魯　銘，朱　晶

作者單位：(430022)中國湖北省武漢市第一醫(yī)院眼科

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不同濃度重組Canstatin蛋白對堿燒傷后角膜MMP-2及TIMP-2表達(dá)的影響

魯銘，朱晶

作者單位：(430022)中國湖北省武漢市第一醫(yī)院眼科

Effect of recombinant canstatin proteins with different concentrations on the expression of matrix metalloproteinase-2 and tissue inhibitor of metalloproteinase-2 in mice with corneal alkaline burn

Ming Lu, Jing Zhu

Citation:Lu M, Zhu J.Effect of recombinant canstatin proteins with different concentrations on the expression of matrix metalloproteinase-2 and tissue inhibitor of metalloproteinase-2 in mice with corneal alkaline burn.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(2):224-227

摘要

目的：探討不同濃度重組Canstatin蛋白對堿燒傷后小鼠角膜基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)及其組織抑制劑-2(tissue inhibitor of metalloproteinase-2，TIMP-2)表達(dá)的影響及其調(diào)節(jié)作用。

方法：BALB/c小鼠60只隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組A、實(shí)驗(yàn)B及對照組C，每組20只。采用1mol/L氫氧化鈉溶液燒傷小鼠右眼角膜，建立炎癥性角膜堿燒傷動(dòng)物模型，分別予以A組、B組重組Canstatin蛋白3μg/mL、5μg/mL點(diǎn)右眼，4次/d，對照組C組予以生理眼水點(diǎn)右眼。在堿燒傷后第1、3、7、14d以形態(tài)學(xué)分析評價(jià)角膜上皮損傷面積及新生血管生長的情況，并于堿燒傷后第1、3、7、14d應(yīng)用Western-blot檢測角膜MMP-2和TIMP-2的表達(dá)，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)對結(jié)果進(jìn)行分析。

結(jié)果：形態(tài)學(xué)分析顯示，A組和B組小鼠在堿燒傷后第3d起各時(shí)間點(diǎn)角膜上皮缺損面積均小于對照組(P<0.01)，角膜新生血管均得到抑制，CNV面積明顯小于對照組(P<0.01)。Western-blot結(jié)果顯示，堿燒傷后各時(shí)間點(diǎn)MMP-2的表達(dá)，A組和B組均明顯低于對照組(P<0.01)，TIMP-2的表達(dá)高于對照組(P<0.01)，且A組和B組間MMP-2的表達(dá)在第14d比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，TIMP-2的表達(dá)在第7d及第14d比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

結(jié)論：重組Canstatin蛋白可通過抑制角膜細(xì)胞及浸潤的炎性細(xì)胞產(chǎn)生MMP-2，促進(jìn)TIMP-2表達(dá)，從而抑制和延遲堿燒傷后角膜融解的發(fā)生和發(fā)展，對堿燒傷后角膜的重塑起著重要作用。

關(guān)鍵詞：堿燒傷；重組Canstatin蛋白；基質(zhì)金屬蛋白酶-2；基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-2

引用：魯銘，朱晶.不同濃度重組Canstatin蛋白對堿燒傷后角膜MMP-2及TIMP-2表達(dá)的影響.國際眼科雜志2016;16(2):224-227

0 引言

角膜堿燒傷是一種常見的眼表疾病，可導(dǎo)致角膜溶解、新生血管形成、潰瘍穿孔及角膜瘢痕等嚴(yán)重病理改變，嚴(yán)重影響患者視力甚至失明。近年的研究認(rèn)為，堿燒傷后角膜病變的發(fā)生發(fā)展系多種因素綜合作用的結(jié)果[1-2]，與血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)及一氧化氮(NO)等多種細(xì)胞因子的作用密切相關(guān)，一方面通過VEGF、bFGF等因子誘導(dǎo)血管生成，使得促血管生成因子和抑制因子平衡失調(diào)，從而促進(jìn)角膜新生血管(corneal neovascularization，CNV)的形成；另一方面是炎性細(xì)胞因子的激活及細(xì)胞外基質(zhì)的重建。Canstatin是新發(fā)現(xiàn)的一種Ⅳ型膠原來源的內(nèi)源性血管抑制因子，越來越多的證據(jù)顯示Canstatin不僅可以直接抑制新生血管的形成，而且對血管形成能力也具有一定的抑制作用[3]。本研究組前期業(yè)已證明，重組Canstatin蛋白對CNV形成中VEGF和bFGF的表達(dá)有明顯的抑制作用[4]，因此我們以小鼠堿燒傷為模型，通過觀察不同濃度重組Canstatin蛋白對堿燒傷后小鼠角膜中MMP-2及TIMP-2表達(dá)的影響及相互作用，進(jìn)一步探討其在堿燒傷后延遲角膜溶解、抑制角膜炎癥及新生血管形成的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組選用鼠齡為6~8周齡，體質(zhì)量15~18g，經(jīng)眼科檢查無任何眼科疾病的雌性BALB/c小鼠(武漢大學(xué)動(dòng)物中心提供)作為實(shí)驗(yàn)對象。采用隨機(jī)數(shù)字表法將動(dòng)物分為實(shí)驗(yàn)組(A組)、實(shí)驗(yàn)組(B組)及對照組(C組)，每組20只小鼠，均取右眼為實(shí)驗(yàn)眼。實(shí)驗(yàn)過程中，對動(dòng)物的喂養(yǎng)和使用遵循國家科學(xué)技術(shù)部2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》要求。

1.1.2主要試劑MMP-2、TIMP-2兔抗鼠單克隆抗體，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG均購自北京中衫金橋技術(shù)有限公司；BCATM蛋白定量試劑盒及增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光劑(enhanced chemiluminescence，ECL)購于美國Pierce公司；重組Canstatin蛋白由武漢大學(xué)藥學(xué)院提供，通過從人胎盤組織中提取總RNA，構(gòu)建克隆質(zhì)粒，分離并純化出重組Canstatin蛋白。

1.2方法

1.2.1堿燒傷模型建立60只小鼠均灼燒右眼，采用1%地卡因表面麻醉，充分暴露眼前段表面，將統(tǒng)一規(guī)格直徑2.0mm的單層圓形濾紙片浸于1mol/L氫氧化鈉溶液中，使其達(dá)飽和狀態(tài)，吸水紙吸除多余液體，將濾紙片置于暴露的小鼠角膜中央，灼燒10s，移去濾紙后，立即用生理鹽水沖洗結(jié)膜囊1min。造模后A組和B組分別給予重組Canstatin蛋白3μg/mL和5μg/mL點(diǎn)右眼，4次/d；對照組給予生理鹽水點(diǎn)右眼，4次/d。所有實(shí)驗(yàn)小鼠每日給予氯霉素眼水點(diǎn)眼3次預(yù)防感染，并給予阿托品眼膏涂眼1次。對兩組小鼠在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)(堿燒傷后第1、3、7、14d)處死前進(jìn)行裂隙燈和眼底鏡檢查，臨床評價(jià)依據(jù)角膜上皮損傷面積及測量計(jì)算角膜新生血管(corneal neovascularization，CNV)生長面積評分。上皮病變的評分標(biāo)準(zhǔn)為：0，無上皮損傷；1+，上皮損傷面積少于25%；2+，上皮損傷面積少于50%；3+，上皮損傷面積少于75%；4+，上皮損傷面積為75%~100%。計(jì)算CNV生長面積A，公式A=C/12×3.1416[r2-(r-L)2]，其中C為新生血管累及角膜的圓周鐘點(diǎn)數(shù)，L為新生血管從角膜緣伸入角膜的長度，r為角膜半徑。

1.2.2 Western-blot檢測小鼠堿燒傷后角膜MMP-2及TIMP-2的表達(dá)于各時(shí)間點(diǎn)(堿燒傷后第1、3、7、14d)頸椎脫臼法處死小鼠，其中每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各5只小鼠。取出小鼠角膜片，-80℃保存。采用組織裂解液裂解角膜組織后離心取上清，用BCATM蛋白定量試劑盒測定蛋白總量。各取15μg不同時(shí)間點(diǎn)角膜樣本按4∶1加入上樣緩沖液，100℃，3min變性。在非還原狀態(tài)下行10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)2h后(4℃，電壓120V)，電泳法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上(110mA，2h)，封閉液(50mL封閉液：1×TBS 50mL；Tween 0.25mL；脫脂奶粉2.5g)室溫下封閉硝酸纖維素濾膜的非特異性免疫球蛋白結(jié)合位點(diǎn)1h，將濾膜與單克隆第一抗體(1∶1000稀釋于封閉液)孵育4℃搖動(dòng)過夜，TBST緩沖液(1×TBST 150mL：10×TBS 15mL；超純水135mL；Tween 0.15mL)沖洗濾膜3次后，將濾膜轉(zhuǎn)移至HRP耦聯(lián)的第二抗體中(1∶1000稀釋于封閉液)室溫孵育1h。TBST緩沖液再次沖洗濾膜后，用ECL發(fā)光試劑與硝酸纖維素膜作用3min后在暗室曝光，X線顯影。所得條帶經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)分析得到的灰度值(OD)。

2 結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)組與對照組的臨床評價(jià)觀察對照組，BALB/c小鼠在堿燒傷后即可見角膜中央有一與濾紙片直徑相同的灰白色混濁區(qū)，第1d 可見角膜上皮水腫及缺損；第3d可見角膜基質(zhì)混濁、局部潰瘍形成，部分新生血管長入透明角膜；第7d可見角膜基質(zhì)壞死、局部潰瘍、新生血管化；在第14d可見嚴(yán)重的角膜基質(zhì)炎性浸潤、壞死及顯著的新生血管及潰瘍形成，1眼角膜穿孔。觀察實(shí)驗(yàn)組，A組小鼠在堿燒傷后第1d角膜上皮見少許缺損，輕度水腫，未見新生血管；2d后角膜炎癥反應(yīng)較對照組減輕，角膜緣新生血管稀疏；第7、14d見新生血管長入，其中2眼超過角膜半徑，但角膜上皮缺損及新生血管形成較對照組顯著減少。B組第1d角膜上皮見少許缺損，輕度水腫；第3d見角膜水腫略加重，但未見明顯新生血管形成；第7d及第14d見新生血管長入，但未見越過瞳孔緣。堿燒傷后各時(shí)間點(diǎn)各實(shí)驗(yàn)組角膜上皮缺損及CNV面積均較對照組小(F=8.226，P=0.002；F=12.049，P=0.000；F=13.352，P=0.000)，角膜上皮缺損面積在第7d及14d時(shí)A組和B組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.588，P=0.029；t=3.245，P=0.004)，CNV面積在第14d時(shí)A組和B組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.198，P=0.033；表1，2)。

2.2 小鼠堿燒傷后角膜MMP-2及TIMP-2的表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖1)顯示在對照組，第0d角膜中MMP-2僅有微弱表達(dá)，在第1d表達(dá)增強(qiáng)，隨后表達(dá)逐漸增強(qiáng)，于第14d達(dá)峰值；TIMP-2早期僅有微弱表達(dá)，第2d表達(dá)略增強(qiáng)，早期變化不明顯，之后逐漸增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)組第2d MMP-2陽性表達(dá)較對照組即開始減弱，各時(shí)間點(diǎn)MMP-2的表達(dá)均低于對照組，其差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；TIMP-2陽性表達(dá)增強(qiáng)，各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)均明顯高于對照組，其差異均有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)組TIMP-2的表達(dá)水平隨重組Canstatin蛋白濃度的增加而升高，其中在第7d和14時(shí)A組與B組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而A組在堿燒傷后早期(第3~7d)抑制MMP-2與B組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，僅在第14d 兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。掃描的灰度值見表3(灰度值的設(shè)置白色是255，黑色是0，因此Western-blot條帶所得到的灰度值越小，說明樣品含量越高)。

3 討論

眼外傷(尤其是化學(xué)傷)引起的角膜盲已成為眼科學(xué)目前面臨最突出的問題之一，其中以堿燒傷最為嚴(yán)重，盡管在種種努力下其致盲率仍居高不下。已有研究顯示由于中性粒細(xì)胞的浸潤，活化及其釋放的蛋白水解酶(包括基質(zhì)金屬蛋白酶)可降解角膜基質(zhì)，并最終導(dǎo)致角膜潰瘍穿孔[5]?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一族能降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)及基底膜成分的內(nèi)源性蛋白裂解酶，受其組織型抑制劑(TIMPs)的調(diào)節(jié)，參與角膜組織重建并在角膜瘢痕形成中起著重要作用[6]。根據(jù)作用底物不同，MMPs可分為膠原酶、明膠酶、基質(zhì)溶素和膜型金屬蛋白酶四大類，其中MMP-2屬于明膠酶類，能降解明膠、Ⅳ型及Ⅴ型膠原和彈性蛋白[7]。MMPs不僅由角膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，同時(shí)MMPs還受多種細(xì)胞因子的調(diào)控，IL-1，IL-6，TNF-α等可促進(jìn)MMPs的表達(dá)。TIMPs是組織中主要的內(nèi)源性MMP活性調(diào)節(jié)子，通過與MMPs形成1∶1的復(fù)合物抑制MMPs的活化及酶解活性[8]，它的表達(dá)在生理狀態(tài)和組織的重塑中被嚴(yán)密地控制以保持細(xì)胞外模板的代謝平衡。研究顯示，TIMPs對已知的所有MMP均有抑制作用，其中TIMP-2是最主要的調(diào)節(jié)因素，MMP-2與TIMP-2的調(diào)節(jié)平衡是保持細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)穩(wěn)定及完整性的前提條件。

Canstatin是Kamphaus發(fā)現(xiàn)的一種新的血管生成抑制因子，目前在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Canstatin具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增生和遷移，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，抑制新生血管基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的降解和更新，最終抑制新生血管生成的作用[9]。我們研究中發(fā)現(xiàn)，堿燒傷后第1~3d角膜上皮缺損，局部開始出現(xiàn)潰瘍灶，第4~7d新生血管生長最明顯，第7d開始基質(zhì)炎癥反應(yīng)明顯加重，局部壞死甚至出現(xiàn)角膜穿孔等癥狀。通過Western-blot分析發(fā)現(xiàn)角膜MMP-2的表達(dá)在堿燒傷后24h開始增加，尤其是角膜潰瘍形成后潰瘍處可見MMP-2表達(dá)顯著增加，隨后表達(dá)逐漸增強(qiáng),于第14d達(dá)峰值，說明MMP-2表達(dá)的升高和角膜病變的嚴(yán)重程度是相對應(yīng)的。已有研究顯示小鼠堿燒傷后角膜細(xì)胞及浸潤的炎性細(xì)胞可直接分泌產(chǎn)生MMP-2[9]；而早期TIMP-2的表達(dá)并不明顯，不足以抑制MMP-2的活性，證明MMP-2在堿燒傷早期積極參與了角膜組織的溶解破壞，通過破壞降解ECM促進(jìn)新生血管及角膜潰瘍的形成。

表1　小鼠堿燒傷后各時(shí)間點(diǎn)角膜上皮損傷面積±s，mm2)

注：bP<0.01vsC組；cP<0.05vsA組；A組：重組Canstatin蛋白3μg/mL組；B組：重組Canstatin蛋白5μg/mL組；C：對照組。

表2　小鼠堿燒傷后各時(shí)間點(diǎn)CNV面積，mm2)

注：bP<0.01vsC組；cP<0.05vsA組； A組：重組Canstatin蛋白3μg/mL組；B組：重組Canstatin蛋白5μg/mL組；C：對照組。

圖1小鼠堿燒傷后角膜MMP-2及TIMP-2的表達(dá)A組：重組Canstatin蛋白3μg/mL組；B組：重組Canstatin蛋白5μg/mL組；C：對照組。

實(shí)驗(yàn)組在堿燒傷后角膜上皮損傷及CNV形成較對照組明顯減少，MMP-2的表達(dá)在堿燒傷后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均有明顯下降(P<0.01)，而TIMP-2的表達(dá)顯著增加，且實(shí)驗(yàn)組角膜潰瘍的嚴(yán)重程度也顯著降低。Wang等[10]研究發(fā)現(xiàn)堿燒傷小鼠模型行Canstatin治療后第7d，ELISA測定角膜TNF-α含量明顯降低，這也與我們的研究結(jié)果相一致。由此推測，重組Canstatin蛋白可能是通過促進(jìn)角膜中TIMP-2的表達(dá)而抑制MMP-2的生成及活化，降低了MMP-2與TIMP-2的表達(dá)比例，抑制ECM含量的降低和組織結(jié)構(gòu)的弱化，同時(shí)下調(diào)了某些細(xì)胞因子(如IL-1、TNF-α等)，直接或間接增加TIMPs的活性及表達(dá)，延遲細(xì)胞外基質(zhì)的降解，防止或延緩角膜潰瘍的發(fā)生發(fā)展，抑制角膜新生血管的形成。同時(shí)我們研究中也發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組TIMP-2的表達(dá)水平隨重組Canstatin蛋白濃度的增加而升高，其中在第7d和14d時(shí)A組與B組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而A組在堿燒傷后早期(第3~7d)抑制MMP-2與B組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，B組在第14d MMP-2含量明顯降低，A組和B組間比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示3μg/mL重組Canstatin蛋白在堿燒傷后早期明顯抑制MMP-2，但其有效性不足以維持到傷后第14d，因此必須達(dá)到某個(gè)閾值才能起到連續(xù)抑制的作用，可能有濃度依賴關(guān)系。

表3　小鼠不同時(shí)間點(diǎn)角膜組織中MMP-2 和TIMP-2條帶灰度值分析±s

注：bP<0.01vsC組；cP<0.05vsA組； A組：重組Canstatin蛋白3μg/mL組；B組：重組Canstatin蛋白5μg/mL組；C：對照組。

本研究認(rèn)為，堿燒傷后角膜病變的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的病理過程，MMP-2與TIMP-2在角膜組織中比例失衡可能只是各因素綜合作用的結(jié)果或是其中的環(huán)節(jié)之一。我們研究發(fā)現(xiàn)，重組Canstatin蛋白在堿燒傷后早期可有效抑制明膠酶MMP-2表達(dá)，增加TIMP-2的表達(dá)，可能通過對MMP-2/TIMP-2的調(diào)節(jié)有效地抑制角膜炎癥反應(yīng)，降低角膜潰瘍及新生血管的形成，并促進(jìn)修復(fù)過程，減少角膜血管化、角膜穿孔等并發(fā)癥的發(fā)生，對堿燒傷后角膜潰瘍及瘢痕愈合、保護(hù)視力具有重要意義，但對其調(diào)節(jié)MMP-2和TIMP-2之間平衡的具體機(jī)制，尚有待于進(jìn)一步研究。

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·實(shí)驗(yàn)論著·

Department of Ophthalmology,Wuhan No.1 Hospital, Wuhan 430022, Hubei Province, China

Correspondence to:Jing Zhu. Department of Ophthalmology, Wuhan No.1 Hospital, Wuhan 430022, Hubei Province, China. anitta777@163.com

Received：2015-10-16Accepted：2016-01-18

Abstract

?AIM: To investigate the effect of recombinant canstatin proteins with different concentration on the expressions of matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and tissue inhibitor of metalloproteinase-2 (TIMP-2) in mice with corneal alkali burn.

?METHODS: Sixty BALB/c mice were divided into three groups (experimental group A, experimental group B and control group C) , 20 mice in every group and their corneas in the right eyes were burned with alkali (1mol/L NaOH). The experimental group A received recombinant canstatin proteins drops with 3μg/mL. The experimental group B received recombinant canstatin proteins drops with 5μg/mL and the control group C was treated with physiologic saline. At different time points (1, 3, 7 and 14 d) after alkali burns, the mice were killed and the growth of epithelial defect and corneal neovascularization (CNV) were observed with an operation microscope. The expressions of MMP-2 and TIMP-2 in cornea were measured by the Western blot technique, and the results were analyzed by enhanced chemiluminescent (ECL).

?RESULTS: The areas of epithelial defect and corneal neovasularization significantly reduced in mice treated with recombinant canstatin proteins compared to mice treated with physiologic saline at 3, 7 and 14d after alkali-induced injury ( allP<0.01); the neovasularization was suppressed and the area of CNV was less than that in control group C (allP<0.01). Western blot analysis showed that the expression levels of MMP-2 in experimental group A and B were significantly lower than that in control group C (P<0.01) and the expressions of TIMP-2 in experimental group A and B were significantly higher (P<0.01); the level of MMP-2 in experimental group B were lower than that in experimental group A on day 14 (P<0.05), while the level of TIMP-2 in experimental group B were significantly higher than that in experimental group A on day 7 and day 14 (P<0.05).

?CONCLUSION: Recombinant canstatin proteins may suppress the expression of MMP-2, upregulate the expression of TIMP-2 in cornea cells and the infiltrated inflammatory cells, lower the rapid resolution of cornea and ulceration, and play a vital role in the remodeling of alkali treated cornea in mice.

KEYWORDS:?alkali burn; recombinant canstatin protein; matrix metalloproteinase-2; tissue inhibitor of metalloproteinase-2

DOI:10.3980/j.issn.1672-5123.2016.2.06

收稿日期：2015-10-16 修回日期： 2016-01-18

通訊作者：朱晶，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：角膜及眼底病.anitta777@163.com

作者簡介：魯銘，畢業(yè)于同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)，副主任醫(yī)師，研究方向：白內(nèi)障、眼表及淚器疾病。