期Ⅲ/Ⅳ的患者的血清miR-106b相對表達明顯高于Ⅰ/Ⅱ期患者(P<0.05)。
圖1 部分樣本的熒光定量PCR反應擴增曲線
miRNA研究組慢性肝病對照組健康對照組miR-27a1.362(0.967,1.758)1.181(0.875,1.363)1.056(0.789,1.341)miR-30a0.742(0.647,0.975)0.841(0.712,0.983)0.973(0.773,1.148)miR-106b0.051(0.034,0.091)*0.024(0.015,0.043)0.021(0.012,0.041)miR-4900.062(0.047,0.081)0.071(0.052,0.085)0.074(0.057,0.088)
注:與健康對照相比,*P<0.05。
表2 miR-106b的表達與臨床病理特征的關(guān)系
2.3血清miR-106b的診斷價值用血清miR-106b的相對表達作為標志物用于區(qū)分HCC患者與慢性肝病患者及健康對照,綜合特異度與靈敏度選擇兩者之和最大截斷點(Cut-off)為臨界值,結(jié)果表明:臨界值為0.038,敏感度為0.82,特異度為0.75,曲線下面積(Area under curve,AUC)為0.782(95%CI:0.658~0.871,P<0.01)。用該臨界值對慢性肝病患者及HCC患者進行鑒別診斷的結(jié)果見表3,敏感度為0.80,特異度為0.72。
表3 血清miR-106b對HCC的診斷結(jié)果/例
3討論
miRNA是一類內(nèi)源性的小分子非編碼RNA,具有高度的穩(wěn)定性,在mRNA 水平調(diào)節(jié)靶基因的表達,參與調(diào)控有機體的生命活動并在細胞各項正常生命活動及包括腫瘤在內(nèi)的各種疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用,近年來由于其與癌癥等疾病的良好關(guān)聯(lián)性,使其成為對各類癌癥具有潛在臨床診療價值的腫瘤標志物的新選擇[9]。本研究根據(jù)這一原理,分析了4個miRNAs在HCC患者、慢性肝病患者和健康人對照血清中的表達,研究這幾種miRNAs與HCC臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系以及對 HCC 的診斷價值。
miR-27a與miR-30a已被證實與前列腺癌、乳腺癌、胃癌等多種惡性腫瘤密切相關(guān)。在乳腺癌,miR-27a通過間接促進血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等促進腫瘤轉(zhuǎn)移的存活素的表達來促進腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移,miR-27a在乳腺浸潤性癌中高表達,且高表達miR-27a的乳腺癌患者預后較差,5年生存率較低[10]。在前列腺癌中,miR-30a可通過影響肝細胞生長因子與EGF(表皮生長因子)等致癌因子的表達來抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,發(fā)揮抑制腫瘤的作用[11]。而在本研究中,miR-27a與miR-30a在HCC患者、慢性肝病患者及健康對照血清中表達無顯著差異(P>0.05),它們在HCC發(fā)生發(fā)展中的意義尚待進一步大樣本的研究考證。miR-490被認為可能為一種抑癌基因,并在結(jié)直腸癌、膀胱癌等惡性腫瘤中低表達[12],但在肝癌患者組織中表達上調(diào)[8],但本研究在HCC患者、慢性肝病患者及健康對照血清中未發(fā)現(xiàn)miR-490的表達差異(P>0.05),其與HCC的關(guān)系尚待進一步研究。
miR-106b是miR-106b~25簇的組成部分,位于人第7號染色體長臂上,miR-106b與腫瘤的密切聯(lián)系已在多種腫瘤中被證實,其表達的升高與腫瘤的惡性程度正相關(guān),如前列腺癌、胃癌等[13-14]。在肝癌中,miR-106b被證實在肝癌組織中表達升高,并且在高轉(zhuǎn)移細胞系中顯著升高[7]。在本研究中,血清miR-106b的表達水平在HCC患者中較慢性肝病與健康對照顯著升高,且HCC患者的miR-106b血清表達水平在不同腫瘤細胞分化程度、TNM分期顯著不同,腫瘤細胞分化程度低的患者的血清miR-106b相對表達明顯高于分化程度高、中的患者(P<0.05),TNM分期Ⅲ/Ⅳ的患者的血清miR-106b相對表達明顯高于Ⅰ/Ⅱ期患者(P<0.05),提示miR-106b在鑒別HCC患者的臨床病理參數(shù)、腫瘤惡性程度及術(shù)前病情評估上有廣闊的應用前景。
在用miR-106b作為標志物對HCC患者、慢性肝病患者及健康對照進行診斷的研究中,ROC曲線分析顯示,最佳臨界值為0.038,敏感度為0.82,特異度為0.75,具有較高的診斷價值,且其在對區(qū)分慢性肝病與HCC上仍有較高的敏感度與特異度,提示其對肝癌早期診斷有著潛在的篩查價值,可用于對慢性肝炎及肝硬化患者等肝癌高危人群的篩查診斷。
參考文獻:
[1]鐘文洲,陳正義,王齊全.原發(fā)性肝癌發(fā)病危險因素的病例對照分析[J].安徽醫(yī)藥,2014,18(2):275-277.
[2]Schwartz M,Roayaie S,Konstadoulakis M. Strategies for the management of hepatocellular carcinoma[J].Nature Clinical Practice Oncology,2007,4(7):424-432.
[3]陳勝,王亮,曹爽,等.外周血中microRNA用于肝癌診斷的研究進展[J]. 國際消化病雜志,2014,34(6):389-391.
[4]Tang W,Zhu J,Su S,et al. MiR-27 as a prognostic marker for breast cancer progression and patient survival[J]. PLoS One,2012,7(12):e51702.
[5]Kao CJ,Martiniez A,Shi XB,et al.miR-30a as a tumor suppressor connects EGF/Src signal to ERG and EMT[J].Oncogene,2014,33(19):2495-2503.
[6]Markou A,Sourviou I,Vorkas PA,et al.Clinical evaluation of microRNA expression profiling in non small cell lung cancer[J].Lung Cancer,2013,81(3): 88-96.
[7]Yau WL, Lam CS,Ng L,et al. Over-expression of miR-106b promotes cell migration and metastasis in hepatocellular carcinoma by activating epithelial-mesenchymal transition process[J].PloS One, 2013,8(3):e57882.
[8]Zhang LY, Liu M, Li X, et al. miR-490-3p modulates cell growth and epithelial to mesenchymal transition of hepatocellular carcinoma cells by targeting endoplasmic reticulum-Golgi intermediate compartment protein 3 (ERGIC3)[J].The Journal of Biological Chemistry,2013,288(6):4035-4047.
[9]Markou A,Sourvinou I,Vorkas PA,et al. Clinical evaluation of microRNA expression profiling in non small cell lung cancer[J].Lung Cancer,2013,81(3): 88-96.
[10] Tang W,Zhu J,Su S,et al. MiR-27 as a prognostic marker for breast cancer progression and patient survival[J]. PLoS One, 2012,7(12):e51702.
[11] Kao CJ,Martiniez A,Shi XB,et al. miR-30a as a tumor suppressor connects EGF/Src signal to ERG and EMT[J].Oncogene, 2014, 33(19): 2495-2503.
[12] Hamfjord J,Stangeland AM, Hughes T, et al. Differential expression of miRNAs in colorectal cancer: comparison of paired tumor tissue and adjacent normal mucosa using high-throughput sequencing[J]. PloS One,2012,7(4):e34150.
[13] Yao YL,Wu XY,Wu JH,et al. Effects of microRNA-106 on proliferation of gastric cancer cell through regulating p21 and E2F5[J]. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention:APJCP,2013,14(5):2839-2843.
[14] Hudson RS,Yi M,Esposito D,et al. MicroRNA-106b-25 cluster expression is associated with early disease recurrence and targets caspase-7 and focal adhesion in human prostate cancer[J]. Oncogene,2013,32(35):4139-4147.
關(guān)于文稿中法定計量單位的書寫要求
本刊法定計量單位實行國務院1984年2月頒布的《中華人民共和國法定計量單位》,并以單位符號表示,具體使用參照1991年中華醫(yī)學會編輯出版部編輯的《法定計量單位在醫(yī)學上的應用》一書。注意單位名稱與單位符號不可混合使用,如ng·kg-1·天-1應改為ng·kg-1·min-1;組合單位符號中表示相除的斜線多于1條時,應采用負數(shù)冪的形式表示,如ng/kg/min應采用ng·kg-1·min-1的形式;組合單位中斜線和負數(shù)冪亦不可混用,如前例不宜采用ng/kg·min-1的形式。在首次出現(xiàn)不常用的法定計量單位處用括號加注與舊制單位的換算系數(shù),下文再出現(xiàn)時只列法定計量單位。人體及動物體內(nèi)的壓力單位使用mmHg或cmH2O,但文中首次出現(xiàn)時用括號加注(1 mmHg=0.133 kPa)。正文中時間的表達,凡前面帶有具體數(shù)據(jù)者應采用d、h、min、s,而不用天、小時、分鐘、秒。量的符號一律用斜體字母,如吸光度(舊稱光密度)的符號為A,“A”為斜體字。
收稿日期:(2015-09-20,修回日期:2015-11-17)
doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.01.037