高雄梅， 徐國(guó)輝， 王賀新， 侯義龍

(1.大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 遼寧 大連 116622； 2.大連大學(xué) 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究院， 遼寧 大連 116622)

基于EST-SSR標(biāo)記的藍(lán)莓品種指紋圖譜構(gòu)建及遺傳多樣性

高雄梅1， 徐國(guó)輝2*， 王賀新2， 侯義龍1

(1.大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 遼寧 大連 116622； 2.大連大學(xué) 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究院， 遼寧 大連 116622)

為給藍(lán)莓品種鑒別、優(yōu)良雜交組合選配提供分子水平依據(jù)，從40對(duì)EST-SSR引物中篩選多態(tài)性良好的引物組合，選取其中引物CA231構(gòu)建北高叢藍(lán)莓栽培種的DNA指紋圖譜、數(shù)字指紋圖譜，利用非加權(quán)類平均法進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)果表明：10個(gè)引物對(duì)組合共擴(kuò)增出206個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)203個(gè)，占98.12%。每條引物的多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)為9～48個(gè)，平均每條引物擴(kuò)增出20.6個(gè)位點(diǎn)，平均多態(tài)性位點(diǎn)為20.3個(gè)。引物CA231擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)最多，多態(tài)性比率為100%，且可以鑒別所有試驗(yàn)材料。構(gòu)建30個(gè)北高叢藍(lán)莓栽培品種的指紋圖譜，并對(duì)其親緣關(guān)系分析表明，在遺傳相似系數(shù)為0.52時(shí)，30個(gè)品種聚為一類，當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.63時(shí)，77.7%的品種仍聚為一類。

藍(lán)莓； EST-SSR； 指紋圖譜； 遺傳多樣性

藍(lán)莓是杜鵑花科越桔屬植物，原產(chǎn)北美，是一種具有極高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的新興世界性小漿果樹(shù)種，適生于疏松的酸性土壤中[1]。藍(lán)莓果實(shí)酸甜，風(fēng)味獨(dú)特，富含花青素、黃酮醇、原花青素及其他多種酚類復(fù)合物，可以改善泌尿系統(tǒng)，防止尿路感染；軟化毛細(xì)血管，消除眼睛疲勞；增強(qiáng)心臟功能；提高抗癌能力[2-3]。由于其獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值，使得消費(fèi)者需求量不斷增加，種植面積也在持續(xù)增長(zhǎng)。

近年來(lái)，我國(guó)藍(lán)莓種植面積及其產(chǎn)量持續(xù)增長(zhǎng)，已成為亞洲地區(qū)藍(lán)莓生產(chǎn)的主導(dǎo)國(guó)。但國(guó)內(nèi)所有的藍(lán)莓生產(chǎn)企業(yè)均依賴于美國(guó)、日本等國(guó)家引進(jìn)品種。在引種過(guò)程中，可能是由于人為或其他因素等造成品種間的混亂，單從外部形態(tài)特征上很難準(zhǔn)確地將其區(qū)分開(kāi)，使得藍(lán)莓種苗市場(chǎng)上出現(xiàn)同物異名或者同名異物的現(xiàn)象，給雜交育種及苗木生產(chǎn)帶來(lái)阻滯。為了識(shí)別假冒偽劣品種，減少種植者的損失，保護(hù)育種者的權(quán)益，必須用有效的方法檢測(cè)藍(lán)莓種質(zhì)資源的真實(shí)性，保護(hù)藍(lán)莓育種者的知識(shí)產(chǎn)權(quán)。目前，藍(lán)莓品種間的區(qū)分工作主要通過(guò)形態(tài)特征觀察和DNA分子標(biāo)記鑒別2種方法進(jìn)行。但前者具有易受環(huán)境影響、耗時(shí)和主觀性強(qiáng)的缺點(diǎn)，而考察結(jié)果與實(shí)際表現(xiàn)間往往存在比較大的差異。DNA分子標(biāo)記則不受環(huán)境條件的影響，非常適合進(jìn)行此類研究。EST-SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)較簡(jiǎn)單、快捷、低成本[4]，可鑒定基因組中的變異性，同時(shí)，基因組圖譜的建立可以加快后續(xù)基因功能的快速鑒定，提高標(biāo)記輔助篩選的效率[5]。與其他標(biāo)記相比，EST-SSR更容易獲得基因表達(dá)信息，在相關(guān)物種間轉(zhuǎn)移效率更高，更經(jīng)濟(jì)[6]。近年來(lái)，EST-SSR分子標(biāo)記得到廣泛應(yīng)用。

Rowland等[7]為區(qū)分控制藍(lán)莓種間二倍體雜交的抗寒與需冷量相關(guān)基因的數(shù)量性狀基因座(quantitative trait locus, QTL)，用EST-SSR、SNP和RAPD等分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建其遺傳連鎖圖譜；Yang等[8]設(shè)計(jì)136對(duì)EST-SSR引物，并用其中36對(duì)引物對(duì)已登記在冊(cè)的150個(gè)藍(lán)莓品種進(jìn)行遺傳多樣性、種群結(jié)構(gòu)及親緣多樣性進(jìn)行分析；Samir等[9]用12對(duì)EST-SSR引物序列分析36份野生藍(lán)莓和栽培種的遺傳多樣性及遺傳關(guān)系。但迄今為止，北高叢藍(lán)莓作為栽培種和育種種質(zhì)中的重要一類，卻無(wú)有關(guān)北高叢藍(lán)莓種內(nèi)遺傳多樣性和遺傳關(guān)系的報(bào)道。因此，筆者采用EST-SSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)30份北高從藍(lán)莓種質(zhì)進(jìn)行親緣關(guān)系和遺傳多樣性分析，并構(gòu)建指紋圖譜，旨在從分子水平上揭示北高叢藍(lán)莓種質(zhì)間的親緣關(guān)系及遺傳多樣性特征，為今后藍(lán)莓種質(zhì)資源的收集、引種和鑒定、雜交育種中親本的選配、分子標(biāo)記輔助育種等方面提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料由大連森茂現(xiàn)代農(nóng)業(yè)有限公司提供，各品種遺傳背景見(jiàn)表1。

表1 供試藍(lán)莓品種的遺傳背景及來(lái)源

1.2 植物基因組DNA 的提取

用 TIANGEN新型植物基因組DNA試劑盒提取基因組DNA。用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量，將DNA置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 EST-SSR 的PCR 擴(kuò)增

試驗(yàn)使用的40對(duì)引物參照Boches[10]等設(shè)計(jì)，由寶生物工程(大連)有限公司合成。隨機(jī)選取5個(gè)樣品，分別對(duì)40對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，篩選多態(tài)性較好的引物用于下一步試驗(yàn)。

EST-SSR反應(yīng)體系的10×buffer、dNTPs、TaqDNA酶均購(gòu)自寶生物科技有限公司。EST-SSR的反應(yīng)體系為 10×buffer (Mg2+Plus) 2 μL、dNTPs 1.6 μL、正反向引物(10 μmol/L)各1 μL、TaqDNA聚合酶0.2 μL，模板100 ng，最后添加滅菌超純水至20 μL。

EST-SSR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性10 min；94變性40 s，52℃退火70 s，72℃延伸120 s，40個(gè)循環(huán)；72℃后延伸10 min；4℃保存。擴(kuò)增在S1000伯樂(lè)梯度PCR儀上進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物用8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳3 h，最終銀染檢測(cè)，拍照、分析。

按上述方法對(duì)全部材料進(jìn)行EST-SSR PCR擴(kuò)增，2次重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

選擇重復(fù)性好且清晰的條帶進(jìn)行記錄，在相同位置有帶記為1，無(wú)帶記為0，構(gòu)建0、1矩陣，選用l00～2000 bp易于識(shí)別的條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。采用NTSYSpc 2.0e軟件按類平均法(UPGMA)構(gòu)建親緣關(guān)系聚類圖，對(duì)不同品種間的遺傳多樣性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)莓的DNA 檢測(cè)

采用試劑盒法提取得到供試藍(lán)莓品種的基因組DNA，經(jīng)0.8%～1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后DNA電泳條帶清晰，亮度均一，濃度適中，符合后續(xù)試驗(yàn)對(duì)DNA純度和質(zhì)量的要求。

2.2 EST-SSR 標(biāo)記的多態(tài)性

隨機(jī)選取5個(gè)供試品種對(duì)40對(duì)EST-SSR引物進(jìn)行篩選，獲得10對(duì)多態(tài)性高、穩(wěn)定性好且?guī)腿菀鬃R(shí)別的引物，各引物序列及擴(kuò)增結(jié)果(表2)。供試的30份藍(lán)莓品種共擴(kuò)增206個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)203個(gè)，占98.12%。每條引物的多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)為9～48個(gè)，平均每條引物擴(kuò)增20.6個(gè)位點(diǎn)，平均多態(tài)性位點(diǎn)為20.3。引物CA231擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)最多，為48個(gè)，且其多態(tài)性比率為100%。

表2 10對(duì)EST-PCR 引物對(duì)5個(gè)藍(lán)莓品種的擴(kuò)增情況

2.3 EST-SSR 擴(kuò)增圖譜

每對(duì)引物組合均能鑒別供試材料，但鑒別能力不同，CA23可鑒別28個(gè)品種，CA94和CA483可鑒別25個(gè)品種，CA112和CA236可鑒別15個(gè)品種，CA190可鑒別24個(gè)品種，CA227可鑒別21個(gè)品種，CA791可鑒別27個(gè)，CA1920可鑒別22個(gè)品種，而引物CA231可鑒別30個(gè)品種。引物CA231對(duì)30份藍(lán)莓品種擴(kuò)增的EST-SSR圖譜，擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為100～2000 bp(圖1)。

圖1 引物組合 CA231對(duì)1～30號(hào)藍(lán)莓栽培種的擴(kuò)增圖譜

表3 30個(gè)藍(lán)莓栽培種的DNA 數(shù)字指紋圖譜

2.4 SSR 的數(shù)字指紋圖譜

CA231在30個(gè)供試藍(lán)莓品種中的擴(kuò)增結(jié)果，在相同位置有帶記為 1，無(wú)帶記為0，構(gòu)成每個(gè)品種的數(shù)字指紋圖譜(表3)，這些數(shù)碼分別對(duì)應(yīng)相應(yīng)的SSR編碼，可以作為藍(lán)莓栽培種的分子身份證。

2.5 藍(lán)莓的聚類樹(shù)

由圖2可見(jiàn)，當(dāng)相似系數(shù)為0.63時(shí)，可將供試材料聚為4個(gè)大類，1個(gè)大聚類組B和3個(gè)較小聚類組A、C、D。A組只包含1號(hào)品種大粒藍(lán)金，來(lái)源于藍(lán)金的實(shí)生苗選育。B組包括23個(gè)品種，占供試材料的76.67%。在相似系數(shù)為0.69時(shí)，B組可被分為3個(gè)亞組，即B1、B2、B3。B1亞組有5個(gè)品種，其中9號(hào)來(lái)自澳大利亞，從藍(lán)空的自然實(shí)生苗中選育而得。B2亞組包含16個(gè)品種，在相似系數(shù)為0.77時(shí)，可進(jìn)一步分為3組。第①組包括3號(hào)(維口)、5號(hào)(公爵)、4號(hào)(藍(lán)塔)，這3個(gè)品種都與早藍(lán)有血緣關(guān)系，其中藍(lán)塔和斯巴坦都是早藍(lán)的雜交子一代；第②組有11個(gè)品種，這11個(gè)品種又根據(jù)其遺傳相似度進(jìn)行聚類，其中7號(hào)(日出)和28號(hào)(雙迪)、8號(hào)(藍(lán)片)和11(陶柔)號(hào)的關(guān)系最為緊密；第③組包括6號(hào)(斯巴坦)、14號(hào)(柏林頓)2個(gè)品種，分別來(lái)自美國(guó)北卡羅拉納州和澳大利亞維多利亞。B3亞組含2個(gè)品種，即17號(hào)和18號(hào)，分別來(lái)自美國(guó)新澤西州和澳大利亞維多利亞。C組包含5個(gè)品種，均由美國(guó)農(nóng)業(yè)部發(fā)布。D組只有13號(hào)品種，由美國(guó)農(nóng)業(yè)部發(fā)布。

圖2 30個(gè)藍(lán)莓栽培種的聚類樹(shù)

Fig.2 Dendrogram of 30 cultivated blueberry based on EST-SSR analysis

3 結(jié)論與討論

DNA分子標(biāo)記技術(shù)具有簡(jiǎn)單、快速、高效的特性，已被廣泛用于種質(zhì)資源的遺傳多態(tài)性分析[11]、作物指紋圖譜構(gòu)建[12-13]和遺傳連鎖圖譜研究[14]中。分子標(biāo)記主要包括AFLP、RFLP、RAPD、ISSR、EST-SSR、SRAP、TRAP等，其中EST-SSR標(biāo)記因其高分辨力特性及其共顯性遺傳方式已成為作物DNA指紋分析和圖譜構(gòu)建非常理想的技術(shù)。任紅曉等[15]用39對(duì)SSR引物分析了78份中國(guó)北方名優(yōu)綠豆品種的遺傳多樣性表明，內(nèi)蒙古是傳統(tǒng)名優(yōu)綠豆種質(zhì)資源最豐富的地區(qū)；薛建峰等[16]從171對(duì)SSR及EST-SSR引物中篩選10對(duì)，構(gòu)建30份國(guó)內(nèi)蓖麻品種和1份法國(guó)蓖麻品種的指紋圖譜，并進(jìn)行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析；也有研究者[17]利用25個(gè)表型性狀和33對(duì)SSR標(biāo)記對(duì)53份五節(jié)芒種質(zhì)資源的遺傳多樣性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，證明五節(jié)芒種質(zhì)具有豐富的遺傳多樣性；段艷鳳[18]利用篩選出的6對(duì)SSR引物構(gòu)建88份馬鈴薯的指紋圖譜，并進(jìn)行聚類分析結(jié)果與供試材料系譜來(lái)源有較好一致性。隨著物種間遺傳多樣性研究工作的不斷開(kāi)展，EST-SSR分子標(biāo)記得到廣泛應(yīng)用，如在菠蘿[19]、核桃[20]、柑橘[21]、葡萄[22]、杏[23]、梨[24]及蘋(píng)果[25]等物種中均有研究。近年來(lái)，在越桔屬植物中也有廣泛的應(yīng)用[26-28]。本研究利用EST-SSR標(biāo)記構(gòu)建了30個(gè)藍(lán)莓品種的2種形式的DNA指紋圖譜，即EST-SSR PCR擴(kuò)增指紋圖譜、數(shù)字指紋圖譜。擴(kuò)增指紋圖譜是分子標(biāo)記試驗(yàn)最原始、最基礎(chǔ)，也是最重要的DNA指紋圖譜，是遺傳多樣性分析、親緣關(guān)系分析、種質(zhì)資源評(píng)價(jià)鑒定、遺傳圖譜繪制及其他形式DNA指紋圖譜構(gòu)建的原始資料。DNA數(shù)字指紋圖譜是每個(gè)品種的身份證編碼，可簡(jiǎn)單有效的辨別。傅冰等[29]、李紅俠等[30]、王程等[31]、鄭珊等[32]都在不同層面上構(gòu)建了藍(lán)莓的擴(kuò)增圖譜。

本研究利用篩選出的10對(duì)穩(wěn)定性好、分辨率高的引物構(gòu)建了30個(gè)供試品種的指紋圖譜，這些引物的多態(tài)性比率為90.15%～100%，平均多態(tài)性比率為98.12%，其中只用引物CA231可以將這些材料逐一區(qū)分開(kāi)，證明了研究結(jié)果的準(zhǔn)確性，也表明本研究選用的EST-SSR標(biāo)記分辨力極高，為構(gòu)建藍(lán)莓遺傳連鎖圖譜，進(jìn)一步研究與抗寒、需冷量等性狀相關(guān)基因提供參考。同時(shí)，本研究構(gòu)建的DNA指紋圖譜也將為藍(lán)莓種植戶進(jìn)行品種真?zhèn)舞b定、保護(hù)該品種提供一定的科學(xué)依據(jù)，這將逐步改善藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)苗木市場(chǎng)混亂的現(xiàn)象。另外，本研究中有些聚類分析結(jié)果與實(shí)際親緣關(guān)系不符合，如14號(hào)卡羅琳藍(lán)和18號(hào)布里吉塔都是從Lateblue的實(shí)生苗中選育而來(lái)，被分在不同的組中，說(shuō)明來(lái)源于同樣實(shí)生苗的后代在不斷雜交過(guò)程中內(nèi)部遺傳信息可能發(fā)生改變，即內(nèi)部遺傳物質(zhì)發(fā)生了變異，這在今后的研究工作中，可通過(guò)測(cè)序手段對(duì)其差異片段進(jìn)行序列分析，根據(jù)同源性比對(duì)結(jié)果深入分析內(nèi)部遺傳物質(zhì)發(fā)生變異的情況。

本研究結(jié)果表明，北高叢藍(lán)莓品種間遺傳基礎(chǔ)狹窄，在遺傳相似系數(shù)為0.52時(shí)，30個(gè)品種聚為一類，當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.63時(shí)，77.7%的品種還聚為一類，說(shuō)明按照種植區(qū)域分類的品種間內(nèi)部遺傳物質(zhì)變異程度小，若想改變北高叢藍(lán)莓品種間的遺傳信息量，獲得新性狀的藍(lán)莓品種，則需要加強(qiáng)野生種質(zhì)資源的利用或者進(jìn)行種間雜交，以提高后代變異的幾率，該研究結(jié)果與崔建民等[27]研究結(jié)果一致。今后，筆者還將更加系統(tǒng)地開(kāi)展不同種植區(qū)域品種間遺傳多樣性的研究，如北高叢藍(lán)莓、南高叢藍(lán)莓、半高叢藍(lán)莓、兔眼藍(lán)莓以及紅豆越桔間遺傳多樣性的研究，可以在遺傳背景較遠(yuǎn)的品種間開(kāi)展雜交育種工作，利用分子標(biāo)記可以加快育種速度，同時(shí)再結(jié)合染色體倍性研究結(jié)果，快速地開(kāi)展種間雜交育種工作，為更快、更好地開(kāi)發(fā)具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的藍(lán)莓新品種提供理論依據(jù)。

[1] Rowland L J,Mehra S,Dhanaraj A L,et al. Development of EST-PCR markers for DNA fingerprinting and genetic relationship studies in blueberry(Vaccinium,section Cyanococcus)[J].Hort Sci,2003,128(5):682-690.

[2] Hou D X.Potential mechanisms of cancer chemoprevention by anthocyanins[J].Curr.Mol Med,2003,3(2):149-59.

[3] Basu A,Du M,Leyva M J,et al.Blueberries decrease cardiovascular risk factors in obese men and women with metabolic syndrome[J].J Nutr,2010,140(9):1582-1587.

[4] Hemant K Y,Ranjan A,Asif M, et al.EST-derived SSR markers in Jatropha curcas L.:development,characteriz-ation,polymorphi-sm,and transferability across the species/genera[J].Tree Genet & Genomes,2011,7(1):207-219.

[5] Varshney R K,Graner A,Sorrells M E.Genic microsatellite markers in plants:features and applications[J].Trends Biotechnol,2006,1(23):48-55.

[6] Chapman M A,Hvala J,Strever J,et al.Development,polymorphism,and cross-taxon utility of EST-SSR markers from safflower (Carthamus tinctorius L.)[J].Theor Appl Genet,2009,120(1):85-91.

[7] Rowland L J,Ogden E L,Bassil N,et al.Construction of a genetic linkage map of an interspecific diploid blueberry population and identification of QTL for chilling requirement and cold hardiness[J].Mol Breeding,2014,34(4):2033-2048.

[8] Yang B,Ballington J,Raja A,et al.Patterns of simple sequence repeats in cultivated blueberries(Vaccinium section Cyanococcus spp.)and their use in revealing genetic diversity and population structure[J].Mol Breeding,2014,34(6):675-689.

[9] Samir C D.Structured diversity using EST-PCR and EST-SSR markers in a set of wild blueberry clones and cultivars[J].Biochemical Systematics and Ecology,2014(54):337-347.

[10] Boches P,Bassil N V,Rowland L J.Microsatellite markers for Vaccinium from EST and genomic libraries[J].Mol Ecol Notes,2005,5(3):657-660.

[11] Chen Y X,Zhang X Q,Xie W G,et al.Genetic diversity of Hemarthria compressa germplasms from southwestern China based on EST-SSR markers[J].Acta Pratacul Sin,2015,20(6):245-253.

[12] Hong Y B,Chen X P,Liang X Q,et al.A SSR-based composite genetic linkage map for the cultivated peanut(Arachis hypogaeaL.)genome[J].BMC Plant Biol,2010,10(1):10-17.

[13] Zhu Y F,Qin G C,Hu J,et al.Fingerprinting and variety identification of rice(Oryzasativa L.)based on simple sequence repeat markers[J].Plant Omics,2012,5(4):421-426.

[14] Kojima T,Nagaoka T,Noda K,et al.Genetic linkage map of ISSR and RAPD markers in Einkorn wheat in relation to that of RFLP markers[J].Theor Appl Genet,1998,96(1):37-45.

[15] 任紅曉,程須珍,徐東旭,等.應(yīng)用SSR標(biāo)記分析中國(guó)北方名優(yōu)綠豆的遺傳多樣性[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào),2015,16(2):403-407.

[16] 薛建峰,譚美蓮,嚴(yán)明芳,等.我國(guó)部分蓖麻品種遺傳資源SSR分析及DNA指紋圖譜[J].中國(guó)油料作物學(xué)報(bào),2015,37(1):048-054.

[17] 薛 德,肖 亮,艾 辛,等.五節(jié)芒表型性狀和SSR標(biāo)記遺傳多樣性分析[J].草業(yè)學(xué)報(bào),2012,21(5):96-106.

[18] 段艷鳳,劉 杰,卞春松,等.中國(guó)88個(gè)馬鈴薯審定品種SSR指紋圖譜構(gòu)建與遺傳多樣性分析[J].作物學(xué)報(bào),2009,35(8):1451-1457.

[19] W?hrmann T,Weising K.In silico mining for simple sequence repeat loci in a pineapple expressed sequence tag database and cross-species amplification of EST-SSR markers across Bromeliaceae[J].Theor Appl Genet,2011,123(4):635-647.

[20] Feng Y,Zhang Z J,Zhang S L,et al.Development of walnut EST-SSR markers and primer design[J].Agril Sci Tech,2011,12(12):1810-1813.

[21] Chen C X,Zhou P,Choi Y,et al.Mining and characterizing microsatellites from citrus ESTs[J].Theor Appl Genet,2006,112(7):1248-1257.

[22] Scott K D,Eggler P,Seaton G,et al.Analysis of SSRs derived from grape ESTs[J].Theor Appl Genet,2000,100(5):723-726.

[23] Decroocq V,Fav M G,Hagen L,et al.Development and transferability of apricot and grape EST microsatellite markers across taxa[J].Theor Appl Genet,2003,106(5):912-922.

[24] Wang X C,Jiang S L,Shangguan L F,et al.Development of EST-derived SSR markers for pear and evaluation of their application in pear genetic diversity analysis[J].Sci Agric Sin,2010,43(24):5079-5087.

[25] Yao L H,Zheng X Y,Cai D Y,et al.Exploitation of Malus EST-SSRs and the utility in evaluation of genetic diversity in Malus and Pyrus[J].Genet Resour Crop Ev,2010,57(6):841-851.

[26] 徐 娜,夏秀英,賀建華,等.中國(guó)北方引種的部分越橘品種的RAPD分析[J].果樹(shù)學(xué)報(bào),2008,25(5):736-739.

[27] 崔建民,劉紅霞,鄒榮仟,等.越橘種質(zhì)資源遺傳多樣性和親緣關(guān)系研究[J].果樹(shù)學(xué)報(bào),2010,27(3):373-378.

[28] Liu Y C,Liu S,Liu D C,et al.Exploiting EST databases for the development and characterization of EST-SSR markers in blueberry(Vaccinium)and their cross-species transferability in Vaccinium spp.[J].Scientia Horticulturae,2014,176:319-329.

[29] 傅 冰,洪 震,劉躍鈞,等.藍(lán)莓SRAP-PCR反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化及其遺傳多樣性分析[J].北方園藝,2013(17):85-87.

[30] 李紅俠,陳紅玲,王 林,等.藍(lán)莓種質(zhì)資源遺傳多樣性的SRAP分析[J].宿州學(xué)院學(xué)報(bào),2015(1):85-87.

[31] 王 程,羅 軍,田志杰,等.利用RAPD標(biāo)記分析長(zhǎng)白山越桔的遺傳多樣性及親緣關(guān)系[J].吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào),2009(2):73-76.

[32] 鄭 珊,張立杰,謝麗雪,等.藍(lán)莓品種ISSR指紋圖譜構(gòu)建的初步研究[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2014,29(12):1198-1201.

(責(zé)任編輯： 劉忠麗)

Fingerprinting Construction and Genetic Relationship Analysis of Blueberry Based on EST-SSR Markers

GAO Xiongmei1, XU Guohui2*, WANG Hexin2, HOU Yilong1

(1.LifeScienceandTechnologyCollege,DalianUniversity,Dalian,Liaoning116622; 2.InstituteofModernAgriculturalResearch,DalianUniversity,Dalian,Liaoning116622,China)

To provide basis for cultivar identification and apolegamy of excellent hybridization combination at the molecular level, EST-SSR markers were employed to analyzeon fingerprinting and genetic diversity of north highbush blueberry cultivars. Ten of 40 pairs of EST-SSR primers were screened out based on five cultivars which were selected randomly. The 10 primer pairs amplified a total of 206 alleles (including 203 polymorphic alleles) among the 30 cultivars, and the ratio of polymorphism was as high as 98.12%. Alleles amplified by each pair of primers ranged from 9 to 48, with a mean of 20.6, and the mean of polymorphism alleles for each pair was 20.3. 30 cultivars were univocally identified using only one EST-SSR primer pair(CA231), which one’s alleles was the most and the ratio of polymorphism was 100%. UPGMA cluster analysis of genetic relationship between cultivars showed that all the materials were clustered into one group at the genetic similarity coefficient of 0.52, and 77.7% of the cultivars were still clustered together at the genetic similarity coefficient of 0.63.

blueberry; EST-SSR; fingerprinting; genetic diversity

2015-09-09； 2016-02-28修回

遼寧省博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目“高叢藍(lán)莓自然雜交優(yōu)良品系的篩選及其DNA指紋鑒定”(20141120)；遼寧省科技計(jì)劃項(xiàng)目“藍(lán)莓樹(shù)莓種質(zhì)資源創(chuàng)新及優(yōu)質(zhì)高效栽培技術(shù)研究”(2013204001)；藍(lán)莓優(yōu)良新品種的選育及推廣應(yīng)用(XDNY-NYKJ-2015-001)；大連金州國(guó)家農(nóng)業(yè)科技園區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目“藍(lán)莓優(yōu)良品種高效栽培技術(shù)示范”(2014-004)；昆明市科技計(jì)劃項(xiàng)目“藍(lán)莓品種選育及關(guān)鍵栽培技術(shù)創(chuàng)新”(2014-04-A-N-01-3099)

高雄梅(1989-)，女，在讀碩士，研究方向：植物遺傳育種。E-mail:gaoxm13@163.com

*通訊作者： 徐國(guó)輝(1980-)，女，講師，博士，從事遺傳育種學(xué)研究。E-mail:xugh520@163.com

1001-3601(2016)04-0172-0110-06

S663.9

A