王　楊，李　錚，曹向紅，付曉野，高　輝，趙思涵

(昆明市延安醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南昆明 650051)

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·論著·

2014年昆明某三甲醫(yī)院手足口病病原及流行特征分析*

王楊，李錚，曹向紅，付曉野，高輝△，趙思涵

(昆明市延安醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南昆明 650051)

摘要:目的對2014年昆明市延安醫(yī)院就診的手足口病(HFMD)病例進(jìn)行回顧性分析總結(jié)，了解其病原分布及流行病學(xué)特點(diǎn)。方法應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR對130例手足口病臨床診斷病例的糞便標(biāo)本進(jìn)行病毒核酸檢測，并對其年齡分布特點(diǎn)、季節(jié)分布情況進(jìn)行分析。結(jié)果非重復(fù)性的130例臨床診斷病例中，病原陽性檢出79例，總陽性率為62.2%，其中EV71占檢出病原的5.1%(4/79)，CA16占檢出病原的17.7%(14/79),其他型占77.2%(61/79)。4個年齡組中，1～3歲組和3～6歲組高于0～1歲、>6歲組，4年齡組間陽性率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。5～7月為HFMD發(fā)病高峰期，在全年發(fā)病例數(shù)及全年陽性檢出例數(shù)的構(gòu)成比中均為最高，8月開始發(fā)病例數(shù)有減少趨勢，但12月又有所增加。結(jié)論手足口病5～7月為發(fā)病高峰期，以6月為最高；發(fā)病率以幼兒及學(xué)齡前兒童(2～6歲)為最高。

關(guān)鍵詞:手足口病；腸道病毒71 型；柯薩奇病毒A16 型

手足口病(hand-foot-and-mouth disease，HFMD) 是由多種腸道病毒(enteroviruses，EV) 引起的一種常見傳染病，病毒類型有20 多種，其中腸道病毒71 型(EV71)和柯薩奇病毒A16 型(CoxA16) 為最主要的病原體[1]。手足口病嚴(yán)重威脅兒童健康，近年來，其發(fā)病例數(shù)更是高居丙類傳染病之首。本文采用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法(real time quantitative PCR，RT-PCR)對送檢標(biāo)本進(jìn)行病毒核酸分型檢測，并將病原構(gòu)成、年齡分布情況及季節(jié)流行特點(diǎn)等資料進(jìn)行匯總分析，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料非重復(fù)的HFMD臨床診斷病例130例，男75例，女55例，最小的5月齡，最大11歲。來源于2014年1月至2014年12月期間于昆明市延安醫(yī)院就診的門診及住院患者。診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《手足口病預(yù)防控制指南(2010年版)》。

1.2儀器與試劑儀器：ABI StepOne實(shí)時熒光定量PCR儀；試劑：中山大學(xué)達(dá)安基因有限公司提供的腸道病毒通用型(EV)、EV71型和CoxA16型RT-PCR檢測試劑盒。

1.3 方法

1.3.1標(biāo)本采集與保存采集患者發(fā)病3日內(nèi)的糞便樣本(5～8 g/份)，采集后立即放入無菌采集管內(nèi)。標(biāo)本可立即用于測試，也可保存于-20 ℃待測。

1.3.2樣本處理與RNA提取水樣糞便樣本混勻后備用；較干糞便樣本加入適量生理鹽水充分混勻后備用。在1.5 mL的無菌離心管內(nèi)加入50 μL的蛋白酶K；取200 μL樣品加入離心管中；再加入200 μL裂解工作液，蓋緊管蓋，漩渦振蕩15 s，高速離心10 s，72 ℃ 10 min，然后加入250 μL乙醇，蓋緊管蓋，漩渦振蕩15 s；將混合液全部吸至離心柱，室溫下12 000×g離心1 min，將離心柱裝至新的收集管；將500 μL抑制物去除液加入離心柱，室溫下12 000×g離心1 min，將離心柱裝至新的收集管；再次將500 μL抑制物去除液加入離心柱，室溫下12 000×g離心1 min，將離心柱裝至新的收集管；將離心柱-收集管于室溫下14 000 g離心3 min；將離心柱取出，放置于新1.5 mL離心管，打開離心柱蓋子，72 ℃放置2 min以除去殘余的乙醇；在離心柱膜的正上方加入72 ℃預(yù)熱的洗脫液50 μL，蓋緊管蓋，室溫靜置1 min，14 000×g離心1 min，離心管內(nèi)即為核酸溶液，可用于檢測。

1.3.3PCR擴(kuò)增取N個(N=陰性質(zhì)控品+待測樣本+陽性質(zhì)控品)PCR反應(yīng)管，每管分別加入RT-PCR反應(yīng)液15 μL、逆轉(zhuǎn)錄酶系2 μL、Taq酶系3 μL，于上述PCR管中分別加入處理后的陰性質(zhì)控品、待測樣本核酸溶液、陽性質(zhì)控品5 μL，3 000 r/min離心30 s，放入PCR擴(kuò)增儀。熱循環(huán)參數(shù)為40 ℃ 25 min，1個循環(huán)；94 ℃ 3 min，1個循環(huán)；93 ℃ 15 s，55 ℃ 45 s，40個循環(huán)。

1.3.4結(jié)果判斷每次實(shí)驗(yàn)均檢測陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品，質(zhì)控品結(jié)果滿足質(zhì)量控制要求時方進(jìn)行檢測結(jié)果的判定。陽性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：擴(kuò)增曲線呈典型S型擴(kuò)增曲線，且Ct值小于或等于34.8。陰性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：無典型S型擴(kuò)增曲線或Ct值大于34.8。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理本研究數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件統(tǒng)計，組間陽性率的比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1HFMD腸道病原及年齡分布情況2014年130例非重復(fù)性臨床診斷病例中，檢出EV陽性79例，其中EV71 4例，CA16 14例，其他型61例，陽性率分別為3.1%、10.8%、46.9%。0～1歲組陽性率為41.4%；1～3歲組、3～6歲組陽性率分別為69.1%、67.5%；>6歲組陽性率為33.3%。4個年齡組中，1～3歲組和3～6歲組高于0～1歲、>6歲組，4年齡組間陽性率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。各年齡組病原感染陽性率見表1。

表1　　各年齡組病原檢測陽性構(gòu)成情況[n(%)]

χ2=8.826，P=0.03。

2.2HFMD的流行季節(jié)分布特點(diǎn)2014年本院非重復(fù)性手足口病臨床診斷病例130例中，5月、6月和7月發(fā)病例數(shù)最多，在全年發(fā)病例數(shù)構(gòu)成比中分別占16.9%、26.9%和20.0%，8月起發(fā)病例數(shù)有減少趨勢，但12月又出現(xiàn)升高。另從EV檢測的陽性例數(shù)來看，5～7月的陽性例數(shù)在全年陽性檢出總數(shù)中也是最多，分別占12.7%、32.9%和20.2%。8月開始陽性檢出例數(shù)減少，12月又有所增加。各月份發(fā)病例數(shù)及EV陽性檢出例數(shù)在全年中的構(gòu)成情況見表2。

表2　　各月份發(fā)病例數(shù)及陽性檢出例數(shù)的構(gòu)成情況[n(%)]

3討論

HFMD是由多種腸道病毒感染引起的丙類傳染病，其中EV71與CA16為其主要病原體，不同地區(qū)的病原流行情況有一定的差異。山東濟(jì)南的研究者發(fā)現(xiàn)，138例重癥HFMD病例中，陽性檢出率為95.65%，其中EV71占86.36%；CA16占6.52%，其他型占6.52%[2]。武漢陽邏地區(qū)研究表明，2008至2011年EV71型的比例逐年增加，至2011年達(dá)高峰[3]。昆明地區(qū)2010～2012年研究報告，病原體以EV7l型(44.0%)和CA16型(41.0%)為主[4]。浙江寧波報道2008～2013年EV71陽性率呈現(xiàn)下降趨勢，其他腸道病毒陽性率呈增長趨勢[5]。

本院于2014年收治的HFMD臨床診斷病例130例中，腸道病毒陽性檢出79例，陽性率為(62.2%)，其中EV71占檢出病原的5.1%(4/79)，CA16占檢出病原的17.7%(14/79),其他型占77.2%(61/79)?；谝陨喜±M(jìn)行的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，其他型腸道病毒才是HFMD的主要病原，而CA16及EV71所占比例不高。此結(jié)果與上述山東、武漢、昆明的報道存在較大差異，而與浙江寧波報道的HFMD病原變化趨勢有相似之處。原因可能是以下3點(diǎn)：(1)地區(qū)差異；(2)本組數(shù)據(jù)只統(tǒng)計了2014年度本院的HEMD臨床診斷病例及檢測情況，標(biāo)本量較少，代表性有限；(3)或許是近年病原構(gòu)成發(fā)生了變化。為此，將繼續(xù)跟進(jìn)研究以驗(yàn)證病原構(gòu)成情況。

國內(nèi)同行前期研究成果表明，HFMD有一定的季節(jié)性流行特點(diǎn)，其發(fā)病數(shù)與溫度及濕度呈正相關(guān)。如鄭州地區(qū)HFMD流行集中于3～7月份，4～5月份達(dá)到高峰[7]。浙江蒼南縣發(fā)病高峰3月份開始，至7月份下降[6]。在北京，高溫多雨的夏季是HFMD的高發(fā)季節(jié)[8]。

但在本研究中卻得出了與上述地區(qū)有所不同的結(jié)果。此次研究顯示，5～7月為HFMD的發(fā)病高峰期，發(fā)病例數(shù)及陽性例數(shù)在全年構(gòu)成比中均最高，尤以6月份為最。8月開始病例數(shù)有減少趨勢，但到12月又有所增加，1～3月發(fā)病率降至全年最低。昆明地區(qū)的HFMD在夏、冬兩季出現(xiàn)2次流行，這主要是和昆明的地理及氣候因素有關(guān)。昆明位于云貴高原，海拔近2 000米，所處緯度較低，屬于典型的亞熱帶低緯高原山地季風(fēng)氣候。夏季盛行濕潤的海洋季風(fēng)，冬季盛行干燥的大陸季風(fēng)。夏無酷暑，冬無嚴(yán)寒，氣候呈現(xiàn)四季如春的鮮明特色，其溫暖濕潤的環(huán)境正好適合腸道病毒的生存與傳播。

同時，HFMD有顯著的年齡分布特點(diǎn)。北京地區(qū)的患者主要集中在10歲以下兒童，其中5歲以下發(fā)病最多，其次為5～9歲年齡段[9]。浙江麗水的患者以學(xué)齡前為主，主要集中在0～5歲，以1歲組發(fā)病最高[10]。貴州畢節(jié)的HFMD病例中，0～6歲患兒占92.94%，而3歲及以下的幼兒占66.37%[11]。昆明的HFMD患者39.46%為嬰幼兒，7歲以下兒童占97.90%[12]。

本組資料分析顯示，在該病流行期間，2～3歲組及4～6歲組的發(fā)病例數(shù)和陽性檢出率都較高，陽性率分別為69.1%、67.5%，反映出幼兒與學(xué)齡前兒童更易感染該病。這與本地區(qū)手足口病流行病學(xué)的相關(guān)文獻(xiàn)報道相符[12-13]。造成手足口病易感年齡分布這一特點(diǎn)的原因可能是：一方面，幼兒的抵抗力相對較弱；另一方面，這兩個年齡段的兒童多集中于幼兒園，容易發(fā)生相互交叉?zhèn)魅尽?/p>

近年來，手足口病的發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢，應(yīng)密切監(jiān)控其病原及流行情況的進(jìn)展變化。為了兒童的健康，相關(guān)機(jī)構(gòu)要積極開展健康宣傳教育與防治，改善環(huán)境衛(wèi)生狀況，及時發(fā)現(xiàn)疫情并隔離；家長要在HFMD流行季節(jié)，盡量避免帶幼兒到人群密集、空氣不流通的公共場所活動。

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Analysis on etiology and epidemiological characteristics of hand-foot-mouth disease

in a class 3A hospital in Kunming during 2014*

WangYang,LiZheng,CaoXianghong,FuXiaoye,GaoHui△,ZhaoSihan

(DepartmentofClinicalLaboratory,KunmingYananHospital,Kunming,Yunnan650051,China)

Abstract:ObjectiveTo retrospectively analyze and summarize the children cases of hand，foot and mouth disease(HFMD) in our hospital during 2014 for understanding its etiological distribution and epidemiological characteristics.MethodsThe stool samples in children cases of clinically diagnosed HFMD were collected and performed the viral nucleic acid detection.The age distribution characteristics,season distribution situation were analyzed.ResultsAmong 130 cases of non-repetitively clinically diagnosed HFMD,the pathogen positive detection was in 79 cases with the total positive rate of 62.2%,in which EV71 accounted for 5.1%(4/79) of detected pathogens,CA16 accounted for 17.7%(14/79) and the other types accounted for 77.2%(61/79).In 4 age groups,the positive detection rate in the 1-3 years old group and the 3-6 years old group was higher than that in the 0-1 years old group and the >6 years old group,the positive detection rate had statistical difference among 4 age groups(P<0.05).May to July was the peak period of HFMD onset,its constituent ratio to the full year onset cases and full year positive detection cases was highest.The onset cases number of HFMD began to reduce in August,but it increased again in December.ConclusionMay to July is the peak period of HFMD onset,especially in June.The incidence rate of HFMD is highest in infants and preschool children (2-6 years old).

Key words:hand-foot-mouth disease;enterovirus type 71;Coxsackie virus A16

(收稿日期：2015-07-18)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.01.004

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)01-0008-03

*基金項(xiàng)目：云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(2014FB080)

作者簡介：王楊，女，副主任醫(yī)師，主要從事分子生物學(xué)檢驗(yàn)研究。△通訊作者，E-mail：kathy7227@sina.com。