牟麗麗， 涂云華， Syren de Hoog，劉濤華， 呂 倩， 王顏顏， 陳 燕， 康穎倩*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 微生物學(xué)教研室， 貴州 貴陽 550004； 2.CBS荷蘭皇家科學(xué)院 真菌生物多樣性中心， 荷蘭 烏得勒支 85167)

工廠化生產(chǎn)香腸腸衣腐爛黑斑中嗜鹽細(xì)菌的分離鑒定及其特征特性

牟麗麗1， 涂云華1， Syren de Hoog2，劉濤華1， 呂 倩1， 王顏顏1， 陳 燕1， 康穎倩1*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 微生物學(xué)教研室， 貴州 貴陽 550004； 2.CBS荷蘭皇家科學(xué)院 真菌生物多樣性中心， 荷蘭 烏得勒支 85167)

為工廠化生產(chǎn)的相關(guān)食品及農(nóng)產(chǎn)品儲存過程中微生物的鑒定及抑菌對策提供理論依據(jù)，采用高鹽察氏液體培養(yǎng)基(Czapek Dox Broth)梯度鹽濃度培養(yǎng)法，CDA(Czapek Dox Agar)及TSA(Trypticase Soy Agar)固體培養(yǎng)基進(jìn)行分離純化，16S rRNA基因測序，鄰接法構(gòu)建16S rRNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹等方法，對工廠生產(chǎn)香腸腸衣腐爛黑斑中嗜鹽細(xì)菌進(jìn)行分離鑒定，研究其特征特性。結(jié)果表明：25%～30%鹽濃度固體培養(yǎng)基中分離到3株嗜鹽細(xì)菌(Gyfl1，Gyfl2，Gyfl3)，經(jīng)分子學(xué)分析鑒定Gyfl1為Halomonasvariabilis,Gyfl2為Chromohalobacterisraelensis，Gyfl3為Chromohalobactercanadensis；經(jīng)藥敏試驗，慶大霉素、卡那霉素、利福平、紅霉素和新霉素等常見抗生素均能抑制嗜鹽菌株Gyfl1、Gyfl2和Gyfl3，而利福平抑菌效果更明顯。

嗜鹽細(xì)菌； 香腸腸衣； 系統(tǒng)發(fā)育樹； 抗生素敏感

香腸作為一種歷史悠久的農(nóng)副食品，因其香味濃郁、口感獨特和耐儲藏等優(yōu)點，深受世界各地人們的青睞。香腸是由拉丁文“Salsus”衍生出來的，意為帶有咸味的食物。將肉切碎，加入食鹽、糖和香辛料，灌進(jìn)腸衣內(nèi)進(jìn)行干燥制成的肉制品，可在常溫下保存較長時間[1]。食鹽在香腸等傳統(tǒng)腌臘肉制品中有呈味、延長保質(zhì)期及著色等主要作用，如通過高離子濃度來降低水分活度和抑制細(xì)菌的滋生，延長其產(chǎn)品的保質(zhì)期。在香腸生產(chǎn)加工管理過程中已建立HACCP(Hazard Analysis Critical Control Point)體系，通過對食品加工過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)實施有效監(jiān)控，將食品安全衛(wèi)生危害消除或降低至安全水平[2-4]，然而一些技術(shù)問題的出現(xiàn)并不能完全防止香腸腐敗。據(jù)報道[5]，從香腸上分離出的嗜鹽細(xì)菌(Halobacteriumcutirubrum)能導(dǎo)致香腸味道的改變，嚴(yán)重地影響其產(chǎn)品的質(zhì)量，對企業(yè)造成無法挽回的損失。近年來，高鹽環(huán)境中分離的嗜鹽菌新種不斷被發(fā)現(xiàn)[6-8]，嗜鹽菌的生理及遺傳特性具有豐富的研究價值，而鹽漬類食品來源的嗜鹽菌的研究報道較少。為此，筆者從工廠化生產(chǎn)的成品香腸中選取腐爛香腸腸衣進(jìn)行微生物的分離鑒定，并對其特征特性進(jìn)行了研究，獲得3株具有耐鹽性的嗜鹽菌株，初步推斷為引起香腸腐爛的腐敗菌，以期為生產(chǎn)上相關(guān)食品及農(nóng)產(chǎn)品儲存過程中微生物的鑒定及抑菌對策提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 腐爛香腸樣本 由荷蘭CBS真菌生物多樣性研究中心(CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre)在荷蘭某香腸加工廠采集，包括腐爛的豬腸衣香腸及腐爛的羊腸衣香腸。

1.1.2 試劑 CDB(Czapek Dox Broth)液體培養(yǎng)基、CDA(Czapek Dox Agar)固體培養(yǎng)基、TSA(Trypticase Soy Agar)固體培養(yǎng)基、革蘭氏染色試劑盒、MH(Mueller-Hinton)肉湯培養(yǎng)基及藥敏紙片，均購于貴陽超研試劑公司。

1.2 菌株的分離與鏡檢

樣本分為腐爛香腸的豬腸衣和羊腸衣2組，將腸衣上的黑斑區(qū)域分別剪成1 cm2大小，置于無菌平皿中進(jìn)行細(xì)菌和真菌培養(yǎng)。

1)細(xì)菌培養(yǎng)。將2組樣本分別接種于含有100 mL的CDB液體培養(yǎng)基的無菌錐形瓶(每組10個)，分別加入30%、25%、20%、18%、15%、10%、5%、2%、1%和0%(CK，不加入鹽)的鹽濃度中。

2) 真菌培養(yǎng)。將2組樣本分別接種于含有100 mL的CDB液體培養(yǎng)基的無菌錐形瓶(每組10個)，分別加入1 mL鏈霉素，并分別加入30%、25%、20%、18%、15%、10%、5%、2%、1%和0%(CK，不加入鹽)的鹽濃度中。

將以上接種好的錐形瓶置于搖床上，25℃培養(yǎng)30～45 d，觀察并記錄微生物的生長情況。在30～45 d后，將高鹽環(huán)境中(鹽濃度>10%的液體培養(yǎng)基)生長的微生物轉(zhuǎn)移接種在含有10%鹽濃度的CDA固體培養(yǎng)基上，在25℃培養(yǎng)5d左右，通過形態(tài)學(xué)觀察菌落特征，將生長的菌落接種在TSA固體培養(yǎng)基中，獲得純培養(yǎng)菌株。收集菌株的純培養(yǎng)物，挑取單個菌落進(jìn)行革蘭染色形態(tài)觀察，并將其懸濁液送至貴州醫(yī)科大學(xué)電鏡科室觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.3 DNA的提取與16S rRNA檢測

將分離菌株接種于TSA培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)72 h，收集培養(yǎng)物，采用玻璃珠法和CTAB(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide)提取法[9]提取菌株DNA，吸光度法檢測DNA濃度，并稀釋成1 μg/μL冷凍備用。

綜上所述，我們在小學(xué)生語文教學(xué)中，作為新世紀(jì)的人民教師應(yīng)該加強學(xué)習(xí)，不斷給自己充電，首先提高教師本身的創(chuàng)新意識和在教學(xué)上的創(chuàng)新，做教學(xué)的有心人。積極引入現(xiàn)代教育技術(shù)（如：多媒體教學(xué)及幾何畫板和各種直觀教具）并引導(dǎo)學(xué)生積極探索，勇于質(zhì)疑，敢于猜想，尚于歸納總結(jié)綜合。在解證題目時常進(jìn)行一題多變、一題多解的訓(xùn)練，使思維得到充分發(fā)散和收斂，為祖國的明天培養(yǎng)出更多的創(chuàng)造型人才。

以菌株基因組DNA為模板，細(xì)菌16S rRNA擴增通用引物27f：5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492r：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’(由上海生工生物工程股份有限公司合成)，在PCR擴增儀中擴增，擴增體系：PCR Mix13 μL，無菌雙蒸水8.5 μL，27f、1492r和模板DNA各1 μL，MgCl20.5 μL，DMSO 1 μL。PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性95℃ 4 min，變性95℃ 30 s，退火59℃ 50 s，延伸72℃ 90 s，35次循環(huán)，終延伸72℃ 10 min。PCR結(jié)束后將擴增產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠中電泳，然后放于紫外燈下觀察，并將PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行Blast基因序列比對，比對結(jié)果按16S rDNA基因序列相似性大于97%的菌株歸于同一物種。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將測序后獲得的菌株16S rRNA序列在GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相似性搜索，選取相似性較高的已發(fā)表的典型菌株作為參考對象，然后用CLUSTAL X1.83進(jìn)行多重序列比對并計算測試菌株與參考菌株之間的序列相似性，剔除同一來源的重復(fù)序列，利用MEGA 5.0(Molecular Evolutionary Genetics Analysis software 5.0)軟件，采用鄰接法(neighbor-joining，NJ)構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 藥物敏感性試驗

Kirby-Bauey紙片擴散法進(jìn)行藥物敏感試驗，操作和結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(NCCLS)制訂的標(biāo)準(zhǔn)：將分離鑒定的嗜鹽細(xì)菌分別傳于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h，挑取菌落配置菌液濃度為0.5麥?zhǔn)蠞岫龋捶止夤舛扔嬛?.08～0.10，調(diào)好濁度的菌懸液15 min內(nèi)均勻涂布含有10%鹽濃度的MH平板。平板涂好菌液后，放置5 min，無菌鑷子貼相應(yīng)的藥敏紙片，保持紙片間間距大于40 mm。以金黃色葡萄球菌ATCC 25933作為質(zhì)控菌株，35℃培養(yǎng)48 h，觀察培養(yǎng)板中抑菌圈生長情況并記錄結(jié)果，每組細(xì)菌樣本5次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鹽濃度微生物的生長情況

取樣鏡檢可知，細(xì)菌和真菌均出現(xiàn)在含低鹽濃度及不含鹽濃度環(huán)境中，可觀察到桿狀或球狀細(xì)菌以及青霉菌和曲霉菌等真菌；微生物在含有鏈霉素的液體培養(yǎng)基中的生長速度較慢，在含有鏈霉素的高鹽(>18%)環(huán)境中，未見真菌生長。而在不含鏈霉素的高鹽(25%～30%)環(huán)境中，培養(yǎng)基較渾濁，呈淡粉色。表明，這些細(xì)菌有很強的耐鹽能力。

注：A，菌株Gyfl1，大小為(1.5～1.9)μm×(0.3～0.6)μm； B，菌株Gyfl2，大小為(1.3～2.1)μm×(0.4～0.6)μm； C，菌株Gyfl3，大小為(0.9～1.3)μm×(0.2～0.4)μm。

Note:A, Gyfl1 strain with size of (1.5～1.9 )μm×(0.3～0.6)μm; B, Gyfl2 strain with size of (1.3～2.1)μm×(0.4～0.6)μm; C, Gyfl3 strain with size of (0.9～1.3)μm×(0.2～0.4 )μm.

圖1 微生物細(xì)胞形態(tài)(×20K)的掃描電鏡觀察

Fig.1 Microbial cellular morphology under scanning electron microscopy(×20K)

2.2 微生物細(xì)胞形態(tài)(×20K)的掃描電鏡觀察

在高鹽(25%～30%)液體培養(yǎng)基中生長的微生物，接種在CDA及TSA固體培養(yǎng)基進(jìn)行分離純化后，分離到3株形態(tài)大小、菌落表面凹凸度及邊緣形態(tài)不一致的細(xì)菌，分別被命名為Gyfl1、Gyfl2和Gyfl3。經(jīng)革蘭染色后在1 000×鏡下觀察可見，3株細(xì)菌呈短桿狀，成雙或短鏈狀排列的革蘭氏陰性菌。在電鏡(×20K)下可見，Gyfl1呈短桿狀，大多數(shù)單一排列，大小為(1.5～1.9)μm×(0.3～0.6)μm；Gyfl2呈短桿狀成簇排列，大小為(1.3～2.1)μm×(0.4～0.6)μm；Gyfl3呈短桿狀成簇排列，大小為(0.9～1.3)μm×(0.2～0.4)μm(圖1)。

2.3 16S r RNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將16S r RNA序列分析測序結(jié)果在Pubmed基因庫中搜索對比結(jié)果顯示，3株細(xì)菌均屬于中度嗜鹽菌(Moderatelyhalophilicbacteria)。其中，Gyfl1為Halomonasvariabilis，Gyfl2為Chromohalobacterisraelensis，Gyfl3為Chromohalobacter canadensis。根據(jù)比對結(jié)果，選擇與3株細(xì)菌同源性較高的22株中度嗜鹽菌16S r RNA序列，采用軟件CLUSTAL X1.83及MEGA5.0，通過鄰接法構(gòu)建中度嗜鹽菌的系統(tǒng)發(fā)育樹，從圖2看出，分離的菌株Gyfl1、Gyfl2及Gyfl3在進(jìn)化親緣關(guān)系最近的標(biāo)準(zhǔn)菌株分別為HalomonasvariabilisDSM3051T(AJ306893)、ChromohalobacterisraelensisATCC 43985T(AJ295144)、ChromohalobactercanadensisDSM 6769T(NR_114545)。

注：Zymobacter palmae DSM10491T(D14555)作為外群。

Note：Zymobacter palmae DSM10491T(D14555) is used as an outgroup.

圖2 基于16S r RNA序列構(gòu)建中度嗜鹽菌的系統(tǒng)發(fā)育樹

Fig.2 The phylogenetic tree of moderately halophilic bacteria based on 16S rRNA sequence structure

表 常見抗生素對嗜鹽菌Gyfl1、Gyfl2及Gyfl3的藥敏試驗結(jié)果(x±s, n=5)

注：“-”表示無抑菌圈。

Note：“-“, without inhibition zone.

2.4 藥敏試驗

從表2可知，慶大霉素、卡那霉素、利福平、紅霉素和新霉素等常見抗生素均能抑制嗜鹽菌株Gyfl1、Gyfl2和Gyfl3，而利福平抑菌效果更明顯，每組樣本抑菌圈之間均差異顯著(P<0.05)。

3 小結(jié)與討論

1)在香腸等農(nóng)副產(chǎn)品中添加高濃度鹽通常是延長食品儲存期限的方法之一，鹽漬香腸處于高鹽環(huán)境中，一般細(xì)菌難以生長。研究結(jié)果表明，從腐爛香腸腸衣中分離到3株菌株Gyfl1、Gyfl2和Gyfl3，經(jīng)分子生物學(xué)等方法鑒定為中度嗜鹽菌，Gyfl1為Halomonasvariabilis，Gyfl2為Chromohalobacterisraelensis，Gyfl3為Chromohalobactercanadensis，初步推斷為引起香腸腸衣質(zhì)變的腐敗菌，這些細(xì)菌均在飽和鹽濃度的液體培養(yǎng)基中分離出來，在高鹽環(huán)境下可正常生長，說明其有特殊的耐鹽特性。

2) 分離到的中度嗜鹽菌(H.variabilis,C.israelensis,C.canadensis)屬于Halomonadaceae科，是一類革蘭氏陰性菌，且能適應(yīng)極端環(huán)境的微生物類群[10-13]。中度嗜鹽菌對環(huán)境具有極強的適應(yīng)能力，廣泛分布于自然界中，存在于鹽湖、鹽場、沙漠、高鹽土壤和鹽漬食物等各種環(huán)境[14]，是鹽生生態(tài)系統(tǒng)的重要組成之一。嗜鹽菌具有特殊的生理結(jié)構(gòu)及細(xì)胞中含有的特殊物質(zhì)使得嗜鹽菌能夠在高鹽環(huán)境中生長[15]。早期，對高鹽環(huán)境的研究主要集中于嗜鹽古菌上，對中度嗜鹽菌的研究相對較少。近年來，我國科研人員從不同鹽環(huán)境中分離出許多新的嗜鹽微生物，并得到了國際學(xué)術(shù)界的認(rèn)可[16-20]。

3)鹽單胞菌屬(Halomonas)[21]為革蘭氏陰性菌、好氣桿菌和球菌類群中的一類微生物，是一類能在鹽度為0%～32%(W/V)條件下生長的耐鹽細(xì)菌，并且能在高壓環(huán)境中生存[22]，而一些鹽單胞菌曾被報道為條件致病菌[23]。本研究分離的Gyfl1被鑒定為鹽單胞菌。色鹽桿菌屬(Chromohalobacter)于1989年被科學(xué)家Ventosa發(fā)現(xiàn)，并將Chromobacteriummarismortui重新分類為Chromohalobactermarismortui[24]，色鹽桿菌常出現(xiàn)在酸性噴泉、放射性垃圾、深部地殼以及動物或植物體內(nèi)[25]。C.canadensis常出現(xiàn)在鹽漬食物中[26]；而C.israelensis曾被報道為植物內(nèi)生菌，分離自一種典型的鹽堿地指示植物鹽地堿蓬(SuaedasalsaL)[27]，該植物生長在鹽土、鹽漬化土壤和沿海地帶。本研究中，C.israelensis分離自腐爛香腸上，為首次在食物中發(fā)現(xiàn)。經(jīng)藥敏試驗可知，慶大霉素、卡那霉素、利福平、紅霉素和新霉素等常見抗生素均能抑制嗜鹽菌株Gyfl1、Gyfl2和Gyfl3，而利福平抑菌效果更明顯。農(nóng)副產(chǎn)品在儲存中產(chǎn)生腐爛現(xiàn)象，將對企業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，應(yīng)及時找出有效的應(yīng)對措施降低其損失，研究結(jié)果可為工廠儲存及包裝相關(guān)農(nóng)副產(chǎn)品時提供防腐參考。

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(責(zé)任編輯： 楊 林)

Isolation, Identification and Characteristics of Halophilic Bacteria in Decayed Black Spot of Sausage Casing

MU Lili1， TU Yunhua1， Syren de Hoog2， LIU Taohua1，LU Qian1， WANG Yanyan1， CHEN Yan1， KANG Yingqian1*

(1.DepartmentofMicrobiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang,Guizhou550004,China； 2.FungalBiodiversityCentre,CBS-KNAW,Utrecht85167,Netherlands)

The halophilic bacteria in decayed black spot of sausage casing were isolated and identified by the gradient salt concentration method (Czapek Dox Broth liquid medium), CDA (Czapek Dox Agar) and TSA (Trypticase Soy Agar) solid media, and the characteristics of the identified halophilic bacteria was analyzed by using 16S rRNA gene sequencing and building phylogenetic tree of 16S rRNAsequence to provide the theoretical basis for microbial identification and bacteriostat measures during the storage process of agricultural products and related foods produced by industrialization. Results: Three halophilic bacteria strains (Gyfl1，Gyfl2 and Gyfl3) are successfully isolated on the solid medium with 25%～30% salt concentration. Gyfl1，Gyfl2 and Gyfl3 strains are identified asHalomonasvariabilis,ChromohalobacterisraelensisandChromohalobacterCanadensis by molecular analysis respectively. The drug sensitive test shows that common antibiotics of gentamicin, kanamycin, rifampicin, erythromycin, and neomycin all can inhibit Gyfl1，Gyfl2 and Gyfl3 strains but the antibacterial effect of rifampicin is the highest among common antibiotics.

halophilic bacteria; sausage casing; phylogenetic tree; antibiotics sensitivity

2015-09-02； 2016-01-05修回

國家自然科學(xué)基金地方項目“貴州省病原需氧放線菌的系統(tǒng)分類研究及其屬間快速鑒別診斷試劑盒的研發(fā)”(31260029)；貴州省國際科技合作計劃項目“白酒丟糟及鍋底水水解循環(huán)利用技術(shù)”"[黔科合外G字(2014)7006]；貴州省社會發(fā)展科技攻關(guān)項目“貴州省放線菌資源的開發(fā)及臨床放線菌屬間快速鑒別診斷試劑盒的研發(fā)”[黔科合SY 字(2011)3017]；貴陽市科技局科技創(chuàng)新平臺計劃項目“姜黃納米保健產(chǎn)品科技創(chuàng)新平臺的建設(shè)”[筑科合同2012303]

牟麗麗(1988-)，女，在讀碩士，研究方向：病原生物學(xué)。E-mail:1019535819@qq.com

*通訊作者：康穎倩(1974-)，女，教授，博士，從事微生物的相關(guān)研究。E-mail:449164105@qq.com

1001-3601(2016)01-0025-0093-05

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