徐志剛， 呂淑慧，王玉清，楊笑天，劉子瑞

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姜黃素對(duì)急性高眼壓家兔的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的保護(hù)作用

徐志剛1， 呂淑慧1，王玉清1，楊笑天1，劉子瑞2

Protective effect of curcumin for retinal ganglion cells in adult rabbits with acute intraocular hypertension

Zhi-Gang Xu1, Shu-Hui Lü1, Yu-Qing Wang1, Xiao-Tian Yang1, Zi-Rui Liu2

Citation:Xu ZG, Lü SH, Wang YQ,etal. Protective effect of curcumin for retinal ganglion cells in adult rabbits with acute intraocular hypertension.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(2):231-233

摘要

目的：探討姜黃素(Curcumin，Cur)對(duì)實(shí)驗(yàn)性急性高眼壓家兔眼視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells，RGCs)的保護(hù)作用。

方法：將24只家兔按照隨機(jī)等分的方法分為3組，即姜黃素干預(yù)青光眼模型組(姜黃素組)、未給予姜黃素干預(yù)的青光眼模型組(青光眼組)和不經(jīng)任何干預(yù)措施的正常對(duì)照組(正常組)。應(yīng)用前房灌注升高眼壓的方法給姜黃素組和青光眼組的家兔建立急性高眼壓模型，急性高眼壓模型造模成功后，給予姜黃素組家兔玻璃體腔注射比例濃度為0.1mg/0.1mL的姜黃素，青光眼組家兔玻璃體腔注射相同體積的生理鹽水，每天注射1次，共7d。正常對(duì)照組不做上述任何處理直接取眼球。實(shí)驗(yàn)完成后，通過(guò)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)三組家兔眼球視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞Thy-1的表達(dá)并計(jì)數(shù)。

結(jié)果：姜黃素組和正常組的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞Thy-1表達(dá)之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；青光眼組和正常組的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞Thy-1表達(dá)差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。姜黃素組、正常組和青光眼組的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞密度分別為20.3±2.7、21.5±1.8和15.1±2.3個(gè)/高倍視野。

結(jié)論：在姜黃素作用的急性高眼壓模型家兔的實(shí)驗(yàn)中，姜黃素可以通過(guò)提高視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的Thy-1的表達(dá)，表明其在一定程度上能夠降低急性高眼壓狀態(tài)下家兔視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的損傷，推測(cè)姜黃素可能對(duì)視網(wǎng)膜在特定情況下具有一定的保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：急性高眼壓；視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞；姜黃素

引用：徐志剛， 呂淑慧，王玉清，等.姜黃素對(duì)急性高眼壓家兔的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的保護(hù)作用.國(guó)際眼科雜志2016;16(2):231-233

0 引言

根據(jù)世界國(guó)際衛(wèi)生組織公布的數(shù)字顯示：截止到2010年，全世界青光眼患者人數(shù)已經(jīng)達(dá)到6 050多萬(wàn)，到2020年此數(shù)字將上升到7 960多萬(wàn)[1]。因青光眼引起雙眼失明的患者占盲人總數(shù)將近一半，目前就全球眼科疾病的致盲率來(lái)看，白內(nèi)障位于第一位，位居第二位的就是青光眼。然而對(duì)青光眼來(lái)說(shuō)，雖然可以采取傳統(tǒng)的濾過(guò)性手術(shù)和降眼壓藥物來(lái)降低眼壓，以此來(lái)控制青光眼對(duì)視力的進(jìn)一步損害，但是對(duì)青光眼發(fā)病以來(lái)造成的視力喪失部分卻是不可恢復(fù)的。所以把青光眼定義為是不可逆性地致盲性眼病，而且它是以視神經(jīng)損害和特征性視野缺損為共同特征的眼病[2]。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的臨床觀察研究發(fā)現(xiàn)，有相當(dāng)部分的患者無(wú)論是藥物治療還是手術(shù)治療控制眼壓，還是未能控制病情的發(fā)展。所以對(duì)于青光眼的臨床治療，在現(xiàn)階段除了積極控制眼壓外，眼科醫(yī)生還應(yīng)該積極探索對(duì)視神經(jīng)保護(hù)的治療方法。Thy-1抗原是一種糖蛋白，主要存在于嚙齒類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞表面，被公認(rèn)為是成熟RG- Cs的標(biāo)志。近幾年的實(shí)驗(yàn)研究中，由于Thy-1作為一種經(jīng)典的RGCs特異性標(biāo)記物，已被廣泛用于RGCs的分離純化和標(biāo)記鑒定。

姜黃素(Curcumin)是從植物姜黃的根莖中提取出來(lái)的發(fā)揮藥理作用的有效成分，這種中藥材含有多效的天然活性物質(zhì)，還是略帶酸性的酚類(lèi)物質(zhì)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)在古代研究的基礎(chǔ)上又發(fā)現(xiàn)了姜黃素還有很多的藥理功效，如抗腫瘤、抗纖維化、抗炎、抗突變、抗氧化、抗微生物、抗動(dòng)脈粥樣硬化、降血脂等諸多藥理作用[3]。近幾年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素保護(hù)神經(jīng)的作用是通過(guò)多種多樣的方式，使得姜黃素在眼科研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，并且考慮到姜黃素成本低廉、使用安全，將會(huì)對(duì)青光眼的預(yù)防和治療上帶來(lái)前所未見(jiàn)的光明前景。

1 材料和方法

1.1材料健康家兔24只，由佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)設(shè)備及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均符合國(guó)家技術(shù)委員會(huì)的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》，體質(zhì)量1.5～2.5kg，雄雌各半，應(yīng)用前在充足的陽(yáng)光和良好的飼料條件下飼養(yǎng)7d，觀察家兔無(wú)生長(zhǎng)問(wèn)題后，用裂隙燈顯微鏡、間接檢眼鏡等常規(guī)眼科檢查，檢查家兔眼球，達(dá)到屈光間質(zhì)清晰，眼底正常。主要儀器：石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)，圖像分析儀(德國(guó)Leica公司)。主要試劑：人抗兔Thy-1抗體(武漢博士德生物工程公司)，DAB顯色劑(武漢博士德生物工程公司)。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組對(duì)24只家兔隨機(jī)分為3組，每組16只眼球：(1)正常眼對(duì)照組(正常組)；(2)姜黃素干預(yù)青光眼模型組(姜黃素組)；(3)未干預(yù)青光眼模型組(青光眼組)。

1.2.2家兔急性高眼壓模型的建立方法應(yīng)用托吡卡胺滴眼液散大瞳孔，抗生素滴眼液滴右眼，5min后用1%丁卡因滴同一眼，無(wú)菌碘伏消毒，5號(hào)頭皮針與生理鹽水輸液瓶連接，將針頭延角膜緣從鼻上方避開(kāi)晶狀體和虹膜刺入家兔前房，此時(shí)將灌注液的流量調(diào)至最大，仔細(xì)觀察家兔眼球表面的變化，當(dāng)觀察到虹膜迅速變白、球結(jié)膜蒼白、間接檢眼鏡觀察視網(wǎng)膜蒼白水腫、莫非氏管中無(wú)液體滴注時(shí)，說(shuō)明急性高眼壓模型建立已成功，此時(shí)視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈的供血被完全中斷。固定針頭，檢查穿刺口有無(wú)漏水，數(shù)分鐘后可見(jiàn)角膜水腫呈霧狀。持續(xù)加壓60min，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持家兔體溫維持在36.5℃～37℃，并間斷給家兔術(shù)眼滴抗生素眼藥水以預(yù)防感染和保持角膜干燥。60min后緩慢地降低輸液瓶高度與術(shù)眼持平，可見(jiàn)加壓的虹膜血管供血及球結(jié)膜逐漸恢復(fù)正常，檢眼鏡可觀察到視網(wǎng)膜呈橘紅色，證明阻斷的視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈又重新開(kāi)放，缺血再灌注已形成，遂拔出針頭[4]。同法對(duì)左眼進(jìn)行造模。術(shù)后剔除的標(biāo)準(zhǔn)：前房不能形成；針頭誤傷晶狀體形成白內(nèi)障家兔；穿刺口漏水；前房明顯積血。

1.2.3給藥方法將上述配好的姜黃素取出解凍，在急性高眼壓的模型成功后，在間接檢眼鏡觀察下，用1mL注射器抽取之前配好的姜黃素用時(shí)搖勻，并用7號(hào)針頭于角膜緣后4mm的鞏膜處進(jìn)行穿刺，并向玻璃體腔中部注入0.1mg/0.1mL姜黃素0.1mL，每天1次，共7d。青光眼組按照上述相同方法對(duì)家兔玻璃體給予相同體積的生理鹽水代替。術(shù)后涂氧氟沙星眼藥膏預(yù)防感染。術(shù)畢將家兔送回兔籠，各組飼養(yǎng)條件相同。

1.2.4標(biāo)本采集和免疫組織化學(xué)法步驟各組家兔于術(shù)后第7d從飼養(yǎng)籠內(nèi)取出，用大注射器經(jīng)耳緣靜脈注射空氣，造成空氣栓塞處死家兔，立即用顯微器械摘除眼球，然后泡在4%多聚甲醛溶液和PBS緩沖液1∶9組成的固定液中固定1h后，在沿著角鞏膜緣處用顯微剪剪去角膜，除去虹膜和晶狀體，盡可能取凈玻璃體后留取視網(wǎng)膜，將取出的視網(wǎng)膜放于裝有固定液的小瓶中保存。石蠟包埋、切片、烤片后，脫蠟至水化，抗原修復(fù)后加3% H2O2孵育30min(室溫)，加一抗、二抗孵育后，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，然后脫水、中性樹(shù)脂封片。取待測(cè)視網(wǎng)膜切片，三組均留取以后極部為中點(diǎn)的視網(wǎng)膜，并且在每個(gè)選取的視網(wǎng)膜上隨機(jī)取5個(gè)高倍視野，分別統(tǒng)計(jì)Thy-1抗體陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)均數(shù)為該區(qū)域陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/高倍視野。

2 結(jié)果

由于Thy-1只存在于視網(wǎng)膜的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層，所以其主要在胞漿中著色(圖1)。Thy-1在姜黃素組和青光眼模型組中家兔視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中的表達(dá)見(jiàn)圖2、3。統(tǒng)計(jì)標(biāo)記RGCs計(jì)數(shù)：正常對(duì)照組Thy-1為21.5±1.8個(gè)/高倍視野，姜黃素組為20.3±2.7個(gè)/高倍視野，青光眼模型組為15.1±2.3個(gè)/高倍視野。正常對(duì)照組、姜黃素干預(yù)青光眼模型組、未干預(yù)青光眼模型組的RGCs計(jì)數(shù)兩兩比較，正常對(duì)照組和未干預(yù)青光眼模型組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞差異有顯著統(tǒng)學(xué)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；正常對(duì)照組和姜黃素干預(yù)青光眼模型組之間差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1Thy-1在正常組家兔視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中的表達(dá)。

圖2Thy-1在姜黃素組家兔視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中的表達(dá)。

圖3Thy-1在青光眼模型組家兔視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中的表達(dá)。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)制備家兔急性高眼壓模型，采用前房灌注生理鹽水方法來(lái)觀察姜黃素對(duì)急性高眼壓模型的家兔眼球視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的影響作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，姜黃素經(jīng)家兔玻璃體腔注射后，較好地保護(hù)了家兔視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的數(shù)量和形態(tài)，明顯減輕了視網(wǎng)膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化和視網(wǎng)膜內(nèi)核層厚度的損傷，提示姜黃素對(duì)急性高眼壓的家兔視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用[5]。

近幾年的實(shí)驗(yàn)研究中，由于Thy-1作為一種經(jīng)典的RGCs特異性標(biāo)記物，已被廣泛用于RGCs的分離純化和標(biāo)記鑒定。Thy-1陽(yáng)性細(xì)胞僅存在于視網(wǎng)膜的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中，并且主要在胞漿中染色。Thy-1陽(yáng)性細(xì)胞在視網(wǎng)膜的切片上分布是不均勻的，在后極部的密度高，越靠近視網(wǎng)膜周邊部陽(yáng)性率越低。所以本實(shí)驗(yàn)均選取各組視網(wǎng)膜上后極部的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分析。

目前比較公認(rèn)的對(duì)于青光眼的定義是，青光眼導(dǎo)致的視神經(jīng)損害屬于一種神經(jīng)變性損害，它是由于多因素共同作用的結(jié)果，但主要由兩方面因素即升高的眼壓和低血流灌注壓引起的，是一種導(dǎo)致視神經(jīng)損害，又不能恢復(fù)由于損害視神經(jīng)導(dǎo)致的視力喪失的致盲性眼病。對(duì)于臨床常見(jiàn)的高眼壓且伴有視盤(pán)和視野損害的患者，雖然采取常規(guī)的降眼壓藥物和濾過(guò)性手術(shù)治療可以使眼壓降到正常范圍內(nèi)，但也只能控制約70%患者病情發(fā)展，其余30%患者視盤(pán)和視野損害仍會(huì)繼續(xù)[6]。因此，降低眼壓與青光眼的病程發(fā)展與否并非存在著絕對(duì)關(guān)系，要想完全控制青光眼，單純地降低眼壓治療是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。從非常多的臨床癥狀表明，高眼壓并非導(dǎo)致青光眼的唯一病因。除此之外，還有糖尿病、高血壓、年齡、種族、血管疾病、家族史等，以及一些尚未被發(fā)現(xiàn)的危險(xiǎn)因素[7]。歸納導(dǎo)致青光眼的發(fā)病因素有：眼壓因素、非眼壓因素、多個(gè)危險(xiǎn)因素的共同參與和共同作用。總而言之，由青光眼造成的視野和視神經(jīng)損害來(lái)源于包括高眼壓在內(nèi)的多種多樣的危險(xiǎn)因素。因此在青光眼的治療中，除了常規(guī)的濾過(guò)性手術(shù)和降眼壓藥物治療來(lái)降低眼壓外，同時(shí)還應(yīng)采取改善視神經(jīng)血液供應(yīng)的治療，并且應(yīng)用自由基清除劑、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及谷氨酸受體阻滯劑等[8]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，從植物中提取的某些有效成分不僅能對(duì)青光眼視神經(jīng)進(jìn)行保護(hù)，還能夠有效地降低眼壓，對(duì)恢復(fù)視功能等方面也起到了重要作用。

姜黃素含有多效的天然活性物，已有報(bào)道證實(shí)，姜黃素不僅具有抗血小板聚集導(dǎo)致的血栓形成和抵抗腎損害等作用，而且還可以拮抗細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)及核因子，這是通過(guò)姜黃素的擬腎上腺糖皮質(zhì)激素樣作用完成的。對(duì)姜黃素研究的熱點(diǎn)是，其被用于治療阿爾海默茨病，即老年癡呆，這種疾病證實(shí)與青光眼的發(fā)病機(jī)制上有很多相似之處，這一研究領(lǐng)域涉及的范圍也越來(lái)越廣泛。本實(shí)驗(yàn)也是在眾多的研究領(lǐng)域中抽出一個(gè)分支，以研究姜黃素對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)變性疾病是否具有保護(hù)作用。姜黃素的神經(jīng)保護(hù)作用體現(xiàn)在多通路上，既能清除氧自由基又能抗氧化作用；不僅能抗老化作用，還具有抗炎作用(經(jīng)細(xì)胞凋亡途徑作用)；還有抗谷氨酰胺興奮性毒性作用；還能在成年神經(jīng)發(fā)生和干細(xì)胞神經(jīng)分化中起作用等[9]。

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·實(shí)驗(yàn)研究·

Foundation item:Scientific Research Program of Health Department in Heilongjian (No.2013251)

1Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154003, Heilongjian Province, China;2Aier Eye Hospital (Shenyang), Shenyang 110003, Liaoning Province, China

Correspondence to:Zhi-Gang Xu. Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154003, Heilongjian Province, China. xuzhigang1977@163.com

Received：2015-03-21Accepted：2016-01-15

Abstract

?AIM:To detect the protective effect of curcumin for retinal ganglion cells (RGCs) in adult rabbits with acute intraocular hypertension.

?METHODS: Twenty-four adult rabbits were divided randomly into normal control group, model group and curcumin group. Except normal control group, the rabbit model with acute ocular hypertension was established by increasing intraocular pressure through anterior chamber infusion. After the establishment of the model, rabbits in curcumin group were injected intravitreally with curcumin (0.1mg/0.1mL) for 7d. Rabbits in mdodel group were injected with physiological saline replaced of the same volume curcumin. The oculars in normal control group without any treatments were acquired directly. The levels of Thy-1 in RGCs were detected by immunohistochemistry. The density of RGCs was counted too.

?RESULTS: Thy-1 expressed in the RGCs in normal control group and curcumin group had no significant difference (P>0.05).While the difference between model group and normal control group on Thy-1 expression was statistically significant (P<0.05). The density of RGCs in curcumin group, normal control group and model group were 20.3±2.7, 21.5±1.8 and 15.1±2.3 cells/HP.

?CONCLUSION: In this study on curcumin in adult rabbits with acute ocular hypertension, curcumin can increase the expression of Thy-1, which shows that it can partly reduce the injury of RGCs in rabbits with acute intraocular hypertension and curcumin may be able to protect the retina under certain situation.

KEYWORDS:?acuate hyper-intraocular pressure;retinal ganglion cells;curcumin

DOI:10.3980/j.issn.1672-5123.2016.2.08

收稿日期：2015-03-21 修回日期： 2016-01-15

通訊作者：徐志剛.xuzhigang1977@163.com

作者簡(jiǎn)介：徐志剛，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：眼底病、白內(nèi)障。

基金項(xiàng)目：作者單位：1(154003)中國(guó)黑龍江省佳木斯市，佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科；2(110003)中國(guó)遼寧省沈陽(yáng)市，沈陽(yáng)愛(ài)爾眼科醫(yī)院