張 強(qiáng)， 梁煒博， 杜雪勇， 法艷海， 王學(xué)貴*

(1.四川省資陽市雁江區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心， 四川 資陽 641300； 2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)無公害農(nóng)藥研究室， 四川 成都 611130)

大蒜精油對(duì)桃蚜生物活性及生理生化的影響

張 強(qiáng)1， 梁煒博2， 杜雪勇2， 法艷海2， 王學(xué)貴2*

(1.四川省資陽市雁江區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心， 四川 資陽 641300； 2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)無公害農(nóng)藥研究室， 四川 成都 611130)

為獲得在環(huán)境中易降解無公害的植物源農(nóng)藥，研究大蒜精油對(duì)桃蚜的殺蟲活性及生理生化的影響，測(cè)定大蒜精油對(duì)桃蚜的觸殺毒力及其對(duì)試蟲蛋白質(zhì)含量、乙酰膽堿酯酶、中腸酯酶及海藻糖酶活性。結(jié)果表明：大蒜精油對(duì)桃蚜表現(xiàn)出很強(qiáng)的毒殺作用，其72 h觸殺毒力LC50值為77.03 μg/mL；大蒜精油可誘導(dǎo)桃蚜中腸酯酶活性增加，海藻糖不斷被分解，蛋白質(zhì)的合成逐漸被遏制，對(duì)能量代謝系統(tǒng)破壞較大，導(dǎo)致能量供求失衡而死亡。大蒜精油可作為生物殺蟲劑有效控制桃蚜。

大蒜精油； 桃蚜； 觸殺毒力； 生理生化； 酶活性

桃蚜[Myzwspersicae(Sulzer)]是蔬菜種植中的重要害蟲之一，其在蔬菜葉背或留種株的嫩梢嫩葉上危害，造成節(jié)間變短、彎曲，影響包心或結(jié)球，造成減產(chǎn)，同時(shí)傳播病毒病[1]。近年來，隨著城市化發(fā)展的加快，市場(chǎng)對(duì)蔬菜的需求量越來越大，大棚蔬菜栽培面積不斷擴(kuò)大，蚜蟲在蔬菜上危害也日趨嚴(yán)重。運(yùn)用化學(xué)藥劑對(duì)蔬菜蚜蟲進(jìn)行防治是目前的主要措施，但是長(zhǎng)期廣泛、單一使用已導(dǎo)致抗性、殘留等系列反應(yīng)，尤其海南毒豇豆等蔬菜中毒事件屢有發(fā)生[2]。植物源農(nóng)藥因取材廣泛，在環(huán)境中降解容易，不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)成為新農(nóng)藥創(chuàng)制研究的熱點(diǎn)[3]。

植物精油是一類易揮發(fā)，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、常具有植物特征性氣味的分子構(gòu)成，通常是由萜烯及生物酚類物質(zhì)組成，一般由幾十至幾百種化合物組成[4]，是一類植物源次生代謝物質(zhì)，對(duì)蔬菜品質(zhì)無負(fù)面影響，既可直接用于害蟲防治，又便于從中尋找天然模板進(jìn)行人工合成[5]，是蔬菜害蟲防治的發(fā)展方向之一。植物精油對(duì)昆蟲具有驅(qū)避、熏蒸和觸殺活性，是一類對(duì)環(huán)境友好的廣譜性植物保護(hù)劑[6]。大蒜精油因具良好的殺蟲活性而被廣泛研究，如有研究表明大蒜(Alliumsativum)精油對(duì)致倦庫蚊(Culexpipiensquinquefasciatus)和埃及伊蚊(Aedesaegypti)幼蟲具有較強(qiáng)的毒殺作用等[7]。

目前，隨著城市化進(jìn)程的加快，城市周邊大棚蔬菜的種植規(guī)模越來越大，種植周期越來越短，用藥頻率越來越高，不僅使農(nóng)藥殘留問題日漸凸顯，并且害蟲抗藥性日趨嚴(yán)重，尤其蔬菜蚜蟲由于繁殖能力強(qiáng)，時(shí)代重疊嚴(yán)重，同時(shí)也是傳播病毒病的一個(gè)蟲媒介體，嚴(yán)重影響了蔬菜的產(chǎn)量和品質(zhì)。為降低化學(xué)農(nóng)藥對(duì)環(huán)境的污染，開發(fā)植物源農(nóng)藥勢(shì)在必行。筆者對(duì)植物次生代謝物質(zhì)大蒜精油對(duì)桃蚜的生物活性進(jìn)行測(cè)定，并深入研究其對(duì)蛋白質(zhì)含量以及中腸酯酶、海藻糖酶、乙酰膽堿酯酶活性的影響，以期為植物源農(nóng)藥有效控制桃蚜對(duì)十字花科蔬菜的危害和病毒病的傳播提供理論。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)蟲源、試劑及儀器

供試蟲源：桃蚜[Myzwspersicae(Sulzer)]，將采集的蚜蟲，在24～26℃條件下連續(xù)飼養(yǎng)多代，挑選大小一致的無翅成蚜作為供試蟲源。

藥品及試劑：大蒜精油(購自廣州市綠香島天然用品有限公司)。試驗(yàn)中所用的溶劑及化學(xué)試劑如磷酸二氫鈉、α-萘酚、α-醋酸萘酯、氯化乙酰膽堿等均為AR級(jí)(購自銳勁特生化試劑有限公司)。

儀器：CP224S型電子天平(德國(guó)賽多利斯)、HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市易晨?jī)x器制造有限公司)、Cryofuge 6000i GMP高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(德國(guó)賀力氏)、UV2000分光光度計(jì)尤尼柯(上海儀器有限公司)等。

1.2 毒力測(cè)定

采用點(diǎn)滴法[8]。用丙酮將大蒜精油配制成1 000 mg/L、500 mg/L、250 mg/L、125 mg/L和62.5 mg/L的不同濃度梯度溶液，每種溶液用微量點(diǎn)滴器點(diǎn)滴0.4 μL藥液于蚜蟲腹部，以30頭為1組，設(shè)置3次重復(fù)，以丙酮作為空白對(duì)照。于藥后24 h、48 h、72 h統(tǒng)計(jì)各處理的死亡情況，計(jì)算各處理的死亡率和校正死亡率以及回歸方程、r值、LC50及LC50值95%的置信區(qū)間。

1.3 蚜蟲生理生化指標(biāo)測(cè)定及處理

用24 h的LC50濃度處理蚜蟲，然后在4 h、8 h、12 h和24 h后分別測(cè)定蚜蟲的蛋白質(zhì)含量以及中腸酯酶、海藻糖酶、乙酰膽堿酯酶活性。并計(jì)算其增強(qiáng)率或抑制率[9]。

1.4 酶液的制備

中腸酯酶液的制備：挑取各處理的成蚜15頭，加0.04 mol/L PBS(pH7. 0) 5 mL，冰浴下勻漿，在高速冷凍離心機(jī)上以3 500 r/ min 離心10 min，取上清液，用0. 04 mol/ L PBS 定容至10 mL作酶源，于-4℃冰箱冷藏備用。海藻糖酶液的制備：參照中腸酯酶液制備，用1.5%生理鹽水代替0.04 mol/L PBS(pH7. 0)；乙酰膽堿酯酶液的制備：參照中腸酯酶液制備，用0.04 mol/ L PBS(pH7. 2) 5 mL，余同[10]。

1.5 桃蚜蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

采用紫外吸收法[11]。以0.04 mol/ L PBS(pH7. 0)為空白管調(diào)節(jié)零點(diǎn)，分別在紫外分光光度計(jì)280 nm和260 nm波長(zhǎng)下測(cè)定酶提取液光密度，利用Lowry-Kalokar公式進(jìn)行計(jì)算蛋白質(zhì)含量：

蛋白質(zhì)濃度 (mg/mL)=1.45OD280-0.74OD260。

1.6 桃蚜生物酶活力的測(cè)定

1.6.1 腸酯酶活力 在具塞刻度試管內(nèi)加入5 mL底物溶液(3×10-4mol/Lα-醋酸萘脂溶液)，再加入酶液1 mL搖勻后置于25 ℃下溫育30 min，加入顯色液1 mL搖勻，終止反應(yīng)并顯色，待出現(xiàn)穩(wěn)定的藍(lán)綠色，在分光光度計(jì)上測(cè)定OD600值。對(duì)照以1 mL緩沖液代替酶液，其余處理相同。酶比活力以1 min內(nèi)OD值增加0.01為1個(gè)酶活力單位，并以單位/15頭蚜蟲表示[12]。

1.6.2 桃蚜海藻糖酶活力 取2%海藻糖溶液24 mL于小三角瓶中，加入酶液6 mL，搖勻置于37℃下溫育30 min后，置于沸水中煮2～3 min終止反應(yīng)，將反應(yīng)液用濾紙過濾后測(cè)定其中的還原性葡萄糖。測(cè)定方法采用陳長(zhǎng)坤的測(cè)定方法[13]。酶比活力以1 min內(nèi)水解出還原性糖量增加1 mg為1個(gè)酶活力單位，并以單位/頭蚜蟲表示。

1.6.3 桃蚜乙酰膽堿酯酶 在具塞試管內(nèi)加入氯化乙酰膽堿1 mL，再加入酶液1 mL，迅速搖勻計(jì)時(shí)，并置于37 ℃下溫水浴40 min，而后立即依次加入2 mol/L鹽酸羥胺和3.5 mol/L氫氧化鈉混合液(按1∶1比例臨時(shí)混合)2 mL、1∶2鹽酸溶液(鹽酸與水體積比)1 mL、0.37 mol/L三氯化鐵溶液1mL，用分光光度計(jì)測(cè)定540 nm處的OD540值。對(duì)照以0.5 mL緩沖液代替酶液，且在加入鹽酸羥胺和氫氧化鈉混合液之前加1∶2鹽酸溶液，其余處理相同。酶比活力以1 min內(nèi)OD值增加0.01為1個(gè)酶活力單位，并以單位/15頭蚜蟲表示[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 大蒜精油對(duì)桃蚜的觸殺毒力

由表1可知，大蒜精油對(duì)桃蚜成蟲表現(xiàn)出較強(qiáng)的觸殺活性，其24 h、48 h及72 h的觸殺活性LC50值分別為270.99 μg/mL、112.97 μg/mL和77.03 μg/mL。

表1 大蒜精油對(duì)桃蚜的觸殺毒力

Table 1 Contact toxicity of garlic essential oil toM.persicae

處理時(shí)間/hTreatmenttime回歸方程(y=a+bx)Regressionequationab相關(guān)系數(shù)rCorrelationcoefficientLC50值/(μg/mL)LC50valueLC50值95%置信區(qū)間95%confidenceintervalsofLC50value242．79330．90700．9907270．99149．27～491．97481．87281．52330．9805112．9775．85～168．23721．66551．76730．995477．0350．29～118．01

2.2 大蒜精油對(duì)桃蚜生理生化的影響

2.2.1 大蒜精油處理桃蚜的蛋白質(zhì)含量及海藻糖酶活力 由表2可知，當(dāng)蟲體接觸大蒜精油后其蛋白質(zhì)含量先增加后降低，在處理后8 h，供試桃蚜蛋白含量增加2.270 3 mg/15頭；處理12 h后蛋白質(zhì)

表2 大蒜精油處理桃蚜后蛋白質(zhì)含量及海藻糖的酶活力

注：①蛋白質(zhì)含量為3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，②1min內(nèi)水解出還原性糖的量增加1mg為1個(gè)酶活力單位。

Note: ①, Mean ± SE; ②, increased 1 mg reducing sugar by hydrolyzing in a minute is used as one enzyme active unit.

含量受到抑制，抑制率達(dá)16.96%；在處理24 h，其蛋白質(zhì)含量達(dá)1.791 2 mg/15頭，抑制率為10.05%，后逐漸趨于正常水平。海藻糖酶活性先增高，其4 h時(shí)的酶比活力增強(qiáng)率達(dá)81.75%，8 h降低到對(duì)照水平(-1.12%)，后又逐漸上升到24 h的76.87%。

2.2.2 大蒜精油處理桃蚜的中腸酯酶和乙酰膽堿酯酶活力 由表3可知，大蒜精油作用蟲體后，迅速抑制中腸酯酶活性，藥后4 h的抑制率達(dá)41.97%，但在藥后8 h、12 h及24 h的酶活力分別較對(duì)照增強(qiáng)26.18%、27.27%和95.97%，說明大蒜精油作用蟲體后，先迅速抑制中腸酯酶活性，但蟲體在精油作用下酶活迅速增強(qiáng)適應(yīng)逆境，加快對(duì)大蒜精油的解毒代謝；而大蒜精油作用桃蚜后4 h，乙酰膽堿酯酶活性略高于對(duì)照，說明桃蚜受到大蒜精油的刺激表現(xiàn)出興奮狀，但其活性逐漸降低，在8 h、12 h及24 h酶活力抑制率分別為1.4%、2.58%和3.1%。

表3 大蒜精油處理桃蚜后的中腸酯酶和乙酰膽堿酯酶活力

注：①和②均表示 1 min內(nèi)OD值增加0.01為1個(gè)酶活力單位。

Note: ①and ② both indicate that the increased 0.01 OD value in a minute is used as one enzyme active unit.

3 結(jié)論與討論

1) 測(cè)定大蒜精油對(duì)桃蚜的毒力及其生理生化的影響結(jié)果表明，大蒜精油對(duì)桃蚜具有較強(qiáng)的毒力，且經(jīng)大蒜精油LC50濃度處理的試蟲表現(xiàn)出短期內(nèi)酶活性被抑制，隨作用時(shí)間延長(zhǎng)而被迅速誘導(dǎo)激活，海藻糖不斷被分解，蛋白質(zhì)的合成被遏制，破壞能量代謝供求失衡，最終導(dǎo)致死亡。

2) 昆蟲的生命活動(dòng)和行為受內(nèi)部各系統(tǒng)的相互聯(lián)系和協(xié)調(diào)機(jī)制所控制。蛋白質(zhì)是生物體最重要的特征，它存在于所有生活的細(xì)胞中，如酶在細(xì)胞代謝過程中控制著很多化學(xué)反應(yīng)。因此，蛋白質(zhì)及中腸酯酶、海藻糖酶等都是昆蟲能量代謝中的重要因子，它們之間一定存在著某些協(xié)調(diào)關(guān)系[12]。試驗(yàn)表明，大蒜精油對(duì)桃蚜蛋白質(zhì)的合成有遏制作用，干擾其蛋白質(zhì)的正常代謝，12 h抑制率達(dá)16.96%；海藻糖酶活性則先增強(qiáng)，4 h時(shí)其酶比活力增強(qiáng)率達(dá)81.75%，說明桃蚜最初受大蒜精油刺激而興奮，能量消耗大，以滿足能量需求蟲體體內(nèi)儲(chǔ)藏的海藻糖被加速分解；而在處理8 h后降低到對(duì)照水平，之后逐漸上升，可能為桃蚜消化系統(tǒng)受到破壞，能量供應(yīng)不足，只能利用蟲體自身儲(chǔ)存的海藻糖等能源，海藻糖不斷被分解，所以海藻糖酶比活力在8 h后又逐漸升高，直到桃蚜死亡。

3) 大蒜精油處理桃蚜后，其乙酰膽堿酯酶活性受刺激后略微升高后逐漸降低，但相對(duì)于空白對(duì)照變化較小，可能大蒜精油對(duì)桃蚜乙酰膽堿酯酶活性的影響較小。而昆蟲中腸酯酶是消化酶中很重要的一類酶，幾乎在所有的生物中都存在，其在生物不同組織、不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量也有差異，當(dāng)有外源有毒物質(zhì)進(jìn)入生物體后，可被誘導(dǎo)增強(qiáng)活性，從而增強(qiáng)對(duì)外源有毒物質(zhì)的代謝能力而保護(hù)自身體機(jī)[14]。在該試驗(yàn)中，中腸酯酶在4 h時(shí)活性受到抑制，抑制率為41.97%，蟲體靠蛋白質(zhì)、海藻糖等提供能量，與蛋白質(zhì)、海藻糖酶的變化一致。本試驗(yàn)中，桃蚜中腸酯酶活性在經(jīng)大蒜精油LC50濃度處理8 h后，其酶活性不斷升高，在24 h酶比活力增強(qiáng)率達(dá)95.97%，說明大蒜精油對(duì)桃蚜有較強(qiáng)的生物活性，已誘導(dǎo)激發(fā)供試?yán)ハx的解毒酶活性。

目前，關(guān)于昆蟲酯酶與昆蟲抗藥性的研究越來越多，并已深入到分子水平。一般認(rèn)為是編碼酯酶基因的過量表達(dá)使酯酶解毒酶量增加或活性提高，從而使對(duì)殺蟲藥劑產(chǎn)生抗藥性，在棉鈴蟲細(xì)胞色素P450方面已經(jīng)有相關(guān)研究報(bào)道[15]。當(dāng)然，大蒜精油誘導(dǎo)編碼桃蚜中腸酯酶基因的表達(dá)增加導(dǎo)致解毒能力增強(qiáng)等，從分子水平明確其機(jī)理仍需深入研究。

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(責(zé)任編輯： 孫小嵐)

Effects of Garlic Essential Oil on Biological Activity, Physiology and Biochemistry ofMyzwspersicae

ZHANG Qiang1, LIANG Weibo2, DU Xueyong2, FA Yanhai2, WANG Xuegui2*

(1.YanjiangAgricultureTechnologyandPopularizingCenter,Ziyang,Sichuan641300; 2.LaboroatoryofPollution-freePesticide,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu,Sichuan611130,China)

The effects of garlic essential oil on contact toxicity, protein content, acetylcholinesterase activity, midgut esterase activity and trehalase activity ofM.persicaewere determined to study the effects of garlic essential oil on insecticidal activity, physiology and biochemistry ofM.persicaand to obtain botanical pesticides with easily degradable and pollution-free in environment. Results; Garlic essential oil has the strong toxic effect onM.persicae. LC50value of the contact toxicity after 72 h is 77.03 mg/mL. Garlic essential oil can increase midgut esterase activity, decompose mycose continuously, inhibit protein synthesis gradually and destroy the energy metabolism system greatly inM.persicae, which results in death ofM.persicaebecause of the imbalance between energy supply and demand inM.persicae. In conclusion, garlic essential oil can be used as the biological insecticide to controlM.persicaeeffectively.

garlic essential oil;Myzwspersicae; contact toxicity; physiology and biochemistry, enzyme activity

2015-07-20； 2016-01-09修回

中央高校特別資助項(xiàng)目“大蒜精油對(duì)大棚蔬菜蚜蟲防控效果及機(jī)理研究”(2011JS080)

張 強(qiáng)(1984-)，男，助理農(nóng)藝師，從事農(nóng)技推廣工作。E-mail: 306233332@qq.com

*通訊作者:王學(xué)貴(1976-)，男，副教授，從事農(nóng)藥學(xué)的教學(xué)與科研工作。E-mail:25202310@qq.com

1001-3601(2016)01-0019-0068-04

S433.3

A