李 晶， 林雄杰， 林冬梅， 魯國東， 林占熺*

(1.國家菌草工程技術研究中心， 福建 福州 350002； 2.福建農林大學 菌草研究所， 福建 福州 350002； 3.福建省農業(yè)科學研究院 果樹研究所， 福建 福州 350013)

PEG-CaCl2介導牛樟芝遺傳轉化體系的構建

李 晶1，2， 林雄杰3， 林冬梅1，2， 魯國東1， 林占熺1，2*

(1.國家菌草工程技術研究中心， 福建 福州 350002； 2.福建農林大學 菌草研究所， 福建 福州 350002； 3.福建省農業(yè)科學研究院 果樹研究所， 福建 福州 350013)

為建立穩(wěn)定的牛樟芝(Antrodiacinnamomea)遺傳轉化體系，同時篩選出適宜介導牛樟芝原生質體轉化的PEG-CaCl2濃度。利用潮霉素抗性、綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)標記和PCR擴增驗證擬轉化子。結果表明：新鮮的牛樟芝菌絲體在10 mg/mL溶壁酶溶液中，30℃條件下酶解4 h，原生質體的獲得率為3.55×105個/mL；菌絲體和原生質體在潮霉素B濃度分別為60 μg/mL和40 μg/mL時不能生長，最終確定篩選擬轉化子的潮霉素B濃度為60 μg/mL；濃度為20%～40%的PEG均可介導牛樟芝原生質體轉化，且40%的PEG轉化效率最高。

牛樟芝； 原生質體； 聚乙二醇； 潮霉素B； 重組子

真菌是世界第二大類生物，主要分成微生物和大型真菌(食、藥用菌)兩類[1]。牛樟芝(Antrodiacinnamomea)是我國臺灣特有的珍稀藥用菌，屬擔子菌門(Basidiomycota)、多孔菌目(Polyporales)、白肉迷孔菌科(Fomitopsidaceae)、薄孔菌屬(Antrodia)，最早發(fā)現(xiàn)生長在腐爛的空心牛樟樹(Cinnamomumkanehirai)內壁，長期以來，牛樟樹被認為是牛樟芝的唯一宿主[2-3]。牛樟芝味苦，含有大量的三萜類、酚類和多糖類等物質[4]，對抗過敏、抗炎癥、抗氧化、抗腫瘤、保肝和提高免疫力等具有顯著功效[5-7]。

轉化是將外源DNA通過載體、媒介，以物理、化學等方法導入受體細胞，并完整表達的過程[8]；食藥用菌屬擔子菌類，難以被轉化。關于食藥用菌轉化的研究始于20世紀90年代，利用電擊和基因槍等不同轉化方法提高雙孢蘑菇(Agaricusbisporus)[9]和楊樹菇(Agrocybeaegerita)[10]原生質體轉化效率，但外源DNA整合重組后活性較低，異源啟動子不能有效調控外源基因表達，易出現(xiàn)假陽性等現(xiàn)象。但隨著技術的不斷發(fā)展，草菇[11-12]、香菇[13-14]、靈芝[15-16]、平菇[17]和猴頭菇[18]等經濟菌類通過改進轉化技術均成功建立了遺傳轉化體系。綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)最早在水母中發(fā)現(xiàn)并分離，該蛋白在紫外光或藍光激發(fā)下發(fā)熒光，并發(fā)現(xiàn)其在無任何底物和輔助因子的情況下也能在活細胞中發(fā)熒光[19-21]，故用于細胞和蛋白質標記。在牛樟芝遺傳轉化體系中，利用GFP標記的載體轉入牛樟芝原生質體中，能快速篩選并確定轉化子，具有高效、穩(wěn)定等特征。

隨著牛樟芝的分類和生物學特性研究的不斷深入，陸續(xù)開展了其藥理學、質量控制、栽培條件和分子生物學等方面的研究[22]，而牛樟芝分子生物學的前提條件是必需建立穩(wěn)定的遺傳轉化體系。目前，李剛[23]建立靈芝原生質體轉化體系，并連續(xù)培養(yǎng)5代以上仍可以穩(wěn)定表達潮霉素抗性；張新濤等[24]建立了我國傳統(tǒng)藥用菌靈芝的遺傳轉化體系，但國內外對牛樟芝遺傳轉化體系的研究鮮見報道，筆者利用PEG-CaCl2介導建立的牛樟芝遺傳轉化體系，并通過GFP標記對其進行驗證，為深入開展分子生物學研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株及質粒 臺灣牛樟芝菌株AC 001(Genbank Accession NO.：KM925002)，由臺灣神農真菌生物技術有限公司惠贈，保存于福建農林大學菌草研究所；pCX62為含抗潮霉素抗性標記質粒載體，pCT74為含抗潮霉素抗性和GFP標記質粒載體[25]均由福建農林大學功能基因組學研究中心提供。

1.1.2 培養(yǎng)基及常用溶液 牛樟芝液體培養(yǎng)基：葡萄糖25 g，蛋白胨5 g，麥芽糖3 g，酵母提取物3 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 1 g，維生素B11 g，蒸餾水定容至1 L，pH 5.5；牛樟芝固體培養(yǎng)基：葡萄糖25 g，蛋白胨5 g，麥芽糖3 g，酵母提取物3 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 1 g，維生素B11 g，瓊脂20～25 g，蒸餾水定容至1 L，pH 5.5；馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯200 g(去皮切塊加水煮30 min，用紗布過濾取濾液)，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 L；TB3再生培養(yǎng)基：酸水解酪蛋白3 g，酵母提取物3 g，蔗糖200 g，蒸餾水定容到1 L，配制固體培養(yǎng)基時加入瓊脂粉10 g。0.6 mol/L甘露醇：109.302 g甘露醇，溶于適量去離子水中，定容到1 L；MTC緩沖液：10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)，10 mmol/L CaCl2，0.6 mol/L甘露醇；PEG溶液：取適量PEG4000，溶于適量dd H2O，定容到100 mL，現(xiàn)配現(xiàn)用；PEG-CaCl2溶液：適宜比例PEG溶液，10 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L CaCl2，現(xiàn)配現(xiàn)用；溶壁酶溶液(北京索萊寶生物科技有限公司)：適量溶壁酶用0.6 mol/L甘露醇配置，現(xiàn)配現(xiàn)用；以上溶液均過濾除菌。

1.2 原生質體的制備與再生

1.2.1 原生質體的制備 在PDA上活化后的牛樟芝菌種接種至牛樟芝液體培養(yǎng)基中，28℃，120 r/min，黑暗培養(yǎng)14 d后在無菌條件下過濾收集菌絲體，研磨成勻漿狀，取1 mL裝入50 mL離心管中，用無菌水洗滌后7000 r/min，離心10 min，棄上清；其沉淀用0.6 mol/L甘露醇洗滌，7000 r/min，離心10 min，棄上清，1次重復；沉淀重懸于10 mL(濃度為10 mg/mL)的溶壁酶溶液中[26-27]，于30℃，80 r/min酶解，2 h后用血球計數(shù)板對酶解程度進行鏡檢，直至大多數(shù)酶解為原生質體，確定最佳酶解時間。

將酶解產物過濾，除去未被酶解的菌絲體，濾液于7000 r/min離心機，離心20 min，棄上清液，沉淀用0.6 mol/L甘露醇和MTC緩沖液各洗滌1次后離心，棄上清；沉淀重懸于2 mL 含7%二甲基亞砜的0.6 mol/L甘露醇中，每管200 μL分裝后置于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 原生質體的再生 取上述制備的新鮮原生質懸浮液100 μL，涂布在TB3再生培養(yǎng)基平板上，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗倒置培養(yǎng)，14 d后按公式計算再生率：再生率=再生菌落總數(shù)/涂板原生質體總數(shù)×100%。

1.3 牛樟芝菌絲體及原生質體對潮霉素B的敏感性測定

1.3.1 牛樟芝菌絲體 將牛樟芝菌株分別接種到含潮霉素B濃度為20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL和120 μg/mL的固體培養(yǎng)基中央，每個濃度3次重復，以不加潮霉素B的平板作為對照；接種后置于28℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)14 d，觀察并記錄生長情況，篩選最適合的潮霉素濃度。

1.3.2 牛樟芝原生質體 牛樟芝原生質體懸浮液100 μL分別涂布于含潮霉素B濃度為20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL和120 μg/mL固體培養(yǎng)基中，每個濃度3次重復，以不加潮霉素B的平板作為對照；接種后在28℃、黑暗條件下培養(yǎng)14 d，觀察并記錄生長情況，篩選最適合的潮霉素B濃度。

1.4 質粒提取

質粒提取方法按照OMEAG質粒提取試劑盒說明操作。

1.5 PEG-CaCl2介導的原生質體轉化

參照李剛[16]、劉莉[18]的方法，略加改進。取2管原生質體(200 μL/管)，向其中一管加入50 μg質粒，另外一管加入等體積的0.6 mol/L甘露醇作對照，分別加入100 μL 0.6 mol/L甘露醇，輕微混勻后置冰上預冷5 min；再逐滴加入1 mL 20%、30%、40%、50%和60%的PEG-CaCl2溶液，輕微混勻后于冰上放置60 min，逐滴加入0.5 mL PEG-CaCl2溶液，室溫放置30 min，再加入1 mL MTC緩沖液和5 mL牛樟芝液體培養(yǎng)基，28℃，85 r/min振蕩培養(yǎng)48 h；取1 mL均勻涂布在含潮霉素B濃度為60 μg/mL的牛樟芝固體培養(yǎng)基平板中，28℃恒溫箱中黑暗培養(yǎng)14 d。

1.6 牛樟芝轉化子篩選及鑒定

分別進行pCX62和pCT74質粒轉化。挑取在含潮霉素B濃度為60 μg/mL的牛樟芝固體培養(yǎng)基上正常生長的轉化子視為擬定轉化子，轉接至含潮霉素B濃度為60 μg/mL的牛樟芝固體培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)5代，挑選繼續(xù)生長的擬定轉化子進行液體擴大培養(yǎng)并收集菌絲體，采用CTAB法提取gDNA[28]，進行潮霉素基因(hph)PCR擴增。引物序列分別為5′-GCCCTTCCTCCCTTTATT-3′和5′-TCCATCACAGTTTGCCAGT-3′，引物由鉑尚生物技術(上海)有限公司合成。PCR反應體系為25 μL，擴增程序為95℃預變性3 min；94℃變性30 s，58.7℃退火30 s，72℃延伸40 s，32個循環(huán)；72℃延伸7 min，PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.7 PEG-CaCl2介導的轉化體系驗證

將含GFP的外源質粒pCT74導入牛樟芝原生質體后篩選擬轉化子，并通過熒光顯微鏡觀察其菌絲體形態(tài)。

2 結果與分析

2.1 原生質體的制備及再生

不同酶解時間對原生質體得率研究表明，酶解2 h和3 h時，原生質體的獲得量分別為2.03×105個/mL和3.13×105個/mL；酶解4 h時，原生質體的獲得量最大，達3.55×105個/mL；繼續(xù)增加酶解時間至5 h，原生質體獲得量降至3.08×105個/mL，可能是由于溶壁酶對已生成的原生質體產生毒害作用，影響原生質體的數(shù)量及活性，最終影響原生質體再生及轉化效率。所制備原生質體大小適中，無變形(圖1A)，在TB3再生培養(yǎng)基上再生率達4.59%(圖1B)。

圖1 牛樟芝原生質體(A)及其在TB3 培養(yǎng)基上再生情況(B)

Fig.1 Regeneration ofA.cinnamomeaprotoplasts on TB3 medium

2.2 牛樟芝菌絲體對潮霉素B的敏感性

由圖2可知，牛樟芝菌株在含不同濃度潮霉素B的牛樟芝固體培養(yǎng)基上生長6～8 d后呈明顯不耐受性，牛樟芝菌絲體在潮霉素B濃度為20 μg/mL的培養(yǎng)基上有少量繼續(xù)生長；當潮霉素B濃度達到40 μg/mL時僅有極少量菌絲可萌發(fā)，但第7天后不再生長；當潮霉素B濃度>60 μg/mL時，牛樟芝菌絲體完全不生長。

注：A，空白對照；B，潮霉素B濃度20 μg/mL；C，潮霉素B濃度40 μg/mL；D，潮霉素B濃度60 μg/mL；E，潮霉素B濃度80 μg/mL；F，潮霉素B濃度100 μg/mL；G，潮霉素B濃度120 μg/mL(下同)。

Note: A, CK; B, 20 μg/mLhygromycin B; C, 40 μg/mL hygromycin B; D, 60 μg/mL hygromycin B; E, 80 μg/mL hygromycin B; F, 100 μg/mL hygromycin B; G, 120 μg/mL hygromycin B. The same below.

圖2 不同濃度潮霉素B 處理牛樟芝菌絲的生長情況

Fig.2 Growth ofA.cinnamomeamycelium treated with different concentration of hygromycin B

2.3 牛樟芝原生質體對潮霉素B的敏感性

由圖3可見，牛樟芝原生質體再生培養(yǎng)14 d后，含不同濃度潮霉素B的牛樟芝固體培養(yǎng)基呈明顯不耐受性，當固體培養(yǎng)基中潮霉素B濃度為20 μg/mL時牛樟芝原生質體的生長明顯受到抑制，僅有少量能生長；當潮霉素B濃度為40 μg/mL時牛樟芝原生質體幾乎不能生長；當潮霉素B濃度>60 μg/mL時，牛樟芝原生質體完全不能生長(圖3)。因此，將潮霉素B濃度為60 μg/mL作為牛樟芝轉化子抗性篩選濃度。

圖3 不同濃度潮霉素 B處理牛樟芝原生質體的生長情況

2.4 牛樟芝轉化子篩選及鑒定

由圖4表明，用20%～40% PEG-CaCl2溶液介導原生質體轉化均能獲得擬轉化子，但轉化效率差異較大，其中以40% PEG-CaCl2介導的牛樟芝原生質體轉化效率最高。由圖5可見，培養(yǎng)5代的牛樟芝 pCX62和pCT74擬轉化子中hph片段擴增篩選得到的1～5號擬轉化子均可擴增大小約為560 bp的hph片段，6號為原始菌株，能初步確定該轉化體系的成功建立。

注：A，PEG濃度為0；B，PEG濃度為20%；C，PEG濃度為30%；D，PEG濃度為40%；E，PEG濃度為50%；F，PEG濃度為60%。

Note: A, CK; B, 20% PEG; C, 30% PEG; D, 40% PEG; E, 50% PEG; F, 60% PEG.

圖4 不同濃度PEG-CaCl2溶液處理牛樟芝原生質體的轉化效率

Fig.4 Transformation efficiency ofA.cinnamomeaprotoplast treated with different concentration of PEG-CaCl2solution

注：樣品1～5號為轉化菌株，6號為原始菌株。

Note: 1～5, transformant stains; 6, original stain.

圖5 牛樟芝 pCX62(左)和pCT74 (右)擬轉化子hph片段擴增

Fig.5 hph amplification of pCX62 (left) and pCT74 (right) transformant ofAntrodiacinnamomea

圖6 pTC74轉化子菌絲體在普通(A)和熒光顯微鏡(B)及野生菌株(C)在熒光顯微鏡下菌絲形態(tài)

Fig.6 Mycelium of pCT74 transformant under common microscope (A) and fluorescence microscope (B) and hyphal morphology of wild strain (c) under fluorescence microscope

2.5 牛樟芝遺傳轉化體系的驗證

由圖6可見，在熒光顯微鏡下pCT774擬轉化子的菌絲體中可觀察到大量的綠色熒光，而野生型牛樟芝菌絲體則無該現(xiàn)象，從而進一步證明PEG-CaCl2可成功介導牛樟芝原生質體轉化。

3 結論與討論

與前人研究結果[23-24]相比，本研究利用GFP對所轉化體系進行驗證，在熒光顯微鏡下能快速、直接觀察到轉化情況，縮短轉化培養(yǎng)及驗證時間，提高了驗證效率。張新濤等[24]的結果中靈芝原生質體再生率僅1%，李剛等[23]的研究結果也表明，靈芝再生率也與酶解時間、培養(yǎng)基等有關，本研究牛樟芝原生質體再生率4.59%，而原生質體再生率低也能直接影響轉化效率。牛樟芝原生質體再生率和轉化效率低可能是因為高等真菌的遺傳規(guī)律和菌齡限制[24]，但也可能是以下原因：

1) 酶解條件的選擇。有效去除細胞壁是成功制備原生質的關鍵。真菌細胞壁主要含有大量的多糖類物質，選擇適宜的溶壁酶至關重要。劉莉等[18]對猴頭菇遺傳轉化體系的研究中發(fā)現(xiàn)，1%溶壁酶、1%纖維素酶和1%蝸牛酶對原生質體的制備效果最佳(3×106個/mL)，其次為1%溶壁酶(2.8×106個/mL)。本研究中用10 mg/mL的溶壁酶制備牛樟芝原生質體可達3.13×105個/mL，說明不同溶壁酶之間對原生質體的形成可能存在差異。

研究中還發(fā)現(xiàn)酶解時間能直接影響原生質的數(shù)量，酶解2～4 h，原生質體數(shù)量不斷升高，而酶解5 h后，原生質體數(shù)量明顯下降，是由于酶解時間過長，溶壁酶對原生質體膜進行酶解，導致原生質體破裂，從而使再生能力下降，這與李剛等[16]研究結果一致。

2) PEG介導濃度的選擇。本研究結果表明，不同濃度的PEG-CaCl2溶液對轉化獲得率影響較大。當PEG-CaCl2溶液濃度為20%～40%時，均能獲得不同數(shù)量的轉化子，而當濃度達50%以上時，均無法獲得相應的轉化子，在PEG處理過程中，由于細胞質濃度不均勻或細胞體積過小容易使原生質體破碎，因此轉化過程中，原生質體的質量、活性以及細胞滲透壓環(huán)境的穩(wěn)定是轉化成功的關鍵。過高的PEG濃度會影響細胞穩(wěn)定性，對細胞產生一定的毒害作用，本研究當PEG濃度>50%時，未獲得相應的轉化子，可能是因為濃度過高使原生質體破裂從而無法再形成轉化子。

利用GFP驗證牛樟芝遺傳轉化體系具有直觀、快速、穩(wěn)定等特點，提高轉化驗證效率和準確性，可在各領域使用。牛樟芝子實體和菌絲體都含量大量三萜類和多糖類，其藥理功能越來越得到認可，建立牛樟芝遺傳轉化體系，利用分子生物學技術拓展牛樟芝的研究和利用空間，建立穩(wěn)定、快速的牛樟芝遺傳轉化體系，通過導入外源基因，提升牛樟芝工業(yè)生產價值，從而為牛樟芝的市場化推廣應用奠定基礎。

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(責任編輯： 劉忠麗)

Establishment of Genetic Transformation System ofAntrodiacinnamomeaBased on PEG-CaCl2Mediated Method

LI Jing1,2, LIN Xiongjie3, LIN Dongmei1,2, LU Guodong1, LIN Zhanxi1,2*

(1.ChinaNationalJuncaoEngineeringResearchCenter,Fuzhou,Fuzhou350002; 2.JuncaoInstitute,FujianUniversityofAgricultureandForestry,Fuzhou,Fuzhou350002; 3.FruitInstitute,FujianAcademyofAgriculturalScience,Fuzhou,Fuzhou350013,China)

The transformants ofAntrodiacinnamomeamycelium and protoplast were verified by hygromycin B resistance, GFP and PCR to establish the stable genetic transformation system ofAntrodiacinnamomeaand screen the suitable PEG-CaCl2concentration for transformation ofAntrodiacinnamomeaprotoplast. Results: The protoplast yield extracted from freshA.cinnamomeamycelium is 3.55×105/mL under the conditions of 10 mg/mL lyticase, 4 h and 30℃. The mycelium and protoplast ofA.cinnamomeacan not grow on 40 μg/mL or 60 μg/mL hygromycin B medium. The suitable concentration of hygromycin B to screenA.cinnamomeatransformants is 60 μg/mL. 20%～40% PEG can mediate transformation ofA.cinnamomeaprotoplast and the optimal PEG concentration is 40%.

Antrodiacinnamomea; protoplast; polyethylene glycol; hygromycin B; recombinant

2015-09-16； 2016-04-02修回

福建省2011計劃“福建省菌草生態(tài)產業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心”(k80nd8002)；國家菌草工程技術研究中心組建項目(2011FU125X 12)

李 晶(1985-)，女，碩士，從事蔬菜學食用菌研究。E-mail:13959197195@163.com

*通訊作者：林占熺(1943-)，男，研究員，從事菌草栽培食藥用菌技術研究。E-mail:lzxjuncao@163.com

1001-3601(2016)04-0166-0086-06

S646.9； Q939.5

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