蔡敏敏，顧曉瓊，高　飛，邱先桃，陳小娟，劉　非，鄭　浩

(廣州市婦女兒童醫(yī)療中心檢驗(yàn)科，廣東廣州 510623)

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·論著·

分離外周血單個(gè)核細(xì)胞的條件優(yōu)化*

蔡敏敏，顧曉瓊△，高飛，邱先桃，陳小娟，劉非，鄭浩

(廣州市婦女兒童醫(yī)療中心檢驗(yàn)科，廣東廣州 510623)

摘要:目的比較不同抗凝劑、離心力及離心時(shí)間對(duì)葡聚糖-泛影葡胺(Ficoll)密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞的影響，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案。方法取肝素、EDTA及2種抗凝劑混合后的3種不同抗凝血，采用Ficoll法進(jìn)行分離，用血細(xì)胞分析儀進(jìn)行分類和計(jì)數(shù)，計(jì)算回收率和純度；同時(shí)對(duì)EDTA抗凝血進(jìn)行不同離心力及離心時(shí)間的處理，優(yōu)化分離效果。結(jié)果EDTA組獲得PBMC回收率為(51.32±50.21)%，純度為(45.38±22.14)%；肝素組獲得PBMC回收率為(24.52±19.10)%，純度為(78.46±11.91)%；EDTA+肝素組獲得PBMC回收率為(56.32±24.30)%，純度為(80.27±12.44)%。經(jīng)單因素方差分析，PBMC回收率方面，EDTA組與肝素組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，EDTA組回收率較高，而肝素+EDTA組與EDTA組回收率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；PBMC純度方面，EDTA組與肝素組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，肝素組PBMC純度較高，而肝素+EDTA組與肝素組比較，純度則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；PBMC存活率方面，肝素+EDTA組與肝素組、EDTA組比較，均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對(duì)EDTA抗凝血進(jìn)行單個(gè)核細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)表明，在離心力為600×g(1 800 r/min)，離心時(shí)間為25 min時(shí)分離效果最佳。結(jié)論肝素+EDTA組回收率、純度與單種抗凝劑實(shí)驗(yàn)組相比，結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，故在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可以混合兩種抗凝全血進(jìn)行細(xì)胞分離。EDTA抗凝血在離心力為600 g(1 800 r/min)、離心時(shí)間為25 min時(shí)，分離單個(gè)核細(xì)胞效果最佳。

關(guān)鍵詞:單個(gè)核細(xì)胞;Ficoll連續(xù)密度梯度離心法;抗凝劑；分離效果

外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，PBMC常用于細(xì)胞培養(yǎng)及藥物敏感試驗(yàn)等臨床科研項(xiàng)目，故對(duì)于實(shí)驗(yàn)室研究具有重要價(jià)值。隨著單個(gè)核細(xì)胞在先天免疫激活、獲得性免疫調(diào)節(jié)、人免疫缺陷病毒感染及自身免疫疾病等生理、病理過(guò)程中的作用被逐漸揭示，其生物學(xué)功能受到了越來(lái)越多的關(guān)注[1]。目前分離PBMC的方法很多，各有利弊[2-5],如分離的過(guò)程較繁瑣、耗材較多、細(xì)胞分層效果及分離率欠理想等,但主要的分離方法是葡聚糖-泛影葡胺(Ficoll)密度梯度離心法，相對(duì)于分離效果更好的Percoll非連續(xù)密度梯度離心法，F(xiàn)icoll離心法由于價(jià)格實(shí)惠及操作簡(jiǎn)便的原因顯得更為常用[6]。筆者通過(guò)研究EDTA抗凝血在不同離心力及離心時(shí)間作用下單個(gè)細(xì)胞核的分離，旨在摸索外周血單個(gè)核細(xì)胞最佳分離條件。與此同時(shí)鑒于某些疾病的全血標(biāo)本取材不便，臨床標(biāo)本的肝素全血量未能滿足單個(gè)核細(xì)胞的分離，通過(guò)探討其他抗凝全血單個(gè)核細(xì)胞的分離效果，以便擴(kuò)展全血標(biāo)本獲取途徑。

1材料與方法

1.1材料隨機(jī)抽取廣州市婦女兒童醫(yī)療中心珠江新城院區(qū)全血標(biāo)本60例，按肝素、EDTA、EDTA+肝素混合抗凝血標(biāo)本分為3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組20例，相互對(duì)照。時(shí)間要求為采血后3 h內(nèi)，其性別、年齡、體質(zhì)量等無(wú)特殊要求。

1.2儀器與試劑上海申力儀器公司HF sabl200生物安全柜，白洋離心機(jī)廠的BFX5-320型低速自動(dòng)平衡離心機(jī)，美國(guó)sysmex-5000血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，以及4%臺(tái)盼藍(lán)染液、牛鮑計(jì)數(shù)板、人淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)驦TS1077)、Hanks液和改良型5%小牛血清培養(yǎng)液。

1.3方法

1.3.1取EDTA抗凝、肝素抗凝、EDTA+肝素混合抗凝血各20例，共60例待測(cè)抗凝全血進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè)，記錄其單個(gè)核細(xì)胞總數(shù)。

1.3.2取新鮮(肝素、EDTA、EDTA+肝素混合抗凝血)抗凝全血2 mL，加入等量hanks液，充分混勻后，傾斜疊加于等量密度為1.077±0.001的Ficoll分離液，使兩者形成一個(gè)清晰的界面。500 r/min離心15 min后，用吸管吸出中層白色云霧狀細(xì)胞，加入含4 mL hanks液混勻1 500 r/min 10 min，重復(fù)洗滌2次。去上清液，于沉淀細(xì)胞加入改良型5%小牛血清PRMI-1640培養(yǎng)基2 mL，配成細(xì)胞懸液，混勻，吸取100 μL置于離心管中。

1.3.3取離心管中細(xì)胞血液進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè)，再次計(jì)數(shù)其單個(gè)核細(xì)胞總數(shù)，記錄其純度。

1.3.4上機(jī)后于離心管中加入100 μL 4%臺(tái)盼藍(lán)染液，混勻，靜置3 min后吸取10 μL加入牛鮑板上，于顯微鏡下計(jì)算4個(gè)大方格內(nèi)活細(xì)胞率。死細(xì)胞可被染成深色，活細(xì)胞不著色。在顯微鏡下計(jì)數(shù)，得出活細(xì)胞的總數(shù)和死細(xì)胞的總數(shù)，計(jì)算出活細(xì)胞的比例：活細(xì)胞百分率=活細(xì)胞數(shù)/(活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù))×100%

1.3.5取EDTA抗凝血每組10例按照2.2、2.3步驟分離單個(gè)核細(xì)胞，但在離心時(shí)間固定20 min，將離心力調(diào)到1 000 r/min，計(jì)算各血型的活細(xì)胞比例。依次類推，將離心力分別調(diào)到1 400、1 800、2 000、2 300和2 500 r/min 重做上述實(shí)驗(yàn)，同樣計(jì)算出活細(xì)胞比例。

1.3.6取EDTA抗凝血每組10例按照2.2、2.3步驟分離單個(gè)核細(xì)胞，但在離心力固定1 800 r/min，將離心時(shí)間調(diào)為10 min，計(jì)算各血型的活細(xì)胞比例。依次類推，將離心時(shí)間分別調(diào)為15、20、25、30和40 min，重做上述實(shí)驗(yàn)，同樣計(jì)算出活細(xì)胞比例。

2結(jié)果

2.1不同抗凝劑分離單個(gè)核細(xì)胞回收率、純度、細(xì)胞存活率，見(jiàn)表1。

表1　　不同抗凝劑分離單個(gè)核細(xì)胞回收率、純度

由表1可見(jiàn)，回收率方面：EDTA組與肝素組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，EDTA組回收率較高，而肝素+EDTA組與EDTA組回收率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；純度方面：EDTA組與肝素組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，肝素組PBMC純度較高，而肝素+EDTA組與肝素組比較，純度則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；細(xì)胞存活率方面：EDTA+肝素組與肝素組、EDTA組比較，細(xì)胞存活率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2不同離心力外周血單個(gè)核細(xì)胞分離結(jié)果在相同離心時(shí)間下(20 min)，不同離心力外周血單個(gè)核細(xì)胞分離后結(jié)果顯示，離心力為1 800 r/min時(shí)，EDTA抗凝血單個(gè)核細(xì)胞活細(xì)胞比率最高。

2.3不同離心時(shí)間外周血單個(gè)核細(xì)胞分離結(jié)果在最佳離心力1 800 r/min下，不同離心時(shí)間外周血單個(gè)核細(xì)胞分離后結(jié)果顯示，離心時(shí)間為25 min時(shí)，EDTA抗凝血單個(gè)核細(xì)胞活細(xì)胞比率最高。綜上結(jié)果表明，EDTA抗凝血中，在離心力為1 800 r /min，離心時(shí)間為25 min時(shí)，分離單個(gè)核細(xì)胞效果最佳。

3討論

分離PBMC是臨床科研的常規(guī)工作，F(xiàn)icoll作為傳統(tǒng)分離單個(gè)核細(xì)胞的方法，通過(guò)不同顆粒之間存在沉降系數(shù)差，在一定離心力作用下，顆粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同區(qū)域上形成區(qū)帶，從而獲取目的細(xì)胞[7-8]。理想狀態(tài)下，F(xiàn)icoll離心法獲取單個(gè)核細(xì)胞的得率為80%～90%，細(xì)胞純度90%以上。但實(shí)際操作中，由于實(shí)驗(yàn)室設(shè)備、環(huán)境因素及實(shí)驗(yàn)操作人員的原因，分離效果往往未能達(dá)到理想標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)，部分實(shí)驗(yàn)室由于未能得到充足的血液樣品而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)進(jìn)展緩慢甚至停滯不前。

吳鵬等[5]的研究表明采用Hanks液作為沉淀細(xì)胞的稀釋液，離心結(jié)束后能在離心液體的上部形成一個(gè)界面清晰的細(xì)胞層露，因而使得分離效果明顯增強(qiáng)，故本研究采用的稀釋液為Hanks液。與此同時(shí)，本研究采用顧曉瓊等提出的Ficoll一步法分離獲得PMBC，回收率及純度方面較Ficoll兩步法分離效果顯著。關(guān)于PMBC回收率及純度方面，本實(shí)驗(yàn)對(duì)肝素組、EDTA組以及兩者混合后的3組不同抗凝劑進(jìn)

行了比較。由于肝素組標(biāo)本為離心后標(biāo)本，離心過(guò)程中細(xì)胞會(huì)有破裂，再經(jīng)過(guò)多次的洗滌和分離后，細(xì)胞損失的較多，導(dǎo)致回收率不如EDTA組未離心的標(biāo)本結(jié)果理想，但單個(gè)核細(xì)胞的純度比EDTA組高。而細(xì)胞存活率方面，3組單個(gè)核細(xì)胞的存活率無(wú)明顯差異，與傳統(tǒng)方法獲得的細(xì)胞存活率水平相當(dāng)，均在90%以上。故肝素+EDTA混合組單個(gè)核細(xì)胞則無(wú)論從回收率、純度以及細(xì)胞存活率方面，都與單種抗凝劑結(jié)果無(wú)差異，故可將兩種不同抗凝劑的血互相混合，從而增加了分離單個(gè)核細(xì)胞的原始血量，提高了單個(gè)核細(xì)胞的產(chǎn)出，為下一步實(shí)驗(yàn)提供了充分的準(zhǔn)備，特別是對(duì)于嬰幼兒采血困難以及采血量不足具有現(xiàn)實(shí)意義。同時(shí)，分離過(guò)程簡(jiǎn)單化、有利縮短工作時(shí)間、提高工作效率，也減少了耗材，降低了試驗(yàn)成本。

本研究還探討了不同離心時(shí)間和離心力下單個(gè)核細(xì)胞的分離效果，發(fā)現(xiàn)單個(gè)核細(xì)胞的分離效果并不是單純隨著轉(zhuǎn)數(shù)增加，離心時(shí)間延長(zhǎng)而分離效果越好。分離細(xì)胞時(shí)離心轉(zhuǎn)數(shù)過(guò)低或者離心時(shí)間太短，表現(xiàn)在中間層下的分層液中出現(xiàn)紅細(xì)胞所形成的紅色區(qū)，稱為紅細(xì)胞污染，導(dǎo)致分離效果不佳。而離心時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，單個(gè)核細(xì)胞又會(huì)損失過(guò)多，故分離時(shí)的轉(zhuǎn)速與時(shí)間要做出合理的調(diào)整。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，筆者認(rèn)為在離心力為1 800 r/min，離心時(shí)間為25 min時(shí)的離心條件，分層效果最好，細(xì)胞計(jì)數(shù)中細(xì)胞活力最好。

綜上所述，在獲取PBMC的回收率和純度時(shí)應(yīng)根據(jù)實(shí)際工作和實(shí)驗(yàn)室的條件來(lái)不斷摸索，選擇最佳分離方法。臨床大部分科研分離PBMC通常只采用肝素抗凝全血，而本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察不同抗凝劑的全血標(biāo)本混合后采用Ficoll離心法進(jìn)行單個(gè)核細(xì)胞的分離，達(dá)到增加分離PBMC時(shí)的血樣來(lái)源的目的，是具有現(xiàn)實(shí)意義的。

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Optimization of condition on peripheral blood mononuclear cells separation*

CaiMinmin,GuXiaoqiong△,GaoFei,QiuXiantao,ChenXiaojuan,LiuFei,ZhengHao

(DepartmentofClinicalLaboratory,GuangzhouMunicipalWomenandChildren′s

MedicalCenter,Guangzhou,Guangdong510623,China)

Abstract:ObjectiveTo compare the influence of different anticoagulants,centrifugal force and the centrifugal time on separation of peripheral blood mononuclear cells(PBMC) by the Ficoll density gradient centrifugation method,and to optimize the experimental scheme.MethodsThree different types of anticoagulation blood with heparin,EDTA and their mixture were separated by the Ficoll method.Then the sort and count were performed by using the blood cell analyzer.The recovery rate and purity were calculated;Meanwhile EDTA anticoagulation blood was treated by different centrifugal force and centrifugal time for optimizing the separation effect.ResultsThe recovery rate and purity of PBMC in the EDTA group was (51.32±50.21)% and (45.38±22.14)%;which in the heparin group were (24.52±19,10)% and (78.46±11.91)%;which in the EDTA plus heparin group were (56.32+24.30)% and (80.27+12.44)% respectively.The single factor variance analysis showed that the recovery rate of PBMC had statistically significant difference between the EDTA group and the heparin group (P<0.05),the EDTA group had higher recovery rate,but the recovery rate had no statistically significant difference between the heparin plus EDTA group and the heparin group (P>0.05);in the aspect of the purity of PBMC,there was statistical difference between the EDTA group and heparin group (P<0.05),the heparin group had higher PBMC purity,but the purity had no statistical difference between the heparin group and the heparin plus EDTA group (P>0.05);in the aspect of the survival rate of PBMC,there was no statistically significantly differences between the heparin group with the heparin plus EDTA group and the heparin group with the EDTA group (P>0.05).The mononuclear cell separation experiments in the EDTA anticoagulation blood showed that in the centrifugal force 600×g (1 800 r/min) and centrifugal time 25 min,the separation effect was optimal.ConclusionThe recovery rate and purity of PBMC in the heparin plus EDTA group have no statistical differences compared with those in the single anticoagulant group(P>0.05).Therefore,in the experiment process,the two kinds of anticoagulation blood could be mixed for conducting the cell separation.The effect of EDTA anticoagulation blood for separating mononuclear cells is optimal at the centrifugal force of 600×g (1 800 r/min) and the centrifugal time of 25 min.

Key words:mononuclear cell;ficoll continuous density gradient centrifugation method;anticoagulant;effect of separation

(收稿日期：2015-07-25)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.01.001

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-4130(2016)01-0001-03

*基金項(xiàng)目：廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(S2013010012520)；廣州市科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(201510010159)。

作者簡(jiǎn)介：蔡敏敏，女，檢驗(yàn)技師，主要從事妊娠糖尿病研究?！魍ㄓ嵶髡撸珽-mail：Guxiaoqiong@163.com。