陳 敏， 許慶山， 趙成飛， 陳萍萍， 吳旸婷， 翁少煌， 林新華

基于7-OH香豆素-MnO2復(fù)合體系的熒光平臺(tái)檢測(cè)谷胱甘肽

陳 敏1， 許慶山1， 趙成飛2， 陳萍萍2， 吳旸婷2， 翁少煌2， 林新華2

目的 構(gòu)建7-OH香豆素-MnO2復(fù)合體系的熒光平臺(tái)檢測(cè)谷胱甘肽并用于藥物質(zhì)量控制。 方法 化學(xué)法合成MnO2納米薄片并用于吸附7-OH香豆素形成復(fù)合體系，由于MnO2納米薄片的內(nèi)濾效應(yīng)使得7-OH香豆素的熒光猝滅。谷胱甘肽(GSH)可與MnO2發(fā)生氧化還原反應(yīng)，MnO2轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄缘腗n2+從而釋放出7-OH香豆素，恢復(fù)熒光。對(duì)比GSH加入前后熒光的恢復(fù)程度，熒光信號(hào)增大的幅度與GSH濃度正相關(guān)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)GSH的高靈敏檢測(cè)。 結(jié)果 該熒光平臺(tái)可選擇性識(shí)別GSH。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，熒光恢復(fù)值與GSH在0.03～400 μmol/L呈線性關(guān)系，檢測(cè)限為0.01 μmol/L。 結(jié)論 構(gòu)建的7-OH香豆素-MnO2復(fù)合體系的熒光平臺(tái)可簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確地檢測(cè)GSH，可用于實(shí)際藥品中GSH的測(cè)定。

谷胱甘肽； 香豆素類△； 錳化合物； 熒光計(jì)； 藥用制劑/*分析； 質(zhì)量控制

還原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)是一種重要的非蛋白類物質(zhì)和抗氧化劑，可以調(diào)整體內(nèi)細(xì)胞的正常增殖[1-2]。GSH濃度的變化與癌癥、肝損傷、艾滋病、機(jī)體老化、糖尿病等相關(guān)；GSH的監(jiān)控也是藥物質(zhì)量控制的重要指標(biāo)[3-5]。因此，GSH的定性定量檢測(cè)對(duì)研究機(jī)體生理狀態(tài)具有重要的作用。熒光分析法因其靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低而被廣泛地應(yīng)用于藥物分子和離子的測(cè)定，它可以通過(guò)與目標(biāo)待測(cè)分子作用，從而產(chǎn)生因目標(biāo)誘導(dǎo)的熒光變化，且信號(hào)變化值與目標(biāo)物的濃度呈直接關(guān)系[6-7]。香豆素類衍生物含有苯并吡喃酮結(jié)構(gòu)，可發(fā)射藍(lán)光，具有熒光量子產(chǎn)率高和光穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛地應(yīng)用于生物實(shí)驗(yàn)中。二氧化錳(MnO2)納米薄片可吸附熒光量子點(diǎn)材料并猝滅熒光，用于建立信號(hào)開(kāi)關(guān)型的熒光檢測(cè)體系[8-9]。本研究擬制備MnO2納米薄片，與7-OH香豆素作用形成熒光猝滅的香豆素-MnO2納米復(fù)合體系(7-OH香豆素-MnO2復(fù)合體系)定量檢測(cè)GSH[10]，探索發(fā)展藥物質(zhì)量控制新方法。

1 材料與方法

1.1 材料 熒光分光光度計(jì)(Cary eclipse，美國(guó)安捷倫科技有限公司)；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-2450，日本島津公司)；四甲基氫氧化銨(批號(hào)：MKBT8964V)和二氯化錳溶液(MnCl2)(批號(hào)：SLBB9634V)，購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；GSH(反應(yīng)級(jí)，批號(hào)：LN30P109)和7-OH香豆素(批號(hào)：L140Q74)購(gòu)自百靈威科技有限公司；不同pH值的10 mmol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液(HAc-NaAc)、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(Na2HPO4-CA)、NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液(PB)、磷酸鹽緩沖液(PBS)和檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液(NaCA-CA)的原料均從國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司購(gòu)買并于實(shí)驗(yàn)室自制。所有試劑除特別說(shuō)明外均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為Millipore超純水。

1.2 方法

1.2.1 MnO2納米薄片的制備 稱取2.174 7 g四甲基氫氧化銨和0.593 8 g MnCl2·4H2O，分別溶解于20 mL和10 mL的去離子水中。在20 mL的四甲基氫氧化銨溶液中加入0.6 mL的30% H2O2，并在攪拌的情況下將其全部加入到10 mL的MnCl2溶液中，15 s內(nèi)立即變成黑褐色并產(chǎn)生煙。持續(xù)攪拌過(guò)夜反應(yīng)14 h。后將得到的產(chǎn)物離心(2 000 r/min，20 min)并用去離子水和甲醇分別洗滌3次。洗滌后的產(chǎn)物于60 ℃干燥、備用，得到干燥的MnO2納米薄片約1.52 g。取40 mg MnO2納米薄片溶解于20 mL的去離子水中(2 mg/mL),超聲處理得到分散物。

1.2.2 7-OH香豆素-MnO2復(fù)合體系的制備 取30 μL濃度為28 μg/mL的7-OH香豆素溶液，加入 60 μL 2 mg/mL的MnO2溶液，用碳酸氫鈉-檸檬酸緩沖液(10 mmol/L，pH 5.5)稀釋至300 μL，室溫下振蕩反應(yīng)數(shù)分鐘后得到復(fù)合體系。

1.2.3 GSH熒光的檢測(cè) 取制備好的7-OH香豆素-MnO2復(fù)合體系，加入一定濃度的GSH，在50 ℃下反應(yīng) 30 min后，轉(zhuǎn)移到350 mL的石英比色皿中，激發(fā)狹縫為5 nm，發(fā)射狹縫為5 nm，電壓680 V，在激發(fā)波長(zhǎng)326 nm處進(jìn)行熒光測(cè)定。

1.2.4 GSH片劑的檢測(cè) 稱量10片還原性GSH片，計(jì)算平均片重，研細(xì)，取100 mg溶解于10 mL水中，過(guò)濾后備用。適當(dāng)稀釋并以1.2.3的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行測(cè)定，并根據(jù)2015版中國(guó)藥典要求計(jì)算百分標(biāo)示含量。

1.2.5 注射用GSH的檢測(cè) 將GSH干凍粉(600 mg)加入5 mL去離子水溶解，備用。采用加樣回收率實(shí)驗(yàn)對(duì)注射用GSH進(jìn)行檢測(cè)。以1.2.3的相同條件下進(jìn)行測(cè)定，并根據(jù)2015版中國(guó)藥典要求計(jì)算百分標(biāo)示含量。

2 結(jié) 果

2.1 7-OH香豆素與 7-OH香豆素-MnO2復(fù)合體系的光學(xué)表征 紫外可見(jiàn)吸收光譜和熒光激發(fā)、發(fā)射光譜對(duì)7-OH香豆素、MnO2納米薄片，7-OH香豆素-MnO2復(fù)合體系進(jìn)行表征(圖1)。7-OH香豆素在325 nm處有一個(gè)最大紫外吸收峰，MnO2納米薄片在300～500 nm有一個(gè)寬的吸收帶[12]；GSH無(wú)明顯的吸收峰；7-OH香豆素-MnO2復(fù)合體系在300～500 nm處有2個(gè)吸收峰，325 nm處表現(xiàn)出比7-OH香豆素寬并重疊的吸收峰，在375～500 nm處有一個(gè)類似MnO2的寬吸收峰；7-OH香豆素-MnO2復(fù)合體系中加入GSH后，在325 nm處表現(xiàn)出歸屬于7-OH香豆素吸收峰且相比于7-OH香豆素-MnO2復(fù)合體系在325 nm處的吸收值增大，而歸屬于MnO2位于375～500 nm的寬吸收峰有所降低(圖1A)。7-OH香豆素的熒光光譜發(fā)射光譜和激發(fā)光譜可見(jiàn)7-OH香豆素在326 nm處激發(fā)，在458 nm處最大發(fā)射(圖1B)。對(duì)比圖1A和1B可知，位于458nm的發(fā)射波長(zhǎng)剛好落在MnO2的300～500 nm的寬吸收峰。

2.2 7-OH香豆素-MnO2復(fù)合體系檢測(cè)GSH的熒光表征 對(duì)比不同濃度的GSH加入到7-OH香豆素-MnO2復(fù)合體系前后的熒光變化(圖2)。7-OH香豆素中加入MnO2形成7-OH香豆素-MnO2復(fù)合體系，7-OH香豆素的熒光明顯降低，熒光猝滅；加入不同濃度的GSH后，原先被猝滅的熒光逐漸恢復(fù)，隨著加入GSH濃度的增加而熒光增強(qiáng)，檢測(cè)1.0 mmol/L的GSH可以完全恢復(fù)7-OH香豆素原先的熒光強(qiáng)度。增強(qiáng)的熒光強(qiáng)度(ΔF)可用于GSH的定量。

2.3 7-OH香豆素-MnO2復(fù)合體系檢測(cè)GSH的條件優(yōu)化

2.3.1 MnO2濃度優(yōu)化 MnO2納米薄片吸附7-OH香豆素引起熒光猝滅。首先對(duì)MnO2的濃度進(jìn)行優(yōu)化，隨著MnO2濃度的增大，7-OH香豆素的熒光強(qiáng)度逐漸降低。當(dāng)MnO2濃度為0.4 mg/mL的時(shí)候，熒光強(qiáng)度最低(圖3)。

2.3.2 GSH測(cè)定體系中緩沖溶液種類及pH優(yōu)化 使用NaH2PO4-CA緩沖液在pH 3～10進(jìn)行pH篩選，可知在pH 5.5的時(shí)候熒光恢復(fù)值(ΔF)最強(qiáng)(圖4A)。在此pH條件下，考察不同沖液加入0.5 mmol/L GSH前后的ΔF變化情況，其中 NaH2PO4-CA緩沖液的ΔF變化最大(圖4B)。選擇pH 5.5的NaH2PO4-CA緩沖液為最佳的溶液反應(yīng)體系。

2.3.3 GSH測(cè)定體系中溫度及反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化 對(duì)比30 min時(shí)不同溫度的ΔF，在50 ℃的時(shí)候最大(圖5A)?？疾?0 ℃的條件下檢測(cè)GSH時(shí)的動(dòng)力學(xué)反應(yīng)過(guò)程，在25 min時(shí)反應(yīng)達(dá)到平衡，且后續(xù)熒光值保持穩(wěn)定(圖5B)，故50 ℃下反應(yīng)25 min為最適的反應(yīng)溫度和時(shí)間。

2.4 GSH檢測(cè)的特異性 常見(jiàn)的金屬離子不會(huì)對(duì)7-OH香豆素的熒光響應(yīng)產(chǎn)生顯著影響(圖6A)。在相同的測(cè)定條件下，除了半胱氨酸(Cys)含有與GSH一樣的巰基基團(tuán)，可以恢復(fù)熒光，其他的生物分子(多巴胺、抗壞血酸和多種氨基酸)不會(huì)恢復(fù)7-OH香豆素-MnO2復(fù)合體系的熒光(圖6B)。

2.5 GSH的定量檢測(cè)

2.5.1 GSH標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 用7-OH香豆素-MnO2復(fù)合體系在最佳的反應(yīng)條件下測(cè)定一系列不同濃度的GSG標(biāo)準(zhǔn)溶液，探討GSH濃度與7-OH香豆素的熒光強(qiáng)度恢復(fù)值(ΔF)的關(guān)系。隨著GSH濃度增加，其熒光強(qiáng)度逐漸加強(qiáng)(圖7A)。當(dāng)GSH在0.03～400 μmol/L內(nèi)，其濃度與ΔF呈正相關(guān)(圖7B)，其線性方程為ΔF=1.769 4CGSH+18.797 5，R2=0.990 4，檢測(cè)限為0.01 μmol/L(S/N=3)。

2.5.2 還原型GSH片劑和凍干粉中GSH的含量測(cè)定 以還原型GSH片劑和凍干粉作為代表性實(shí)際樣品，加入特定稀釋倍數(shù)的片劑或者凍干粉，測(cè)定其熒光強(qiáng)度，以標(biāo)準(zhǔn)曲線(△F=1.769 4CGSH+18.797 5)測(cè)定濃度，并根據(jù)藥典要求，計(jì)算得到片劑和凍干粉的百分標(biāo)示含量分別為102.7%和97.7%，符合藥典規(guī)定的百分標(biāo)示含量(95.0%～105.0%)。

3 討 論

紫外可見(jiàn)吸收光譜和熒光光譜可用于熒光染料(材料)的光學(xué)性質(zhì)及其變化的測(cè)定。由于7-OH香豆素的π-π*躍遷，其最大紫外可見(jiàn)吸收峰位于325 nm。7-OH香豆素-MnO2復(fù)合體系在紫外可見(jiàn)吸收光譜中325 nm位置的吸收峰和375～500 nm范圍的寬吸收峰表明所制備的7-OH香豆素-MnO2復(fù)合體系包含了7-OH香豆素和MnO2的各自性質(zhì)，且其中位于375～500 nm范圍的寬吸收峰是由于MnO2八面體結(jié)構(gòu)的d-d躍遷引起的[11]。7-OH香豆素最大發(fā)射波長(zhǎng)位于458 nm的熒光發(fā)光光譜剛好位于MnO2的寬吸收峰范圍，可以發(fā)生內(nèi)濾效應(yīng)，從而使得7-OH香豆素-MnO2復(fù)合體系中香豆素的熒光發(fā)光光譜被MnO2所吸收而猝滅熒光[11]。

7-OH香豆素-MnO2復(fù)合體系猝滅的熒光隨著GSH的加入而逐漸恢復(fù)，這是由于GSH具有還原性，與MnO2納米薄片反應(yīng)并將MnO2還原成可溶性的Mn2+，釋放出原先吸附在MnO2納米薄片表面的7-OH香豆素，從而恢復(fù)熒光。隨著加入GSH濃度的增加，熒光恢復(fù)程度(ΔF)增強(qiáng)。因此，選擇GSH加入前后熒光恢復(fù)程度(ΔF)定量檢測(cè)GSH的濃度。

MnO2納米薄片通過(guò)吸附7-OH香豆素而形成熒光猝滅體系，其濃度會(huì)影響7-OH香豆素的猝滅效率。隨著MnO2濃度的增大，7-OH香豆素的熒光強(qiáng)度逐漸降低，因此選用適量的MnO2納米薄片可有效吸附7-OH香豆素以形成檢測(cè)GSH的熒光平臺(tái)。合適的緩沖液類型及pH有利于MnO2與GSH氧化還原反應(yīng)的進(jìn)行以提高GSH的檢測(cè)性能。溫度的升高有利于反應(yīng)的進(jìn)行從而提高熒光恢復(fù)值，但溫度過(guò)高會(huì)加劇熒光分子間的碰撞而降低熒光恢復(fù)值。MnO2與GSH反應(yīng)需要一定的時(shí)間，熒光恢復(fù)值隨時(shí)間延長(zhǎng)先增大后趨于穩(wěn)定，反應(yīng)完成，從而完全釋放7-OH香豆素。

生物體系、藥物中成分復(fù)雜繁多。通常情況下，金屬離子如Fe3+，Cu2+等會(huì)對(duì)熒光染料或材料產(chǎn)生猝滅作用[6,12]，因此首先對(duì)比多種金屬離子對(duì)7-OH香豆素?zé)晒忭憫?yīng)的影響。本研究結(jié)果顯示，較高濃度的金屬離子不會(huì)影響7-OH香豆素的熒光響應(yīng)。在相同實(shí)驗(yàn)條件下，除了Cys因含有與GSH一樣的巰基(-SH)將MnO2納米薄片還原成Mn2+，可以使7-OH香豆素-MnO2復(fù)合體系的熒光恢復(fù)，而其他的生物分子不會(huì)恢復(fù)7-OH香豆素-MnO2復(fù)合體系的熒光。由于常見(jiàn)的藥物中幾乎不添加Cys，因此，應(yīng)用7-OH香豆素-MnO2復(fù)合體系可以選擇性地檢測(cè)藥物中GSH。

在優(yōu)化的條件下，應(yīng)用7-OH香豆素-MnO2復(fù)合體系測(cè)定不同濃度的GSH。隨著GSH濃度的增大，7-OH香豆素的熒光逐漸恢復(fù)增強(qiáng)，△F逐漸增大。GSH在0.03～400 μmol/L范圍內(nèi)，△F與GSH濃度呈線性關(guān)系，其線性方程可用于實(shí)際體系中GSH含量的定量分析。根據(jù)信號(hào)/背景值為3(S/N=3)的關(guān)系得到本方法測(cè)定GSH的檢測(cè)限(0.01 μmol/L)較低，可以滿足生物體系、藥物分析等方面檢測(cè)的要求。還原型GSH片劑和凍干粉測(cè)定的百分標(biāo)示含量符合2015版中國(guó)藥典的要求，說(shuō)明本方法測(cè)定實(shí)際藥物的準(zhǔn)確度。

綜上所述，本研究發(fā)展并建立基于7-OH香豆素-MnO2復(fù)合體系的熒光信號(hào)平臺(tái)，建立了簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的GSH測(cè)定新方法，可進(jìn)一步發(fā)展此技術(shù)用于實(shí)際藥品生產(chǎn)、流通、經(jīng)營(yíng)、管理過(guò)程中GSH的測(cè)定。

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(編輯:張慧茹)

Fluorescent Platform Based on 7-Hydroxycoumarin-MnO2Composites for Glutathione Sensing

CHEN Min1, XU Qingshan1, ZHAO Chengfei2, CHEN Pingping2,WU Yangting2, WENG Shaohuang2, LIN Xinhua2

1. Department of Orthopedic Surgery, Fujian Medical University Union Hospital, Fuzhou 350001, China；2. Department of Pharmaceutical Analysis, Faculty of Pharmacy, Fujian Medical University, Fuzhou 350108, China

Objective To construct a fluorescence platform based on 7-Hydroxycoumarin-MnO2composites for the detection of glutathione and for its application in drug quality control. Method MnO2nanosheets prepared by chemical method were used for the adsorption of 7-OH to form a composite system. Due to the internal filtering effect of MnO2nanosheets, the fluorescence of 7-Hydroxycoumarin was quenched. The introduction of glutathione (GSH) reacted with MnO2through redox reaction, and MnO2was transformed into soluble Mn2+to release absorbed 7-Hydroxycoumarin therefore recovered the quenched fluorescence. Compared the change in fluorescence intensity before and after the addition of GSH, the magnitude of the increase in fluorescence signal was positively correlated with the GSH concentration, therefore the high sensitive detection of GSH could be realized. Result The fluorescence platform can selectively recognize GSH. Under the optimized experimental conditions, the fluorescence recovery value was correlated with the GSH in the range of 0.03 μmol/L to 400 μmol/L in a linear relationship, and the detection limit was 0.01 μmol/L. Conclusion The construction of 7-Hydroxycoumarin-MnO2composites can be used to detect GSH easily and accurately in medicinal testing.

glutathione； coumarins△； manganese compounds； fluorometry； pharmaceutical preparations/*analysis； quality control

2016-06-23

國(guó)家自然科學(xué)基金(21405016)；福建省自然科學(xué)基金(2015J01475,2015J01043)；福建省衛(wèi)生系統(tǒng)中青年骨干人才培養(yǎng)項(xiàng)目(2013-ZQN-JC-16)

福建醫(yī)科大學(xué) 1.附屬協(xié)和醫(yī)院 骨科，福州 350001； 2.藥學(xué)院 藥物分析學(xué)系，福州 350108

陳 敏(1976-)，男，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士

翁少煌. Email: shweng@fjmu.edu.cn

R341.6

A

1672-4194(2016)06-0349-05