劉美清，蘭　英，蔡　曼，袁　慧，范雪松，劉玉磊，王愛萍

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院檢驗科, 北京　100029；

2.中國科學院微生物研究所，北京　100101)

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產(chǎn)黏液分枝桿菌的生物學特征及快速藥敏試驗分析

劉美清1，蘭英2，蔡曼1，袁慧1，范雪松1，劉玉磊1，王愛萍1

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院檢驗科, 北京100029；

2.中國科學院微生物研究所，北京100101)

摘要：目的了解產(chǎn)黏液分枝桿菌的生物學特征，并進行菌種鑒定和藥敏分析，為臨床準確診斷和治療提供科學依據(jù)。方法從患者血需養(yǎng)培養(yǎng)瓶中分離出的可疑菌株，經(jīng)生長時間、快速革蘭染色及萋-尼氏法抗酸染色初篩后，基于16S rRNA基因及rpoB基因序列分析檢測菌株種類，并進行相應的快速藥物敏感性檢測。結(jié)果最終鑒定為非結(jié)核分枝桿菌中的產(chǎn)黏液分枝桿菌，屬于快速生長分枝桿菌類；K-B法體外藥敏試驗顯示，抑菌環(huán)直徑30 mm以上從大到小依次為：克拉霉素、阿米卡星、頭孢克羅、頭孢噻肟、氨芐西林、哌拉西林、阿莫西林﹣克拉維酸、亞胺培南、奈替米星、阿奇霉素。結(jié)論產(chǎn)黏液分枝桿菌有致病性，可引起菌血癥，臨床應根據(jù)患者自身情況，盡早拔除導管，需進行抗感染治療時依據(jù)藥敏結(jié)果合理用藥，防止院內(nèi)感染的發(fā)生。

關鍵詞:非結(jié)核分枝桿菌； 產(chǎn)黏液分枝桿菌； 16S rRNA；菌種鑒定；聚合酶β亞單位

非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria, NTM)可通過呼吸道、胃腸道、皮膚黏膜等途徑侵入人體，可引起無癥狀的感染，多在機體抵抗力低下時發(fā)病，可導致淋巴結(jié)炎、慢性肺部疾病、皮膚和軟組織感染以及全身播散型NTM病等。因此，NTM快速準確的菌種鑒定對疾病的診斷和治療有著極其重要的意義。本實驗從患者血需養(yǎng)培養(yǎng)瓶中分離出NTM菌株并進行了分子生物學快速鑒定和藥敏試驗分析，鑒定結(jié)果為產(chǎn)黏液分枝桿菌(Mycobacterium mucogenicum)，屬于快速生長分枝桿菌類，現(xiàn)報道如下。

1材料和方法

1.1標本來源患者男，22歲，身高170 cm，體質(zhì)量87 kg。體檢發(fā)現(xiàn)降主動脈假性動脈瘤?；颊哂行貝?、左側(cè)胸痛、心慌、氣短，既往無高血壓、冠心病、糖尿病、肝炎、結(jié)核及其他傳染病史，2014年8月5日入住心外科病房，8月25日在全麻體外循環(huán)下行降主動脈替換術。次日轉(zhuǎn)出ICU回普通病房，患者體溫持續(xù)升高，次日和第3日體溫最高達39.8℃，WBC 23.77 G·L-1,NE88.3%；第3天抽取1套血培養(yǎng)，結(jié)果為需養(yǎng)瓶培養(yǎng)陽性，厭氧瓶培養(yǎng)5 d陰性；第4天恢復正?；蛏愿撸坏?天WBC 14.67 G·L-1，NE73.7%，體溫又升高至38.6℃；第7天拔除引流管體溫下降至37.5℃；第8天拔除中心靜脈管后并復查血培養(yǎng)結(jié)果陰性?；颊呦群髴妙^孢孟多酯鈉、美羅培南、頭孢噻利、特治星，術后恢復良好，于9月2日出院。

1.2儀器與試劑血培養(yǎng)瓶、哥倫比亞血瓊脂和麥康凱平板由Oxoid公司提供。GBB16型CO2培養(yǎng)箱；快速革蘭染液、萋-尼氏抗酸染液由珠海貝索生物技術有限公司提供；2× Taq PCR MasterMix(包括了TaqDNA聚合酶、dNTP和優(yōu)化的反應緩沖液)和基因組DNA小量提取試劑盒由天根生化科技(北京)有限公司提供；16 s rRNA及rpoB基因引物由上海生工生物技術有限公司合成。結(jié)核分枝桿菌H37RV敏感株(ATCC 27294)來自北京結(jié)核病胸部腫瘤研究所參比室。

1.3方法

1.3.1菌株的分離培養(yǎng)血需養(yǎng)培養(yǎng)瓶陽性報警后，分別轉(zhuǎn)種于血瓊脂平板和麥康凱平板，置5%～10%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～72 h，麥康凱平板不生長，在血瓊脂平板上可見灰白色、蠟樣菌落生長，標本號命名為10624，并進行后續(xù)實驗。

1.3.2涂片染色挑取單個菌落涂片后，分別進行快速革蘭染色和萋-尼氏法抗酸染色。

1.3.3分子生物學快速鑒定 (1)基因組DNA快速提?。河脽o菌接種環(huán)挑取1～3個菌落，加入25 μL 0.5% Chelex溶液，充分振蕩混勻，沸水浴10～15 min。12 000 rpm離心1min。上清液即為所提取的基因組DNA溶液，-20℃下保存?zhèn)溆谩?2)16S rRNA基因克隆：正向引物27f: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物1492r: 5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。反應體系(100 μL)：2xEasyTaq PCR SuperMix：50 μL；正向引物：2.0 μL；反向引物：2.0 μL；DNA模板：6.0 μL[1]；無菌純水：40.0 μL；PCR擴增反應程序：94℃預變性4 min。94℃變性1 min，55℃復性1 min，72℃延伸1 min為一個循環(huán)，擴增35個循環(huán)后，72℃延伸10 min。PCR擴增完成后，產(chǎn)物在-20℃下保存。(3)rpoB(聚合酶β亞單位)基因克?。阂镌O計根據(jù)標準菌株H37Rv(GenBank accession number L27989)的rpoB基因保守區(qū)設計。正向引物MycoF:5′-GGCAAGGTCACCCCGAAGGG-3′；反向引物MycoR: 5′-AGCGGCTGCTGGGTGATCATC -3′。具體操作步驟同上。(4) 抗菌藥物敏感試驗：采用K-B法檢測，將菌液調(diào)至0.5麥氏單位，具體操作嚴格按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》，在血瓊脂平板上進行待檢菌株對各種抗菌藥物的敏感性檢測，48 h后量取抑菌環(huán)直徑。(5)生理生化實驗：使用梅里埃(BIOMERIEUX，法國)公司細菌鑒定試劑盒API ZYM和API 20E檢測菌株的生理活性，操作步驟按說明書完成。

1.4抗煮沸試驗非致病株煮沸1 min即失去抗酸性，而致病株能耐10 min，甚至高壓滅菌也不失去抗酸性。用于區(qū)分產(chǎn)黏液分枝桿菌是否具有致病性。

2結(jié)果

NTM生物學特征包括生長速度、色素、菌落形態(tài)和生化特征等，此類細菌在形態(tài)、染色等方面具有與結(jié)核桿菌相似的性狀,但又不完全相同。本實驗血需養(yǎng)培養(yǎng)瓶報警時間116.73 h。

2.1血培養(yǎng)液直接涂片快速革蘭染色紅色背景下菌體呈藍色，內(nèi)含有鏈狀排列的異染顆粒；有的只見鏈狀排列的異染顆粒，菌體淡粉色。

2.2菌落形態(tài)將血標本轉(zhuǎn)種培養(yǎng)24h后血平板上，可見灰色、針尖樣細小菌落。48 h后可見干燥、灰白色、小菌落。72 h后菌落逐漸呈蠟樣外觀、灰白色、圓形、突起、邊緣不整齊、粗糙型菌落，直徑0.5～2 mm。用接種環(huán)涂片時，菌落易碎，在玻片上能完全乳化于蒸餾水內(nèi)。

2.3菌落快速革蘭染色菌體為革蘭陽性半透明，大小略長于結(jié)核分枝桿菌，細長直或微彎曲，有的呈梭形，粗細不一，有時有分支。菌體內(nèi)含有1個至多個異染顆粒，1個顆粒多在菌體一端或中部，培養(yǎng)一周后再染色，可見位于頂端的顆粒膨大至菌體兩倍，似火柴頭樣；多個異染顆粒可按串珠樣排列至整個菌體。

2.4抗酸染色顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)菌體形態(tài)異常的分枝桿菌后進行萋-尼氏抗酸染色，大部分陰性(菌體呈藍色)和少量陽性(菌體呈淡粉色和紅色)。

2.5基因快速鑒定待檢菌株的16S rRNA基因的測序結(jié)果經(jīng)GenBank數(shù)據(jù)庫比對，結(jié)果與Mycobacterium phocaicum(富西亞分枝桿菌)，菌株編號CIP108542(T)，序列登陸號AY859682的相似性為100.00%；與Mycobacterium mucogenicum(產(chǎn)黏液分枝桿菌)，菌株編號ATCC 49650(T)，序列登陸號AY457074的相似性也為100.00%；因此，利用16s rRNA基因不能將本次臨床上分離到的菌株鑒定到種水平。

進一步實驗將待檢菌株加測rpoB基因。菌株10624的rpoB基因的測序結(jié)果經(jīng)GenBank數(shù)據(jù)庫比對，結(jié)果與Mycobacterium mucogenicum，菌株編號NTM-0046，序列登陸號KM234050的相似性為100.00%。與Mycobacterium phocaicum CIP 108542相似性96%，序列登錄號AY859692。通過構(gòu)建rpoB gene系統(tǒng)進化樹，說明菌株10624與M. mucogenicum菌株聚在了一枝，與Mycobacterium phocaicum菌株聚在了另一枝，進化關系較遠，再結(jié)合生理生化特征進行比較，由此可以確定菌株10624為產(chǎn)黏液分枝桿菌。見表1，圖1。

2.6產(chǎn)黏液分枝桿菌K-B法體外藥敏試驗試驗顯示，敏感性抗菌藥物的抑菌環(huán)直徑30 mm以上從大到小依次為：克拉霉素、阿米卡星、頭孢克羅、頭孢噻肟、氨芐西林、哌拉西林、阿莫西林﹣克拉維酸、亞胺培南、奈替米星、阿奇霉素。對各種抗菌藥物的檢測結(jié)果見表2。

表1　菌株10624與M.mucogenicum、M.phocaicum

注：*數(shù)據(jù)來自于參考文獻(International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2006), 56, 133-143)

圖1　基于rpoB基因序列構(gòu)建的分枝桿菌屬

抗菌藥物紙片濃度(μg/片)直徑/mm抗菌藥物紙片濃度(μg/片)直徑/mm氟羅沙星(FLE)50頭孢唑啉(CZ)3021羅美沙星(LMF)100頭孢噻肟(CTX)3040環(huán)丙沙星(CIP)510氨芐西林(AM)1040青霉素(G.P)10IU/片28頭胞呋新(CXM)3030紅霉素(E)1523利福平(RA)50氯霉素(C)3020四環(huán)素(TE)3013阿奇霉素(AZI)1530復方新諾明(SXT)1.2520克林霉素(CM)20阿米卡星(AN)3045強力霉素(DO)300頭孢他啶(CAZ)3015克拉霉素(CLA)1545頭孢噻吩(CF)3025妥布霉素(TM)1025頭孢哌酮(CFP)7520萬古霉素(VA)3020哌拉西林(PIP)10038奈替米星(NET)3034苯唑西林(OX)10頭孢曲松(CRO)3020呋喃妥因(FT)3000頭孢克羅(CEC)3040頭孢西丁(FOX)3028亞胺培南(IPM)1036阿莫西林﹣克拉維酸(AMC)3038

3討論

近年來，NTM患病率和分離率不斷提高，目前已知可使人致病的NTM約有30余種[2]，其中大多數(shù)NTM是條件致病菌，少數(shù)為致病菌，分為緩慢生長分枝桿菌和快速生長分枝桿菌兩大類，均與醫(yī)院感染密切相關，最常見的是快速生長分枝桿菌，其中包括產(chǎn)黏液分枝桿菌。產(chǎn)黏液分枝桿菌于1995年Springer首先報道，屬偶然分枝桿菌群的成員，在固體培養(yǎng)基上能高產(chǎn)黏液樣物質(zhì)，它可引起創(chuàng)傷后皮膚感染和敗血癥，還可引起骨關節(jié)感染、醫(yī)院感染等。

NTM種類繁多，引起人類感染的因素也不同。一方面，人可從環(huán)境中感染患病，水是重要的傳播途徑。因為醫(yī)院供水系統(tǒng)使用的鍍鋅管道可使NTM長期生存，可能為導致醫(yī)院內(nèi)感染的主要因素。不同地區(qū)分枝桿菌檢出率各有不同，NTM檢出率最高可達89.3%[3]。另一方面，接觸污染的醫(yī)療用品和器械而引起感染，多為手術、注射及各種侵入性檢查治療中消毒隔離操作不規(guī)范等[4]引起。因此，預防和控制NTM引發(fā)的院內(nèi)感染關鍵是需要抓好醫(yī)院用水以及醫(yī)療器械的消毒滅菌工作。

有研究顯示，從無菌部位如血、骨髓、腦脊液、滑囊液、肺活檢標本等檢測出NTM,肯定是致病菌，但其致病性相對于結(jié)核分枝桿菌要低一些[5]，而且NTM的不同菌種對人的致病力也不相同。本實驗中產(chǎn)黏液分枝桿菌經(jīng)過抗煮沸試驗后，抗酸染色仍為陽性，說明產(chǎn)黏液分枝桿菌確實具有一定的致病性，可引起菌血癥的發(fā)生，所致菌血癥則大多與長時間留置靜脈導管污染有關[6]。由于中心靜脈導管具有操作簡便易行、穿刺次數(shù)少、可以長期留置等諸多方面優(yōu)勢[7]，而導致臨床廣泛應用。本研究患者由于病情嚴重，實施大血管手術后，需要中心靜脈置管進行輸液等治療，所以置管時間長，易導致感染的發(fā)生。因此，最好的治療方法是盡早拔除導管，根據(jù)患者情況再決定是否需要抗感染治療，減少或避免院內(nèi)感染發(fā)生。

NTM的鑒定試驗主要包括細菌學鑒定和分子生物學鑒定兩大類。目前，臨床上常采用的抗酸桿菌涂片檢查，僅有25%～35%的陽性率[8]，檢出率較低。傳統(tǒng)的菌種鑒定采用對硝基苯甲酸(PNB)培養(yǎng)基和噻吩-2-羧酸肼(TCH)培養(yǎng)基進行分枝桿菌初步鑒定，但其不能進行NTM種的鑒定[9]。隨著分子生物學技術的發(fā)展，人們研究建立了多種分子檢測技術，使NTM菌種快速鑒定得以實現(xiàn)，如PCR-直接測序、PCR-RFLP、PCR-探針雜交和基因芯片等技術。

新的研究認為NTM細胞表面的疏水性及細胞壁通透屏障是其廣譜耐藥性生理基礎，是有效化療的障礙。導致大多數(shù)NTM對一線的抗結(jié)核藥物天然耐藥，有的耐藥率為100%[10]，甚至有的患者在抗結(jié)核治療的期間，可能由于患者自身的免疫能力下降或受外部環(huán)境刺激而誘發(fā)合并感染。因此，臨床多采用聯(lián)合用藥的原則，大環(huán)內(nèi)酯類的克拉霉素、阿奇霉素和氨基糖苷類的阿米卡星，以及利福霉素類衍生物的利福布丁，外加一線抗結(jié)核藥物的乙胺丁醇，對NTM均具有良好的抗菌活性，是首選的藥物治療方案[11-12]。目前傳統(tǒng)的檢測快速生長分枝桿菌的藥物敏感性的方法多采用絕對濃度法、比例法、微量稀釋MIC法,均需較長的時間。本實驗室由于條件有限，只能采用紙片K-B法進行體外藥敏試驗檢測，抑菌環(huán)直徑30 mm以上從大到小依次為：克拉霉素、阿米卡星、頭孢克羅、頭孢噻肟、氨芐西林、哌拉西林、阿莫西林﹣克拉維酸、亞胺培南、奈替米星、阿奇霉素。臨床可參考具體藥敏結(jié)果選擇使用，以便制定合理化的治療方案，提高抗菌藥物使用的合理性，有利于降低不良反應的發(fā)生率。

本研究表明，單純應用16 s RNA基因測序同樣不能將NTM鑒定到種，而將16 s RNA基因和rpoB基因聯(lián)合應用，能夠在2～4 d內(nèi)將NTM菌株鑒定到種，再結(jié)合抗菌藥物敏感試驗，能夠為臨床醫(yī)生提供有效的診斷依據(jù)。因此快速的菌種鑒定和藥敏試驗結(jié)果對感染NTM患者的準確診斷、制定有效治療方案、控制院內(nèi)感染等均具有非常重要的意義。

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◇藥物與臨床◇

Biological characteristics of mucus producing mycobacterium and

fast susceptibility testing

LIU Mei-qing1,LAN Ying2, CAI Man2, et al

(1.BeijingAnzhenHospitalofCapitalMedicalUniversity,Beijing100029，China;

2.InstituteofMicrobiologyChineseAcademyofSciences,Beijing100101,China)

Abstract:Objective To explore the biological characteristics of mucus producing mycobacterium and carry out strain identification as well as susceptibility analysis to provide a scientific basis for accurate clinical diagnosis and treatment. Methods Suspected strains, isolated from the blood aerobic culture flasks of patients, were screened by the growth time, rapid Gram stain and Ziehl - Nigeria 's acid-fast staining. The strains were detected on 16S rRNA gene and rpoB gene sequence analysis and the corresponding rapid drug susceptibility testing.ResultsSuspected strains were identified as mucus producing mycobacterium of non-tuberculous mycobacteria, a rapidly growing mycobacteria class. KB vitro susceptibility testing showed that drugs with zone diameters above 30mm in descending order were clarithromycin, amikacin, cefaclor, cefotaxime, ampicillin, piperacillin, amoxicillin/clavulanic acid, imipenem, netilmicin, and azithromycin. ConclusionsMucus producing mycobacterium is pathogenic and can cause bacteremia. To prevent nosocomial infection, we should remove urethral catheter as early as possible according to the patient's own condition and use rational drug based on susceptibility results.

Key words:non-tuberculous mycobacteria；mucus producing mycobacterium；16S rRNA； strain identification；rpoB

收稿日期：(2015-07-06，修回日期：2015-11-06)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.01.053