蘇治福　張鉦應(yīng)　萬澤房　熊文林　杜昕如　雷　昕　俞　琦

貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州　貴陽　550025

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桑菊飲抗菌及對(duì)小鼠免疫功能影響的初步研究

蘇治福張鉦應(yīng)萬澤房熊文林杜昕如雷昕俞琦*

貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽550025

【摘要】目的：觀察桑菊飲的抗菌作用和對(duì)小鼠免疫功能的影響，探討其治療上呼吸道感染等病癥的機(jī)制。方法：采用體外抗菌試驗(yàn)檢測(cè)桑菊飲對(duì)不同細(xì)菌的最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)；將小鼠隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組、桑菊飲高/低劑量組，以生理鹽水和不同劑量桑菊飲連續(xù)灌胃7d，檢測(cè)各組小鼠免疫器官指數(shù)、脾淋巴細(xì)胞增殖能力和腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力。結(jié)果：桑菊飲對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯菌均有抑制作用，對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的抑菌作用最強(qiáng)，MIC、MBC均為50mg/ml和100mg/ml。與生理鹽水對(duì)照組比較，桑菊飲能顯著提高小鼠胸腺、脾臟指數(shù)，增強(qiáng)淋巴細(xì)胞增殖能力和巨噬細(xì)胞的吞噬功能(P<0.05)。結(jié)論：桑菊飲具有抗菌和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的活性，該活性是防治上呼吸道感染等癥的作用之一。

【關(guān)鍵詞】桑菊飲；抗菌；免疫功能

桑菊飲出自清代《溫病條辨》，由桑葉、菊花、連翹、苦桔梗等八味中藥組成，為辛涼解表之劑，具有宣肺止咳、疏風(fēng)清熱的功效，臨床用于外感風(fēng)熱、咳嗽初起之證，如上呼吸道感染、急性氣管炎等均可加減運(yùn)用。臨床研究表明，桑菊飲對(duì)上呼吸道感染、咳嗽、支氣管炎等病癥具有顯著療效[1-4]，但對(duì)其作用機(jī)制的研究報(bào)道較少。本研究擬通過桑菊飲的抗菌試驗(yàn)和對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)、脾淋巴細(xì)胞功能和吞噬細(xì)胞吞噬能力的檢測(cè)，探討該方藥防治上呼吸道感染的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料

1.1藥材桑葉、菊花、薄荷、苦桔梗、杏仁、連翹、葦根、生甘草均購自同仁堂貴陽藥店，經(jīng)鑒定為正品。按常規(guī)方法用水提取、濃縮，調(diào)整濃度為0.8g生藥/ml，濾過除菌后置4℃冰箱備用。

1.2試劑營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(批號(hào)：131010)、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：130731)購自杭州天和微生物試劑有限公司；S.S瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：120725，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司)；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(美國GIBCO公司)；刀豆蛋白A(美國Sigma公司)；MTT(美國Amkesco公司)。

1.3儀器AB135-S型電子天平(梅特勒托利多上海公司)；3131型CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；DG3021酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國BIO-TEK公司)；生物顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.4菌種金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、大腸埃希菌(ATCC25922)、銅綠假單胞菌(ATCC27853)、肺炎鏈球菌(ATCC49619)、肺炎克雷伯菌(ATCC700603)均購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.5實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)昆明種小鼠24只，體重(20±2)g，雌雄各半，購自重慶騰鑫比爾實(shí)驗(yàn)動(dòng)物銷售有限公司，動(dòng)物合格證：SCXK(軍)2012-0011。

2方法

2.1體外抗菌試驗(yàn)

2.1.1菌液的制備[5]采取十倍稀釋法，肺炎鏈球菌以10% 胎牛血清營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)18 h，以相同培養(yǎng)基1∶10稀釋為試驗(yàn)菌液；其他細(xì)菌以營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)后，制成1×103細(xì)菌懸液。

2.1.2最低抑菌濃度(MIC)測(cè)定采用二倍稀釋法，用相應(yīng)液體培養(yǎng)基稀釋藥物，共8個(gè)藥物濃度，分別為800、400、200、100、50、25、12.5、6.25mg/ml，依次加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，1ml/每孔，各孔加入試驗(yàn)菌液50 μl，并設(shè)菌液和培養(yǎng)基對(duì)照孔，37℃培養(yǎng)18 h，肉眼和倒置顯微鏡下觀察有無細(xì)菌生長。以能抑制細(xì)菌生長的藥物最高稀釋度為最低抑菌濃度(MIC)。

2.1.3最低殺菌濃度(MBC)測(cè)定[6]分別取上述無細(xì)菌生長孔內(nèi)的培養(yǎng)物100 μl接種于相應(yīng)固體瓊脂平板培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。以菌落數(shù)少于5個(gè)的藥物最高稀釋度為該藥的最小殺菌濃度(MBC)。

2.2對(duì)小鼠免疫功能的影響

2.2.1動(dòng)物分組及給藥小鼠購回適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組、桑菊飲高劑量組、桑菊飲低劑量組，每組8只。高、低劑量組分別按10 g/kg 和5 g/kg(體重)灌胃，每天2次，連續(xù)7d。生理鹽水對(duì)照組代以等體積生理鹽水。

2.2.2免疫器官指數(shù)測(cè)定末次給藥5 h后，脫頸椎處死小鼠，稱量小鼠體重，取腹腔液后，無菌分離小鼠的胸腺和脾臟，于電子天平上稱重。免疫器官系數(shù)=免疫器官重量∕體重。

2.2.3脾淋巴細(xì)胞的制備將分離的脾臟置于200目的篩網(wǎng)研磨，收集細(xì)胞懸液，4℃，600r離心8 min，棄上清。用Hank's液重懸細(xì)胞，加5 ml紅細(xì)胞裂解液作用5 min，再用Hank's液離心洗滌2次，用RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色，鏡下計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×106個(gè)/ml。

2.2.4MTT法測(cè)定淋巴細(xì)胞增殖能力[7]取脾細(xì)胞懸液加入到24孔培養(yǎng)板中，每孔1 ml，加入ConA液75 μl(同時(shí)設(shè)不加ConA的對(duì)照孔)，置37℃，5% CO2，相對(duì)濕度為100%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)68 h，每孔加入MTT 50 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，培養(yǎng)結(jié)束后，加入酸性異丙醇，充分混勻，用酶標(biāo)儀于波長570nm處測(cè)光密度值(OD)。

2.2.5中性紅法檢測(cè)巨噬細(xì)胞吞噬功能[8]常規(guī)方法無菌取腹腔液，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×106個(gè)/ml。將細(xì)胞置于96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)24h后，棄上清，加入含培養(yǎng)液的濃度為0.002 g /ml中性紅溶液200μl/孔，置37℃，5% CO2培養(yǎng)3 h，離心棄上清，PBS 洗2次，除去細(xì)胞外未被吞噬的中性紅，最后加細(xì)胞裂解液(乙酸∶乙醇=1∶1)200μl，待細(xì)胞全部裂解后，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀在 520 nm測(cè)OD值。

3結(jié)果

3.1體外抗菌作用由表1可知，桑菊飲對(duì)受試的5個(gè)菌種均有明顯的抑制作用。其中，對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的抑菌作用最強(qiáng)，MIC、MBC分別為50mg/ml、100mg/ml。

表1　桑菊飲MIC、MBC測(cè)定結(jié)果

注：+：有細(xì)菌生長；-：無細(xì)菌生長。

3.2 對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響 由表2可知，與生理鹽水對(duì)照組比較，桑菊飲高劑量組胸腺、脾臟指數(shù)均明顯升高，低劑量組能顯著提高脾臟指數(shù)(P<0.01)。

表2桑菊飲對(duì)小鼠胸腺、脾臟指數(shù)的影響

±s，n=8)

注：與生理鹽水對(duì)照組比較，**P<0.01。

3.3對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞功能的影響由表3可知，與生理鹽水對(duì)照組比較，桑菊飲高、低劑量組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖能力和腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅的能力均顯著提高(P<0.05)。

±s，n=8)

注：與生理鹽水對(duì)照組比較，*P<0.05,**P<0.01

4討論

上呼吸道感染屬于中醫(yī)外感疾病范疇，與“感冒”、“傷風(fēng)”、“傷寒”、“冒暑”、“傷風(fēng)發(fā)熱”等多種中醫(yī)病證有關(guān)[9]，主要由病毒、細(xì)菌等微生物入侵引起上呼吸道炎癥，表現(xiàn)為頭痛、咳嗽、流涕、咽痛等局部癥狀及發(fā)熱、乏力等全身癥狀。西醫(yī)治療以對(duì)癥治療和支持治療為主，尚無特效藥。大量臨床研究表明，中醫(yī)藥防治上呼吸道感染具有療效好、副反應(yīng)小、不易耐藥等特點(diǎn)，臨床應(yīng)用越來越廣泛。桑菊飲為辛涼解表劑，具有宣肺止咳、疏風(fēng)清熱的功效。藥理研究表明，方中的桑葉、菊花、連翹等具有明顯抗菌作用；杏仁、苦桔梗、生甘草具有抗炎止咳等功效。但對(duì)其組成方藥后的藥理作用研究很少，為探索該方藥防治上呼吸道感染的作用機(jī)制，我們對(duì)桑菊飲的抗菌作用和對(duì)小鼠免疫功能的影響進(jìn)行了初步研究。

金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯菌是上呼吸道感染常見的病原體，可經(jīng)外源性或內(nèi)源性感染途徑進(jìn)入呼吸道，并大量繁殖產(chǎn)生毒力。研究結(jié)果顯示，桑菊飲對(duì)以上菌種均有抑制作用，尤其是對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的抑菌作用最強(qiáng)，表明桑菊飲能通過抑制細(xì)菌生長而減輕感染癥狀。胸腺是中樞免疫器官，脾臟是最大的外周免疫器官，其重量可在一定程度上反映機(jī)體的免疫功能；脾臟T淋巴細(xì)胞是介導(dǎo)特異性細(xì)胞免疫的主要細(xì)胞，巨噬細(xì)胞參與了非特異性免疫和特異性免疫，在其中發(fā)揮重要的吞噬效應(yīng)和抗原提呈作用。研究結(jié)果顯示，與生理鹽水對(duì)照組比較，桑菊飲能顯著提高小鼠胸腺、脾臟指數(shù)，增強(qiáng)淋巴細(xì)胞增殖能力和巨噬細(xì)胞的吞噬功能(P<0.05)，高劑量組作用最明顯。提示桑菊飲對(duì)機(jī)體的免疫功能具有調(diào)節(jié)作用，其可通過增強(qiáng)免疫器官功能、加強(qiáng)特異性和非特異性免疫反應(yīng)，從而達(dá)到抗菌、抗感染的治療效果，其作用具有一定的量效關(guān)系。提示桑菊飲臨床防治上呼吸道感染的機(jī)制可能與其抗菌作用和增強(qiáng)機(jī)體的免疫力有關(guān)。

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(收稿日期：2015.10.20)

【中圖分類號(hào)】R258.5

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

【文章編號(hào)】1007-8517(2016)01-0016-02

作者簡介：蘇治福(1991-)，男，貴州人，2011級(jí)中醫(yī)專業(yè)本科生。通信作者：俞琦(1978-)，女，貴州貴陽人，碩士，副教授，主要從事中西醫(yī)結(jié)合研究。E-mail:sgyq.a@163.com

基金項(xiàng)目：國家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201310662013)。