許朝龍，鄔善敏，苗志釗，趙凱亮，陳　飛，范迪歡

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院肝膽腔鏡外科，湖北 武漢　430060)

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白藜蘆醇對(duì)膽道梗阻再通大鼠肝功能的保護(hù)作用

許朝龍，鄔善敏，苗志釗，趙凱亮，陳飛，范迪歡

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院肝膽腔鏡外科，湖北 武漢430060)

摘要：目的研究白藜蘆醇(Res)對(duì)膽道梗阻再通大鼠肝損害的保護(hù)作用及機(jī)制。方法雄性Wistar大鼠60只，隨機(jī)分為4組，即A組:假手術(shù)組，B組：梗阻性黃疸模型組，C組：梗阻性黃疸模型+膽道再通組，D組:梗阻性黃疸+膽道再通 +Res干預(yù)組。連續(xù)給藥7 d,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后檢測(cè)各組大鼠血清中總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平；RT-PCR檢測(cè)肝組織沉默信息調(diào)控因子1(SIRT1)mRNA的表達(dá)，Western blot檢測(cè)肝組織SIRT1蛋白和核因子-κB(NF-κB)蛋白表達(dá)，免疫組化檢測(cè)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)蛋白在肝臟中的表達(dá)，原位末端標(biāo)記(TUNEL)法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡。結(jié)果與假手術(shù)組比較，模型組血清ALT水平升高，SIRT1 mRNA及蛋白、PPARα蛋白表達(dá)降低，NF-κB蛋白表達(dá)升高，細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)；而造模后膽道再通組與模型組比較，血清ALT水平降低，SIRT1 mRNA及蛋白、PPARα蛋白表達(dá)增加，NF-κBp蛋白表達(dá)降低，細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)；白藜蘆醇組與C組比較：血清ALT水平降低，SIRT1 mRNA及蛋白、PPARα蛋白表達(dá)增加，NF-κBp蛋白表達(dá)降低，細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)。結(jié)論Res可能通過(guò)激活SIRT1抑制NF-κB，發(fā)揮抗炎、抗凋亡作用，通過(guò)促進(jìn)PPARα的表達(dá)發(fā)揮抗氧化作用，從而減輕膽道梗阻再通大鼠的肝損害，促進(jìn)肝功能恢復(fù)。

關(guān)鍵詞：白藜蘆醇；梗阻性黃疸；再通；沉默信息調(diào)控因子；過(guò)氧化物酶體增殖物劑激活受體α；核因子-κB

白藜蘆醇是廣泛存在于多種植物中的一種多酚類(lèi)化合物，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗心腦血管疾病、抗糖尿病等多種生物活性[1-2]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇對(duì)化學(xué)性肝損傷、酒精性肝損傷具有保護(hù)作用[3-4]，但其對(duì)膽道梗阻再通大鼠肝損傷的保護(hù)作用報(bào)道尚少。本研究旨在通過(guò)白藜蘆醇干預(yù)膽道梗阻再通大鼠，通過(guò)檢測(cè)SIRT1、PPARα、NF-κB等蛋白的表達(dá)，探究白藜蘆醇對(duì)膽道梗阻再通大鼠肝損害的保護(hù)作用及機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料Res購(gòu)自阿拉丁公司，純度≥99%；兔抗大鼠SIRT1抗體購(gòu)于santa cruz公司，兔抗大鼠NF-κB抗體、免疫組織化學(xué)染色用PPARα抗體購(gòu)于abcam公司，DAB顯色試劑盒(黃)及二抗均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于Roche Applied Science；總RNA提取試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司，cDNA第一鏈合成試劑盒購(gòu)自Fermentas公司，引物由金斯瑞科技有限公司合成，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀ABI 7900。

1.2動(dòng)物分組及模型建立、標(biāo)本取材健康雄性Wistar大鼠60只，體質(zhì)量220～250 g，由湖北省疾控中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(鄂)2003-0005，隨機(jī)分為4組，每組15只：A組(假手術(shù)組)、B組(梗阻性黃疸組1周組)、C組(梗阻性黃疸1周，膽道再通1周+生理鹽水組)、D組(梗阻性黃疸1周，膽道再通1周+Res組)；模型建立：大鼠麻醉后，取上腹部正中縱行切口，A組：暴露膽總管但不結(jié)扎不橫斷，關(guān)腹，B、C、D組分別暴露膽總管，以4到0號(hào)絲線雙重結(jié)扎，于兩結(jié)扎絲線間離斷，確定無(wú)膽瘺后關(guān)腹，C、D組分別于膽總管結(jié)扎1周后取原切口入腹，顯露膽總管，穿刺抽吸出膽汁，取長(zhǎng)約1 cm細(xì)硅膠管于膽總管和距離幽門(mén)2 cm處的十二指腸處分別做荷包縫合、固定，確定無(wú)膽瘺后關(guān)腹，制成梗阻性黃疸膽道再通模型，D組于再通術(shù)后12 h開(kāi)始每天10 mg·kg-1·d-1Res腹腔注射，C組予以等量生理鹽水腹腔注射；建模后第7天取血后處死，取部分肝組織經(jīng)4%多聚甲醛固定，其余肝組織凍存，進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

1.3肝功能檢測(cè)及病理學(xué)觀察各組小鼠血液標(biāo)本靜置、離心后收集血清，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)ALT、TBIL、DBIL,肝組織石蠟切片蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察肝臟形態(tài)學(xué)變化。

1.4 RT-PCR檢測(cè)肝組織SIRT1 mRNA表達(dá)取肝組織100 mg，用Trizol試劑提取mRNA，按照cDNA合成試劑盒說(shuō)明，以所提取的mRNA為模板合成cDNA，進(jìn)行PCR循環(huán)。以3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參照，上游引物：5‘-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3’，下游引物：5‘-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3’，大小為252 bp；SIRT1上游引物：5‘-GGCCTCAAAGTACCTGGGAT-3’，下游引物：5‘-AGTCACTAGAGCTTGCGTGT-3’，大小約180 bp。反應(yīng)條件：第一個(gè)循環(huán)50°C 2 min，95°C 10 min，然后40個(gè)循環(huán)95°C 30 s，60°C 30 s，作擴(kuò)增曲線觀察各樣本擴(kuò)增效率是否一致，于擴(kuò)增后作熔解曲線以檢測(cè)產(chǎn)物的均一性；mRNA含量用相對(duì)值法即2-△△Ct進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.5Western blot檢測(cè)肝組織SIRT1蛋白、NF-κB蛋白的表達(dá)取各組肝組織，加入預(yù)冷的組織裂解液(RIPA)勻漿組織，置冰上裂解20 min，12 000 r·min-1離心10 min，取上清液測(cè)蛋白濃度后，各樣品取50 μg總蛋白上樣電泳，根據(jù)蛋白分子量配制10%的PAGE膠電泳，根據(jù)預(yù)染Marker顯示，判斷目的蛋白得到充分分離后，停止電泳。取出凝膠根據(jù)Marker切下目的條帶，轉(zhuǎn)至經(jīng)甲醇處理的聚偏氟乙烯(PVDF)膜，轉(zhuǎn)膜條件為：SIRT1先200 mA 120 min，后300 mA 50 min；NF-κB 200 mA 120 min。用含5%脫脂奶粉的封閉液(TBST)浸泡PVDF膜，室溫?fù)u床封閉2 h。用封閉液稀釋相應(yīng)的一抗(SIRTl 1∶300稀釋?zhuān)琋F-κB 1∶400稀釋)，使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4℃孵育過(guò)夜。TBST充分洗滌PVDF膜5～6次，每次5 min。用封閉液稀釋相應(yīng)的HRP標(biāo)記二抗1∶50 000稀釋?zhuān)筆VDF膜浸泡于二抗孵育液中，室溫?fù)u床孵育2 h。用TBST充分洗滌PVDF膜5～6次，每次5 min。每張膜滴加適量增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)底物液，孵育數(shù)分鐘，行顯影、定影處理，圖像分析蛋白條帶。

1.6免疫組化檢測(cè)肝組織PPARα蛋白表達(dá)肝組織石蠟切片脫蠟、抗原修復(fù)，加一抗4℃濕盒中孵育過(guò)夜，滴加聚合物輔助劑，37℃孵育20 min，滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗IgG多聚體，37℃孵育30 min，滴加DAB液顯色，依次進(jìn)行復(fù)染、脫水、封片，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，在顯微成像系統(tǒng)400倍下攝片，所有照片均用Image Pro Plus圖像處理軟件分析測(cè)定累積光密度及面積，計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)的平均光密度。

1.7TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡肝組織石蠟切片脫蠟，滴加蛋白酶K工作液常溫反應(yīng)20 min,PBS洗滌后加50 μL TUNEL反應(yīng)混合液(陰性對(duì)照組僅加50 μL熒光素標(biāo)記溶液)，37℃避光孵育60 min,PBS洗滌3次，每次5 min，加50 μL converter-POD于標(biāo)本上，37℃避光孵育30 min。PBS洗滌,4次,每次5 min，滴加DAB液顯色5～10 min,用自來(lái)水沖洗后，蘇木素復(fù)染，脫水透明，封片。以細(xì)胞呈棕褐色為陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)，計(jì)算凋亡指數(shù)(凋亡指數(shù)=凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%)。

2結(jié)果

2.1各組大鼠血清TBIL、DBIL、ALT檢測(cè)結(jié)果B組的TBIL、DBIL、ALT水平明顯高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),C、D組的TBIL、DBIL、ALT水平低于B組(P<0.05)，D組的ALT水平低于C組(P<0.05),C、D組的TBIL、DBIL水平差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表1。

組別TBIL/μmol·L-1DBIL/μmol·L-1ALT/U·L-1A5.07±0.812.86±0.4639.47±5.23B166.32±10.41a113.27±9.85a209.53±12.14aC6.11±1.48b3.36±0.72b76.42±9.05bD5.81±1.03bd3.04±0.57bd53.75±8.26bc

注：與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05；與C組比較，cP<0.05、dP>0.05。

2.2各組大鼠肝臟SIRT1 mRNA表達(dá)水平B組SIRT1 mRNA水平低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，C組SIRT1 mRNA水平高于B組(P<0.05)，D組SIRT1 mRNA水平高于C組(P<0.05)，見(jiàn)圖1、2。

圖1　各組大鼠肝臟SIRT1 mRNA的RT-PCR擴(kuò)增

圖2　各組肝臟SIRT1 mRNA RT-PCR半定量

注：與A組比較，*P<0.05，與B組比較，#P<0.05,與C組比較，△P<0.05。

2.3各組大鼠肝臟SIRT1蛋白、NF-κB蛋白表達(dá)水平B組與A組比較，SIRT1蛋白水平降低，NF-κB蛋白水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；C組與B組比較，SIRT1蛋白水平升高，NF-κB蛋白水平降低(P<0.05)；D組與C組比較，SIRT1蛋白水平升高，NF-κB蛋白水平降低(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

注：與A組比較，*P<0.05，與B組比較，#P<0.05,與C組比較，△P<0.05。

2.4各組大鼠肝臟PPARα蛋白表達(dá)A組細(xì)胞核染色呈明顯棕黃色，PPARα蛋白表達(dá)呈陽(yáng)性，B組細(xì)胞核染色較A組明顯減弱，C組細(xì)胞核染色較B組增強(qiáng)，D組細(xì)胞核染色較C組增強(qiáng)(如圖4)。A、B、C、D組PPARα蛋白表達(dá)半定量結(jié)果如圖5。

圖4　各組大鼠肝臟PPARα蛋白表達(dá)的

圖5　各組大鼠肝臟PPARα蛋白表達(dá)半定量結(jié)果　　圖6 各組大鼠肝細(xì)胞凋亡率

注：與A組比較，*P<0.05，與B組比較，#P<0.05,與C組比較，△P<0.05。

圖7　各組大鼠肝組織TUNEL染色結(jié)果(×400)

2.5各組肝細(xì)胞凋亡率B組肝細(xì)胞凋亡率較A組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，C組肝細(xì)胞凋亡率較B組降低(P<0.05)，D組肝細(xì)胞凋亡率較C組降低(P<0.05)，如圖6、7。

2.6SIRT1蛋白與NF-κB蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性分析SIRT1蛋白表達(dá)水平與NF-κB蛋白表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.86、P<0.01)。

3討論

梗阻性黃疸(obstructive jaundice)是臨床常見(jiàn)疾病，可導(dǎo)致機(jī)體各器官系統(tǒng)損害及相應(yīng)的病理生理改變，其中最主要為肝臟損傷。梗阻性黃疸肝臟損傷的機(jī)制主要為脂質(zhì)過(guò)氧化損傷、腸源性內(nèi)毒性血癥、肝臟血流動(dòng)力學(xué)紊亂和各種炎癥因子介導(dǎo)的損傷[5-6]。

SIRT1是一種依賴NAD+的組蛋白去乙酰化酶，參與機(jī)體許多生理功能的調(diào)節(jié)，具有促進(jìn)線粒體能量代謝、維持糖脂代謝平衡、改善心血管功能、抗腫瘤、抗衰老等作用[7]。而白藜蘆醇是最廣泛使用的SIRT1激活劑[8]。NF-κB是一類(lèi)具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能的核蛋白因子，能調(diào)節(jié)多種靶基因的表達(dá)，與炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、細(xì)胞凋亡等病理生理過(guò)程密切相關(guān)[9]。抑制NF-κB的表達(dá)可降低炎性因子IL-1、TNF-α的水平[10]。研究表明[11]，SIRT1可使NF-κB去乙?；?，進(jìn)而抑制NF-κB活性，發(fā)揮抗炎作用。本研究發(fā)現(xiàn)，膽道梗阻后(B組)SIRT1 mRNA及蛋白表達(dá)下降、NF-κB表達(dá)增加、肝細(xì)胞凋亡增加，膽道再通后(C組)SIRT1 mRNA及蛋白表達(dá)升高、NF-κB表達(dá)降低、肝細(xì)胞凋亡降低，膽道再通同時(shí)予以白藜蘆醇干預(yù)后(D組)SIRT1 mRNA及蛋白表達(dá)進(jìn)一步升高、NF-κB表達(dá)進(jìn)一步降低、肝細(xì)胞凋亡進(jìn)一步降低。對(duì)SIRT1蛋白與NF-κB蛋白的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，兩者之間存在明顯的負(fù)相關(guān)。說(shuō)明白藜蘆醇能通過(guò)激活SIRT1表達(dá)，抑制NF-κB表達(dá)，減輕膽道梗阻再通大鼠的肝細(xì)胞損害，減少細(xì)胞凋亡。

過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)是配體激活的的轉(zhuǎn)錄因子核受體超家族成員之一，有多種生物學(xué)作用，如參與糖類(lèi)和脂質(zhì)的代謝，提高胰島素的敏感性，抑制炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化等[12]。它存在3種亞型：PPARα、PPARβ/δ、PPARγ，其中PPARα主要分布于脂肪酸氧化活躍的組織，如肝、腎和心肌等。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇能增強(qiáng)PPARα表達(dá)[13]，PPARα被激活后，與過(guò)氧化物酶體增殖物反應(yīng)元件(PPREs)結(jié)合，能增強(qiáng)多個(gè)抗氧化基因如過(guò)氧化氫酶(CAT)、銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)的表達(dá)，從而減輕氧化損傷[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，膽道梗阻后(B組)PPARα蛋白表達(dá)下降、ALT水平升高，膽道再通后(C組)PPARα蛋白表達(dá)升高、ALT水平降低，膽道再通同時(shí)予以白藜蘆醇干預(yù)后(D組)PPARα蛋白表達(dá)進(jìn)一步升高、ALT水平進(jìn)一步降低。說(shuō)明白藜蘆醇能激活PPARα表達(dá)，減輕膽道再通大鼠肝臟氧化損傷，保護(hù)肝功能。

綜上所述，白藜蘆醇可能通過(guò)激活SIRT1抑制NF-κB，發(fā)揮抗炎、抗凋亡作用，通過(guò)促進(jìn)PPARα的表達(dá)發(fā)揮抗氧化作用，從而減輕膽道梗阻再通大鼠的肝臟損害，促進(jìn)肝功能恢復(fù)。

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Protective effect of resveratrol on liver injury in rats after

recanalization of biliary obstruction

XU Chao-long,WU Shan-min,MIAO Zhi-zhao,et al

(DepartmentofHepatobiliarySurgery,RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan，Hubei430060,China)

Abstract：ObjectiveTo explore the protective effect of resveratrol (Res) on liver injury in rats after recanalization of biliary obstruction. Methods Sixty healthy male Wistar rats were randomized into four groups: sham group (group A), obstructive jaundice one week group (group B), obstructive jaundice one week and recanalization one week+NS group (group C), obstructive jaundice one week and recanalization one week+Res group (group D). The levels of total bilirubin(TBIL),direct bilirubin(DBIL) and serum alanine aminotransferase(ALT) were measured. Real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) was performed to determine the mRNA expression of silent information regulator 1(SIRT1). The expression of the SIRT1 and nuclear factor-κB (NF-κB) proteins were detected by Western blot. Immunocytochemical assay was performed to examine peroxisome proliferator activated receptor-alpha (PPARα) protein. Hepatocellular apoptosis was examined by terminal deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling (TUNEL) method. Results Compared with group A, in group B the level of ALT was higher, the expressions of SIRT1 mRNA and protein and the PPARα protein were lower, and the NF-κB protein and the rate of hepatocellular apoptosis were higher(P<0.05). Compared with group B, in group C the level of ALT was lower, the expression of SIRT1 mRNA and protein and the PPARα protein were higher, and the NF-κB protein and the rate of hepatocellular apoptosis were lower(P<0.05). Compared with group C, in group D the level of ALT was lower, the expressions of SIRT1 mRNA and protein and the PPARα protein were higher, and the NF-κB protein and the rate of hepatocellular apoptosis were lower(P<0.05).Conclusion The Res could resist inflammation and apoptosis by activating the SIRT1 which probably inhibits the expression of NF-κB protein, and palys an antioxidant role by promoting the expression of PPARα in rats after recanalization of biliary obstruction, so that it could alleviate liver damage.

Key words：resveratrol;obstructive jaundice;recanalization;SIRT1;PPARα;NF-κB

收稿日期：(2015-09-09，修回日期：2015-10-23)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.01.008

通信作者：鄔善敏，男，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：肝膽外科基礎(chǔ)與臨床，E-mail：15327278328@163.com