劉文蘋，張振凌，吳小菲

(1.亳州市食品藥品檢驗(yàn)所中藥室，安徽 亳州　236800；

2.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州　450008；

3.亳州中藥科技學(xué)校藥學(xué)部 安徽 亳州　236800)

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RP-HPLC法測(cè)定男寶膠囊中金絲桃苷的含量

劉文蘋1，張振凌2，吳小菲3

(1.亳州市食品藥品檢驗(yàn)所中藥室，安徽 亳州236800；

2.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州450008；

3.亳州中藥科技學(xué)校藥學(xué)部 安徽 亳州236800)

摘要：目的建立用高效液相色譜法測(cè)定男寶膠囊中金絲桃苷含量的方法。方法采用C18反相色譜柱，流動(dòng)相為乙腈-0.085%磷酸(17∶83)，檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm，流速為1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果金絲桃苷在2.15～21.5 mg·L-1范圍內(nèi)線性良好，回歸方程Y=9 203X-2 501.5,r=0.999 2(n=6)。平均回收率為97.9%，RSD為1.0 %(n=7)。結(jié)論該法簡(jiǎn)捷，準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，穩(wěn)定性高，可用于男寶膠囊中測(cè)定金絲桃苷的含量測(cè)定。

關(guān)鍵詞：男寶膠囊；菟絲子；金絲桃苷；高效液相色譜法；含量測(cè)定

中藥男寶膠囊是由鹿茸、肉桂、淫羊藿、海馬、枸杞子、菟絲子、牡丹皮、狗腎、驢腎、人參、當(dāng)歸等31味藥組成的中藥成方制劑，功效補(bǔ)腎壯陽(yáng)，用于腎陽(yáng)不足引起的陽(yáng)痿滑泄、性欲淡漠、腎囊濕冷、腰腿酸痛、食欲不振、精神萎靡等癥。治療效果顯著，且副作用小，使用方便，深得消費(fèi)者的認(rèn)可，需求量較大。市場(chǎng)有62 家醫(yī)藥企業(yè)生產(chǎn)男寶膠囊。中藥男寶膠囊標(biāo)準(zhǔn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑》第十九冊(cè)[1]中，標(biāo)準(zhǔn)中除性狀及膠囊劑的常規(guī)檢查外，僅有當(dāng)歸的薄層色譜鑒別,沒(méi)有對(duì)君藥及貴重藥材做出定性和定量的鑒別和檢查，不能較好的控制質(zhì)量。 本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)資料考察了不同處理方法及不同流動(dòng)相，建立了高效液相色譜測(cè)定金絲桃苷含量的方法[2-4]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本方法簡(jiǎn)便可行，重現(xiàn)性好，可用于男寶膠囊的質(zhì)量控制。

1儀器、試劑與試藥

1.1儀器美國(guó)Waters 高效液相色譜儀,Waters e2695自動(dòng)進(jìn)樣器，Waters e2695柱溫箱，Waters 2489檢測(cè)器；大連依利特ODS色譜柱2.5 μm(4.6 mm×250 mm)；上海吉理超聲儀器有限公司生產(chǎn)超聲清洗器(型號(hào)：JL360DT)；沈陽(yáng)龍騰電子稱量責(zé)任有限公司生產(chǎn)萬(wàn)分之一分析天平(型號(hào)：ES-180J)；瑞士梅特勒-托利多生產(chǎn)十萬(wàn)分之一分析天平(AB135-S)。

1.2試劑與試藥金絲桃苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111521-201004)；甲醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，色譜純，批號(hào)：20130906)；乙腈(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，色譜純，批號(hào)：20130808)；醋酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純、批號(hào)：T20130916)；磷酸(天津市富宇精細(xì)化工有限公司，分析純，批號(hào)：130761)；重蒸水(哇哈哈純凈水，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司，批號(hào)：1118BL)； 男寶膠囊:由亳州市食品藥品檢驗(yàn)所提供，吉林濟(jì)邦藥業(yè)有限公司生產(chǎn)， 批號(hào)：20130402、20130309和20140106。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇精密量取對(duì)照品溶液10 mL，置100 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾后，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，在200～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，結(jié)果顯示，金絲桃苷在360 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，故將360 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)[5]。

2.2色譜條件Hypersil ODS 2.5 μm(4.6 mm×250 mm)C18柱；乙腈-0.085 %磷酸(17∶83)為流動(dòng)相；檢測(cè)器波長(zhǎng)為360 nm；柱溫25℃；流速1.0 mL·min-1。本實(shí)驗(yàn)理論板數(shù)約為10 000，因?yàn)榻鸾z桃苷與附近色譜峰分離度大于1.5，且參考藥典中菟絲子的含量測(cè)定，故將理論板數(shù)定為5 000。

2.3對(duì)照品溶液的制備精密稱取金絲桃苷對(duì)照品10.75 mg,置250 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.4供試品溶液的制備取本品10粒，除去囊殼，研細(xì)，取約1 g,精密稱定，分別置具塞錐形瓶和圓底燒瓶中，分別精密加入甲醇溶液50 mL，稱定質(zhì)量，密塞，超聲處理提取和水浴回流提取各1 h[6-7],放冷，再稱定質(zhì)量，補(bǔ)重，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。比較峰面積積分值，確定超聲處理1 h的提取方法。

2.5陰性對(duì)照溶液的制備制成缺菟絲子的陰性對(duì)照樣品，按照供試品溶液的制備方法，制成陰性對(duì)照溶液。

按上述色譜條件測(cè)定，精密量取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各10 μL，分別進(jìn)入高效液相色譜儀中。供試品色譜中，在與對(duì)照品主峰相應(yīng)的保留時(shí)間范圍內(nèi)，有一相同的色譜峰，定為金絲桃苷峰，且與其他組分峰可達(dá)到基線分離，分離度大于1.5，而在此保留時(shí)間陰性對(duì)照溶液無(wú)干擾。見(jiàn)圖1。

A對(duì)照品溶液B供試品溶液C陰性對(duì)照溶液

圖1金絲桃苷HPLC色譜譜

2.6線性關(guān)系考察依次精密量取對(duì)照品溶液0.5、1、2、3、4、5 mL,分別置于10 mL量瓶中，再加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按上述色譜條件，分別精密吸取10 μL進(jìn)樣，以對(duì)照品進(jìn)樣量為X(mg·L-1)，峰面積為Y，做線性回歸。得線性回歸方程為：Y=19 203X-2 501.5,r=0.999 2(n=6)。結(jié)果表明，金絲桃苷對(duì)照品進(jìn)樣量在2.15～21.5 mg·L-1范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好。

2.7精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取“2.3”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，按以上色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積，結(jié)果RSD=0.6 %(n=5)。

2.8重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)稱取同一批號(hào)(批號(hào)：20130402)樣品6份，按“2.4”項(xiàng)下的方法制備，測(cè)定峰面積并計(jì)算金絲桃苷，結(jié)果金絲桃苷的平均含量為263.2 μg·g-1，RSD=1.2 %(n=6)。

2.9穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取同一樣品溶液，按以上色譜條件，在0、2、4、6、8、10 、12 h分別進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，共測(cè)7次，結(jié)果峰面積RSD值為0.5%，顯示供試品溶液至少在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10回收率實(shí)驗(yàn)精密稱取已知含量的樣品7份，每份0.5 g，分別精密加入適量對(duì)照品,同“2.4”項(xiàng)下的制備方法制備，按照上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得峰面積并計(jì)算含量，結(jié)果顯示平均回收率為97.9%，RSD=1.0%(n=7)。見(jiàn)表1。

表1　回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.11樣品測(cè)定按正文方法測(cè)定3批樣品，按2.4項(xiàng)下的方法制備，測(cè)定峰面積并計(jì)算含量，結(jié)果穩(wěn)定。見(jiàn)表2。

表2　樣品含量測(cè)定結(jié)果(μg/粒)

3討論

金絲桃苷可溶于乙醇、丙酮、甲醇等溶劑，丙酮毒性較強(qiáng)暫且舍去，采用甲醇與乙醇超聲1 h進(jìn)行比較，結(jié)果表明甲醇超聲提取效果較好；再考察回流提取與超聲提取的效果，結(jié)果表明，樣品用甲醇超聲提取1 h效果較好，金絲桃苷比較能提取完全，且方法簡(jiǎn)便，以乙腈-0.1 %磷酸(17∶83)、乙腈-0.085 %磷酸(17∶83)、乙腈-0.2 %冰醋酸(15∶85)、乙腈-1 %冰醋酸(14∶86)進(jìn)行流動(dòng)相色譜考察；其中以乙腈-0.2 %冰醋酸(15∶85)、乙腈-1 %冰醋酸(14∶86)為流動(dòng)相檢測(cè)出的色譜峰分離度較差；以乙腈-0.1 %磷酸(17∶83)為流動(dòng)相檢測(cè)出色譜峰峰面積較低，不利于計(jì)算；乙腈-0.085 %磷酸(17∶83)為流動(dòng)相，配合25℃柱溫，金絲桃苷色譜峰與其他組分達(dá)到了較好的基線分離，故選定乙腈-0.085 %磷酸(17∶83)為最佳的流動(dòng)相。

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.01.016

通信作者：張振凌，女，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：中藥飲片及新藥研究，E-mail:627428305@qq.com