夏曉華， 董 慧， 李會(huì)娜， 夏曉培， 常重杰*

(1.河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 河南 新鄉(xiāng) 453007； 2.河南省汝州市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心， 河南 汝州 467500)

乙氧氟草醚對(duì)大鱗副泥鰍的毒性測(cè)定

夏曉華1， 董 慧1， 李會(huì)娜2， 夏曉培1， 常重杰1*

(1.河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 河南 新鄉(xiāng) 453007； 2.河南省汝州市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心， 河南 汝州 467500)

為探明除草劑乙氧氟草醚(Oxyfluorfen)對(duì)水生生物的毒性，以大鱗副泥鰍(Paramisgurnusdabryanus)為受試對(duì)象，進(jìn)行乙氧氟草醚對(duì)大鱗副泥鰍的急性毒性、生理毒性和DNA損傷試驗(yàn)。結(jié)果表明：隨著染毒濃度增加和時(shí)間的延長，大鱗副泥鰍的死亡率升高，安全濃度為8.40 mg/L，根據(jù)中國《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》，乙氧氟草醚對(duì)大鱗副泥鰍為低毒。乙氧氟草醚低濃度(8.00 mg/L，10.50 mg/L，13.00 mg/L)作用下，大鱗副泥鰍肝臟谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(GPT)活性明顯升高；高濃度(15.50 mg/L)作用下酶活性在染毒2 d、4 d時(shí)呈上升趨勢(shì)，但在6 d時(shí)急速下降。15.50 mg/L組與空白對(duì)照組相比，大鱗副泥鰍肝細(xì)胞的彗尾DNA百分含量、彗星尾長和Olive尾矩明顯增加，肝細(xì)胞受到明顯損傷。

乙氧氟草醚； 大鱗副泥鰍； 谷丙轉(zhuǎn)氨酶； 谷草轉(zhuǎn)氨酶； 單細(xì)胞凝膠電泳

乙氧氟草醚(Oxyfluorfen)為美國羅門哈斯公司(現(xiàn)陶氏公司)1975年開發(fā)成功的二苯醚類除草劑，其制劑為24%乙氧氟草醚EC，商品名稱果爾。先后在美國、巴西、墨西哥等國取得登記，并于20世紀(jì)80年代在中國登記，登記作物為水稻[1]。乙氧氟草醚是一種觸殺型除草劑，在有光的情況下發(fā)揮除草作用[2]。隨著化學(xué)除草劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的廣泛應(yīng)用，其對(duì)環(huán)境造成的污染也越來越嚴(yán)重。長期大量化學(xué)除草劑的應(yīng)用帶來的殘毒和環(huán)境污染，直接危害到人畜健康，影響農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[3]。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的不合理使用，雨水沖刷、地表徑流及農(nóng)藥廠污水的肆意排放等使乙氧氟草醚進(jìn)入河流、湖泊、海洋等水生生態(tài)系統(tǒng)，從而對(duì)水生生物的生存以及水生生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定與平衡造成威脅。鄒積鑫等[4]研究了乙氧氟草醚的同類藥劑乙羧氟草醚對(duì)斑馬魚的急性毒性和生物富集性，結(jié)果表明，乙羧氟草醚對(duì)斑馬魚8 d的生物富集系數(shù)很低，在魚體內(nèi)的富集量較少，而且其在水中的溶解性較差(溶解度僅0.6 mg/L)，降解較快，因此一般不會(huì)對(duì)水生生物產(chǎn)生長期的毒害和富集作用；但對(duì)魚類的急性毒性較高，因此在施用時(shí)應(yīng)合理控制劑量，盡量減少對(duì)水生生物的影響。但到目前為止，國內(nèi)外關(guān)于乙氧氟草醚對(duì)水生生物的遺傳毒性研究鮮見報(bào)道。為此，筆者以大鱗副泥鰍為材料，通過單細(xì)胞凝膠電泳等技術(shù)研究乙氧氟草醚對(duì)大鱗副泥鰍的急性毒性、生理毒性和DNA損傷，以期為安全使用除草劑，保護(hù)漁業(yè)資源，維護(hù)生態(tài)平衡，保障人體健康提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

大鱗副泥鰍350尾，采自新鄉(xiāng)市海鴻農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，發(fā)育狀況良好，體長12～15 cm。用曝氣3 d的自來水在室內(nèi)暫養(yǎng)1周，水溫(20±2)℃，溶解氧5～6 mg/L，pH 6.9～7.2。隔天換水1次，染毒時(shí)挑選健康無病、規(guī)格一致的個(gè)體進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)前1 d停止喂食，進(jìn)行饑餓處理，試驗(yàn)期間不投喂飼料。乙氧氟草醚制劑購自新鄉(xiāng)市東海農(nóng)資市場(chǎng)(上海惠光化學(xué)有限公司，有效成分含量23.5%)。

1.2 急性毒性試驗(yàn)

通過預(yù)試驗(yàn)，找出乙氧氟草醚使大鱗副泥鰍在96 h內(nèi)全部存活的最高染毒濃度、全部死亡的最低染毒濃度，確定試驗(yàn)濃度區(qū)間。正式試驗(yàn)按等比濃度將乙氧氟草醚配制為18.75 mg/L、23.44 mg/L、29.30 mg/L、36.62 mg/L和45.78 mg/L 5個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)空白對(duì)照組，每組均投放10尾健康大鱗副泥鰍，重復(fù)3次。每24 h更換1次等體積等濃度的乙氧氟草醚稀釋液，前12 h連續(xù)觀察，并及時(shí)清除死亡個(gè)體，以免影響其他個(gè)體的生存。觀察記錄大鱗副泥鰍在24 h、48 h、72 h及96 h的死亡數(shù)量，并記錄中毒癥狀。

采用改進(jìn)寇氏法(Karber)[5-6]計(jì)算乙氧氟草醚對(duì)大鱗副泥鰍的半數(shù)致死質(zhì)量濃度(LC50)和安全濃度(SC)。

LgLC50=Xm-i(∑p-0.5)

SC=LC50(24h)×0.3/[(LC50(24h)/LC50(48h))3

式中，Xm為死亡組最大劑量的對(duì)數(shù)，i為相鄰組濃度對(duì)數(shù)之差，∑p為各組死亡率的總和。

1.3 生理毒性試驗(yàn)

在急性毒性試驗(yàn)基礎(chǔ)上，在安全濃度和最大零致死濃度之間等差設(shè)置8.00 mg/L、10.50 mg/L、13.00 mg/L和15.50 mg/L 4個(gè)處理組和1個(gè)空白對(duì)照組，每組均隨機(jī)投放20尾健康大鱗副泥鰍，重復(fù)3次。每隔24 h各組分別更換1次等體積(2 L)等濃度的乙氧氟草醚稀釋液。分別于2 d、4 d和6 d每組隨機(jī)取3尾大鱗副泥鰍取出肝臟。肝臟勻漿的制備和谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(GPT)活力的測(cè)定均按照南京建成生物工程研究所提供的試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 肝細(xì)胞的DNA損傷試驗(yàn)

單細(xì)胞凝膠電泳(SCGE)檢測(cè)大鱗副泥鰍肝細(xì)胞DNA損傷。試驗(yàn)設(shè)置同生理毒性試驗(yàn)，分別2 d、4 d和6 d每個(gè)濃度取3尾大鱗副泥鰍制備肝細(xì)胞懸液，試驗(yàn)步驟參照陳忻等[7-8]的方法進(jìn)行。大鱗副泥鰍肝細(xì)胞的單細(xì)胞凝膠電泳運(yùn)用CASP彗星圖像分析軟件進(jìn)行分析，得出彗尾DNA百分含量(Tail DNA%)、彗尾長度(Tail length，TL)、Olive尾矩(Olive tail moment，OTM) 3項(xiàng)指標(biāo)數(shù)據(jù)，導(dǎo)入統(tǒng)計(jì)分析軟件Spss16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用軟件Excel 2003進(jìn)行整理，用軟件Spss 16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性毒性

大鱗副泥鰍剛?cè)径緯r(shí)表現(xiàn)為急劇游動(dòng)，四處亂竄，尤其在高濃度組中表現(xiàn)更為明顯，上躥下跳、打轉(zhuǎn)、翻白，片刻后趨于平靜，伏于水底，胸鰭張開。然后反應(yīng)遲鈍，身體彎曲，游動(dòng)緩慢，逐漸喪失平衡能力，翻白肚等現(xiàn)象，死亡時(shí)身體僵直，脊椎略彎曲成弓形。從表1看出，隨乙氧氟草醚濃度的增加死亡率不斷升高。經(jīng)計(jì)算，乙氧氟草醚對(duì)大鱗副泥鰍24 h、48 h、72 h和96 h的半數(shù)致死質(zhì)量濃度分別為41.87 mg/L、36.62 mg/L、29.96 mg/L和25.62 mg/L，安全濃度為8.40 mg/L。

表1 乙氧氟草醚各濃度組大鱗副泥鰍不同 染毒時(shí)間的死亡率

Table 1 MortalityofP.dabryanusexposed to different oxyfluorfen groups at different times

乙氧氟草醚濃度/(mg/L)Oxyfluorfenconcentration死亡率/%Mortality24h48h72h96h0．00000018．750003．3323．4403．3320．0026．6729．306．676．6736．6780．0036．6213．3363．3386．67100．0045．7870．0076．6796．67100．00

2.2 GPT和GOT活性

從表2看出，從相同時(shí)間不同質(zhì)量濃度來看，染毒2 d、4 d的肝細(xì)胞GPT、GOT活力均隨乙氧氟草醚濃度的增加而升高，且4 d時(shí)13.00 mg/L、15.50 mg/L濃度組與對(duì)照組比，GPT活力顯著升高，10.50 mg/L、13.00 mg/L和15.50 mg/L濃度組GOT活力極顯著升高。6 d時(shí)除乙氧氟草醚15.50 mg/L濃度組外，其余組隨乙氧氟草醚濃度增加GPT和GOT活力上升，在8.00 mg/L和10.50 mg/L時(shí)GPT活力顯著升高，13.00 mg/L時(shí)GPT活力極顯著升高；GOT活力在8.00 mg/L時(shí)顯著升高，10.50 mg/L和13.00 mg/L時(shí)極顯著升高。

2.3 肝細(xì)胞DNA損傷

熒光顯微鏡400倍鏡檢可見對(duì)照組大鱗副泥鰍肝細(xì)胞的細(xì)胞核均呈圓球形，彗星頭部DNA致密且集中；隨乙氧氟草醚濃度增加細(xì)胞核均有拖尾呈彗星樣，細(xì)胞核頭部逐漸縮小，拖尾程度逐漸增加，散發(fā)(圖示)。

從表3看出，在相同染毒時(shí)間，除乙氧氟草醚濃度15.50 mg/L染毒6 d外，其余隨乙氧氟草醚濃度增加彗尾DNA百分含量、Olive尾距和尾長逐漸增加。在同一濃度組，隨處理時(shí)間的延長，肝細(xì)胞凝膠電泳彗尾DNA百分含量、Olive尾距和尾長增加。

表2 乙氧氟草醚各濃度組大鱗副泥鰍不同染毒時(shí)間肝細(xì)胞的GPT及GOT活性

Table 2 GPT and GOT activity ofP.dabryanusliver cells treated with different concentrations of oxyfluorfen and different explose time

乙氧氟草醚濃度/(mg/L)Oxyfluorfenconcentration2dGPT活力(U/gprot)GOT活力(U/gprot)4dGPT活力(U/gprot)GOT活力(U/gprot)6dGPT活力(U/gprot)GOT活力(U/gprot)0．003．37±0．242．16±2．003．21±0．992．30±1．573．46±0．792．24±1．678．005．13±4．433．04±2．7919．30±10．118．03±0．4322．24±4．19?12．77±3．41?10．506．97±2．063．44±3．6921．39±7．7212．01±3．42??28．39±11．65?17．11±1．83??13．009．66±0．174．36±1．8130．76±11．85?12．89±0．41??32．59±9．80??16．45±5．21??15．5011．04±6．425．12±2．9930．98±7．62?14．55±3．50??15．00±1．547．95±3．89

注：*表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)(下同)。

Note：Values followed by * and ** mean significant difference at 0.05 and 0.01 level， respectively. The same below.

注：CK為空白對(duì)照組，A、B、C和D分別表示乙氧氟草醚濃度為8.00 mg/L、10.50 mg/L、13.00 mg/L和15.50 mg/L。

Table 3 DNA damage ofP.dabryanusliver cells treated with different concentrations of oxyfluorfen and different expose time

時(shí)間Time濃度/(mg/L)Concentration彗尾DNA/%TailDNA尾長TaillengthOlive尾矩Olivetailmoment對(duì)照(CK)0．000．16±0．0917．50±9．190．17±0．072d8．000．71±0．6414．67±5．030．71±0．0510．501．06±0．2117．67±5．511．19±0．2413．002．74±0．22?43．67±11．592．95±0．3815．504．11±0．24??63．67±9．074．95±0．54??4d8．001．52±0．3622．00±7．071．66±0．5610．502．20±0．0125．67±7．772．12±0．2613．003．13±0．10?51．67±15．373．42±0．59?15．505．41±0．18??66．67±18．775．98±0．71??6d8．006．93±0．44??76．00±23．30?8．76±1．78??10．5011．55±0．62??116．67±34．02??15．79±3．00??13．0036．10±6．74??229．67±64．84??72．69±6．17??15．5015．13±1．08??154．67±45．71??29．34±1．54??

3 結(jié)論與討論

3.1 乙氧氟草醚對(duì)大鱗副泥鰍的安全性

根據(jù)中國《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》[9]，農(nóng)藥對(duì)魚類96 h的LC50≤0.1 mg/L時(shí)該農(nóng)藥對(duì)魚類屬于劇毒，當(dāng)0.1 mg/L<96 hLC50≤1.0 mg/L時(shí)屬于高毒，當(dāng)1.0 mg/L<96 hLC50≤10 mg/L時(shí)屬于中毒，當(dāng)96 hLC50>10 mg/L時(shí)屬于低毒。試驗(yàn)結(jié)果表明，乙氧氟草醚對(duì)大鱗副泥鰍的96 hLC50為25.62 mg/L，安全濃度為8.40 mg/L，說明乙氧氟草醚對(duì)大鱗副泥鰍為低毒。但隨著染毒時(shí)間的延長大鱗副泥鰍死亡率升高，說明乙氧氟草醚對(duì)水生生物有毒害作用。因此，在使用該除草劑時(shí)一定要適量施用，注意安全，避免污染水源、破壞環(huán)境，以免對(duì)水生生物造成危害。

3.2 乙氧氟草醚對(duì)大鱗副泥鰍GPT和GOT活性的影響

肝臟是營養(yǎng)物質(zhì)消化的主要腺體，也是尿素合成的主要場(chǎng)所，具有解毒功能。谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(GPT)是肝臟內(nèi)活性最高的2種轉(zhuǎn)氨酶，其活性變化與肝細(xì)胞的炎癥、變性和壞死等密切相關(guān)，即使非常小的劑量也會(huì)對(duì)肝功能造成損傷[10]。其中，GPT被推薦為肝功能損害最敏感的檢測(cè)指標(biāo)，其活性變化亦是反映肝細(xì)胞受損的主要指標(biāo)。GPT和GOT的活性提高能加快尿素生成，減少氨基酸代謝產(chǎn)物對(duì)機(jī)體的毒害[11]。試驗(yàn)結(jié)果表明，乙氧氟草醚對(duì)大鱗副泥鰍GPT和GOT的活性在染毒2 d、4 d時(shí)明顯高于對(duì)照組，說明短時(shí)間乙氧氟草醚處理可誘導(dǎo)2種酶活性的提高，加強(qiáng)毒物的排出；而染毒6 d時(shí)這2種酶的活力雖呈上升趨勢(shì)，但15.50 mg/L組的酶活力明顯低于13.00 mg/L組。說明，大鱗副泥鰍肝細(xì)胞長期處于不良狀態(tài)下，功能開始下降[12]。

3.3 乙氧氟草醚對(duì)大鱗副泥鰍肝細(xì)胞的DNA損傷

單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)是檢查細(xì)胞遺傳物質(zhì)損傷的一種方法。彗尾DNA百分含量、尾長和Olive尾距是彗星實(shí)驗(yàn)中反映細(xì)胞DNA所受損傷的1個(gè)重要指標(biāo)。彗尾DNA百分含量和Olive尾距越大，尾長越長說明細(xì)胞受到的DNA損傷越嚴(yán)重。試驗(yàn)結(jié)果表明，乙氧氟草醚對(duì)大鱗副泥鰍肝細(xì)胞的DNA損傷，在染毒2 d、4 d時(shí)低濃度組(8.00 mg/L,10.50 mg/L)大鱗副泥鰍肝細(xì)胞凝膠電泳的彗尾DNA百分含量、尾長和Olive尾距與對(duì)照組相比無顯著差異，而15.50 mg/L處理組的明顯升高，表明較高劑量的乙氧氟草醚對(duì)大鱗副泥鰍肝細(xì)胞DNA造成了損傷。在染毒6 d時(shí)，15.50 mg/L組的彗尾DNA百分含量、尾長和Olive尾距較13.00 mg/L組有所下降，可能是由于DNA的損傷過于嚴(yán)重，以至于電泳時(shí)造成DNA片段丟失，因此導(dǎo)致測(cè)量值下降[13-14]。

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(責(zé)任編輯： 馮 衛(wèi))

Toxic Determination of Oxyfluorfen onParamisgurnusdabryanus

XIA Xiaohua1， DONG Hui1， LI Huina2， XIA Xiaopei1， CHANG Zhongjie1*

(1.CollegeofLifeSciences，HenanNormalUniversity，Xinxiang,Henan453007; 2.JnspectionandTestingCenters,QualityandtechnicalsupervisionofRuzhou,Ruzhou,Henan467500,China)

In order to assess the toxicity of herbicide oxyfluorfen to aquatic organisms， regardingP.dabryanusas the experimental object， acute toxicity， physiological toxicity and DNA damage experiment were employed to study oxyfluorfen’s effect onP.dabryanus. Results:P.dabryanusmortality increased with the concentration increasing and the extension of time. The activities of GPT and GOT inP.dabryanusliver cells were induced by the lower concentration (8.00 mg/L, 10.50 mg/L, 13.00 mg/L) treatments group. The action of enzyme activity on 2 d,4 d rises，but it fell sharply in the 6 d under the high concentration (15.50 mg/L) of the oxyfluorfen. The liver cells’ DNA damage were checked by single cell gel electrophoresis technique (SCGE). Compared with the control group,treatment group’s (15.50 mg/L) three indexes,tail DNA content,the comet tail length and olive tail moment increased significantly(P<0.05), liver cell was obviously damaged.

oxyfluorfen；Paramisgurnusdabryanus； GPT； GOT； single cell gel electrophoresis(SCGE)

2015-06-30； 2015-12-17修回

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“兩種泥鰍DMRT1基因不同選擇性剪接體的結(jié)構(gòu)、功能及調(diào)控機(jī)制研究”(31200923)；河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目“大鱗副泥鰍DMRT1基因不同選擇性剪接體的表達(dá)模式分析”(12B180011)；河南師范大學(xué)引進(jìn)人才科研項(xiàng)目“泥鰍DMRT1基因不同剪接體的克隆和時(shí)空表達(dá)模式分析”(01046500109)

夏曉華(1982-)，女，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事分子細(xì)胞遺傳學(xué)研究。E-mail:xxhlpf@163.com

*通迅作者：常重杰(1965-)，男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，從事分子細(xì)胞遺傳學(xué)研究。E-mail:changzhongjie@tom.com

1001-3601(2016)01-0030-0113-04

S948

A