劉彩云，薛佳楨，常志隆

(山東省高校生物化學(xué)與分子生物學(xué)重點實驗室，濰坊學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，山東　濰坊261061)

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龍柏葉枯病的發(fā)生特點及其病原菌分離鑒定*

劉彩云，薛佳楨，常志隆

(山東省高校生物化學(xué)與分子生物學(xué)重點實驗室，濰坊學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，山東濰坊261061)

摘要：龍柏葉枯病是近年來中國園林植物上出現(xiàn)的新病害，以小龍柏受害最為嚴(yán)重。本研究采用田間實地調(diào)查、室外試驗分析研究了龍柏葉枯病的癥狀及發(fā)生特點，并結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察及ITS序列分析對分離純化的龍柏葉枯病的病原菌進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明，龍柏葉枯病受害植株鱗葉小枝從上向下迅速干枯為其典型癥狀，春季冷涼、多雨的氣候條件及強(qiáng)度修剪是該病發(fā)生的主要原因；形態(tài)學(xué)觀察及ITS序列分析表明龍柏葉枯病菌的無性時期為鏈格孢，菌絲為有隔菌絲，分生孢子黃褐色，大小20.5～32.5μm×6.5～10μm，有縱橫隔膜且分隔處明顯縊縮,有性時期屬于子囊菌。

關(guān)鍵詞：形態(tài)學(xué)特征；ITS序列分析；癥狀；病原；發(fā)生特點；鏈格孢；囊菌

龍柏(Sabinachinensiscv.Kaizuka)別名繞龍柏、螺絲柏，為柏科(Cupressaceae)圓柏屬(Sabina)的常綠喬木，是中國城市園林綠化中綠籬、色塊和庭院栽植的首選樹種之一[1]。2008年，山東膠州龍柏上發(fā)生了一種新病害，該病害以受害植株鱗葉小枝從上向下迅速干枯為典型癥狀，故稱之為龍柏葉枯病[23]。此后，該病害在山東省、江蘇省均有發(fā)生，但目前對其研究報道的文獻(xiàn)極少。在2011-2014年，課題組成員對龍柏葉枯病的癥狀特點、病原、寄主范圍、發(fā)生特點等進(jìn)行了調(diào)查，并對其病原菌進(jìn)行分離、鑒定，以期明確該病害的病原菌，為龍柏葉枯病的及時有效防治及深入研究提供參考。

1材料與方法

1.1　癥狀特點觀察

從2011年開始，每年3月中旬，實地觀察田間發(fā)病龍柏植株，收集病株，記錄癥狀變化特點，并參照植物病害癥狀描述方法，分析、描述龍柏葉枯病的癥狀特點。

1.2　病原的分離

采集田間具有葉枯病典型癥狀特點的龍柏鱗葉小枝，采用組織分離法分離病原菌[4]：先用自來水沖洗小枝，去除其鱗葉上的塵污，再用75 %酒精消毒處理1 min，無菌水沖洗5遍。取23 mm長的消毒后龍柏鱗葉小枝病健交界組織，置于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，置于25℃，12 h光照人工智能氣候箱中培養(yǎng)，分離、純化優(yōu)勢菌株。挑取單菌落進(jìn)行純化、轉(zhuǎn)管并保存于4℃冰箱中備用。

1.3　病原菌的鑒定

1.3.1形態(tài)學(xué)鑒定

制作PDA平板，接種分離純化的致病菌，25℃培養(yǎng)4天后(12 h光照)，置于10℃(12 h光照)條件下繼續(xù)培養(yǎng)20天左右，刮取菌落上的菌組織，用1 %的葡萄糖制成菌懸液[5]，制作病原菌臨時玻片，置于數(shù)碼相差顯微鏡上觀察病原菌的孢子梗和分生孢子的形態(tài)，測量其大小，拍攝照片，根據(jù)相關(guān)資料進(jìn)行鑒定[6]。

1.3.2rDNA-ITS序列分子鑒定

PDA培養(yǎng)基活化分離純化的致病菌，待菌落鋪滿整個培養(yǎng)皿后，用滅菌刀片刮取菌組織，CTAB法提取病菌基因組DNA，用真菌核糖體基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal transcribed spacer，ITS) 通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')、ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用TaKaRa瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物，交南京金斯瑞生物科技公司測序。測序結(jié)果用與GenBank數(shù)據(jù)庫中已登錄真菌的rDNA-ITS序列進(jìn)行同源性比較，MEGA 4.0軟件的Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4　發(fā)生特點調(diào)查

1.4.1病害發(fā)生規(guī)律及溫濕度對病害發(fā)生的影響

從2012年3月上旬開始，實地調(diào)查記錄濰坊地區(qū)龍柏葉枯病的春季發(fā)病時間，病害蔓延特點，并在每年的5月下旬對濰坊市區(qū)東風(fēng)街、勝利街、福壽街3條交通主干道兩側(cè)綠籬小龍柏，人民公園、白浪河濕地和植物園3個代表性園林景觀區(qū)綠化色塊小龍柏發(fā)病情況進(jìn)行取樣調(diào)查，統(tǒng)計每個取樣點的病株數(shù)，計算發(fā)病率。發(fā)病率=每個取樣點的病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)×100 %。根據(jù)發(fā)病率和當(dāng)年春季的氣候狀況，分析溫度、降雨量對龍柏葉枯病發(fā)生的影響。

1.4.2不同養(yǎng)護(hù)管理措施對病害發(fā)生的影響

以濰坊學(xué)院行道綠籬小龍柏為試驗對象，于2012-2014年期間的每年 3月15號開始，采取不同措施對試驗區(qū)小龍柏進(jìn)行養(yǎng)護(hù)管理，2個月后，比較龍柏葉枯病發(fā)病率，評價不同養(yǎng)護(hù)管理措施對龍柏葉枯病發(fā)生的影響。發(fā)病率=每個試驗區(qū)病株數(shù)/該區(qū)總株數(shù)×100 %。試驗采取的養(yǎng)護(hù)管理措施分別是：(1)間隔15天修剪1次，不澆水；(2)間隔15天修剪1次，噴灌澆水1次；(3)間隔15天噴灌澆水1次，不修剪；(4)對照區(qū)(CK)，植株自然生長，不進(jìn)行人工澆水與修剪處理。

1.5　數(shù)據(jù)分析

圖4、圖5均采用Excel 2007制作，數(shù)據(jù)差異性采用SAS 8.0軟件分析。

2結(jié)果與分析

2.1　癥狀描述

龍柏葉枯病主要危害龍柏葉片，發(fā)病初期，植株上部鱗葉小枝端部出現(xiàn)枯黃(圖1，A)，并逐漸向小枝基部擴(kuò)展，導(dǎo)致整個鱗葉小枝呈黃褐色干枯，失去光澤(圖1，B)。后期，發(fā)病植株鱗葉失水干縮、用手揉捏易碎(圖1，C)，大田遠(yuǎn)遠(yuǎn)看去似火燒狀干枯(圖1，D、E)。

圖1龍柏葉枯病的癥狀特點

Fig.1The symptom of leaf blight ofS.chinensiscv. Kaizuka

2.2　病原鑒定結(jié)果

2.2.1病原菌的形態(tài)特征及鑒定

通過25±0.5℃、12 h光照條件下的PDA平板培養(yǎng)，從發(fā)病的龍柏鱗葉小枝的病健交界組織上共分離得到3種真菌，經(jīng)鑒定，只有一株為植物病原真菌，標(biāo)記為LB。LB菌株在PDA培養(yǎng)基上可形成圓形的灰褐色菌落，菌落邊緣整齊，菌絲灰白色，棉絮狀(圖2，A)。病原菌形態(tài)特征的顯微觀察發(fā)現(xiàn)LB菌絲為有隔菌絲(圖2，B)，分生孢子黃褐色，大小20.5～32.5μm×6.5～10μm，有縱橫隔膜且分隔處明顯縊縮(圖2，C)，這些特征和真菌半知菌門的鏈格孢菌(Alternaria)[6]形態(tài)特征相符合。

圖2LB菌株的菌落、菌絲孢子形態(tài)特征

Fig.2The characteristics of colony, hyphae and spore of LB

2.2.2病原菌的 rDNA-ITS序列特征分析及鑒定

真菌通用引物ITS1/ITS4對LB菌株基因組DNA擴(kuò)增后得到的序列長度為578 bp，GenBank數(shù)據(jù)庫同源性比較表明，LB與鏈格孢屬(Alternaria)真菌的ITS序列具99 %以上的同源性。系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明， LB與鏈格孢Alternariaalternata(KJ002064.1)親緣關(guān)系最近 (圖3)。結(jié)合LB培養(yǎng)性狀及形態(tài)學(xué)特征，擬鑒定龍柏葉枯病菌為鏈格孢Alternariaalternata。

圖3　龍柏葉枯病菌LB的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3　病害發(fā)生特點及影響因素

2.3.1發(fā)生特點

2012-2014年，通過對濰坊地區(qū)龍柏葉枯病發(fā)生情況觀察記錄，結(jié)果表明，龍柏葉枯病比其他常見植物病害發(fā)生早，一般在4月上旬(日均最高溫度10℃左右)即可迅速發(fā)生、顯癥。龍柏葉枯病發(fā)生過程中會形成明顯的發(fā)病中心(圖1，D)，但向四周擴(kuò)散蔓延的速度慢，說明其再侵染能力弱；在濰坊地區(qū)，當(dāng)日平均最高溫度超過30℃時，病害蔓延基本停止。

2.3.2影響因素

本研究對2012-2014年濰坊市區(qū)交通主干道東風(fēng)街、勝利街和福壽街兩旁的綠籬小龍柏和3個主要景觀綠化區(qū)人民公園、白浪河濕地和植物園綠化色塊小龍柏葉枯病發(fā)生情況調(diào)查結(jié)果表明，相同年份，東風(fēng)街、勝利街和福壽街兩旁的綠籬小龍柏上葉枯病的發(fā)病程度均高于人民公園、白浪河濕地和植物園的綠化色塊小龍柏(圖4)，這可能與行道綠籬小龍柏修剪頻繁有關(guān)。

圖4　2012-2014年濰坊市區(qū)主要園林綠化區(qū)

濰坊位于山東半島中部，屬于溫暖帶季風(fēng)型半濕潤氣候，春季短促，干旱少雨，3-5月份的平均最高溫度為19.5℃。在本研究調(diào)查的3個春季，2013年春季濰坊地區(qū)氣溫回升慢、冷涼天氣持續(xù)時間長、降雨量充足，龍柏葉枯病的發(fā)生也相應(yīng)最嚴(yán)重。這表明春季冷涼、多雨的氣候條件會促進(jìn)龍柏葉枯病的發(fā)生。

不同澆水、修剪處理下，龍柏葉枯病發(fā)病情況如圖5所示。由圖5可知，與不修剪處理相比較，龍柏葉枯病發(fā)生期修剪處理可顯著提高病害的發(fā)生率(p=0.05)；定期修剪或者不修剪的條件下，噴灌澆水對病害的發(fā)生可起到一定的促進(jìn)作用，但對病害的發(fā)生蔓延不會產(chǎn)生顯著影響(p=0.05)。

圖5　不同管理措施處理下龍柏葉枯病的發(fā)生情況

3結(jié)論與討論

本研究表明，龍柏葉枯病以受害植株鱗葉小枝從上向下迅速干枯為典型癥狀，且病害春季發(fā)生早，發(fā)病中心明顯，再侵染能力弱；春季冷涼多雨有利于病害的發(fā)生，病害發(fā)生期的養(yǎng)護(hù)修剪對病害傳播具有促進(jìn)作用，但澆水對病害蔓延影響不明顯。因此，在冷涼天氣持續(xù)時間長、降雨充足的春季，要警惕龍柏葉枯病的流行，及時采取預(yù)防性防治措施；病害發(fā)生初期及時拔除中心病株，病害蔓延過程中減少龍柏的修剪次數(shù)或盡量不修剪，可減輕龍柏葉枯病的發(fā)生。

植物病原真菌中的鏈格孢菌可引致桂花(OsmanthusfragransLour)[7]、銀杏(GinkgobilobaL.)[8]等多種園林植物葉枯病。1992年，戴雨生等人[9]對側(cè)柏〔Platycladusorientalis(L.) Franco〕葉枯病菌分離過程也分離到鏈格孢菌，但室內(nèi)接種未獲得成功，最后通過采集田間帶子囊盤的病枝條做接種源獲得了發(fā)病植株，于是鑒定側(cè)柏葉枯病菌為子囊菌門、盤菌綱的綠膠杯菌(Chloroscyphaplatycladussp.Nov)。丁長年等人[10]也認(rèn)為龍柏葉枯病菌為綠膠杯菌，病菌子囊盤在前一年夏、秋季節(jié)釋放子囊孢子進(jìn)行初侵染，經(jīng)過冬季的潛伏侵染，翌春天氣回暖后迅速顯癥。本研究在龍柏葉枯病的病原菌分離過程中，對具有典型葉枯病菌癥狀特點的龍柏鱗葉小枝經(jīng)酒精消毒處理后，從病健交界處分離到了3種真菌菌株，經(jīng)形態(tài)及ITS序列分析發(fā)現(xiàn)只有一菌株為植物致病菌鏈格孢菌，其余兩種為內(nèi)生毛殼菌(Cheatomium)，但是室內(nèi)鏈格孢菌的致病性接種未獲得成功。同時，在龍柏葉枯病寄主調(diào)查過程中，僅在極少數(shù)發(fā)病龍柏鱗葉小枝上發(fā)現(xiàn)了直徑約3 mm左右的橘紅色盤狀物(圖6，A)。顯微觀察發(fā)現(xiàn)，盤狀物中密布子囊(圖6，B)，子囊長棍棒狀，內(nèi)含有8個球形子囊孢子，子囊孢子無色、透明(圖6，C)。綜合上述文獻(xiàn)報道及本研究結(jié)果，可以認(rèn)為，龍柏葉枯病無性時期為鏈格孢菌，有性時期可能屬于子囊菌，且以子囊孢子作為初侵染，在秋末侵染植株后潛伏越冬，第2年春季顯癥。因此，室內(nèi)接種分離的鏈格孢菌難以獲得發(fā)病植株。鑒于此，龍柏葉枯病菌及其侵染規(guī)律還有待于進(jìn)一步研究。

圖6龍柏鱗葉小枝上形成的子囊盤及子囊孢子形態(tài)

Fig.6The characteristics of ascocarp and ascus ofS.chinensisleaf blight

參考文獻(xiàn)：

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Isolation and Identification of Leaf Blight of Sabina chinensis cv.Kaizuka

LIU Cai-yun,XUE Jia-zhen,CHANG Zhi-long

(Key Laboratory of Biochemistry and Molecular Biology，Biological and Agricultural College of Weifang University，

Weifang Shandong 261061，P.R.China)

Abstract:Leaf blight ofSabinachinensiscv.Kaizuka is a kind of new disease on landscape plants and its seedlings are vulnerable to the infection.The symptom and characteristics of the occurrence of the leaf blight ofS.chinensiscv.Kaizuka were studied by field experiments and surveys，and the isolated pathogen was identified based on the morphological characters and ITS sequence analysis.The results showed that the scale leaves withered from top to bottom was the typical symptom of the diseased plants，and the cool and rainy weather in spring and frequent pruning were the main causes of the leaf blight ofS.chinensiscv.Kaizuka.By morphological observation and ITS sequence analysis，the imperfect stage of the pathogen of Leaf blight ofS.chinensiscv.Kaizuka was identified asAlternariaalternate.The mycelium were isolated one with brown conidia of 20.5～32.5μm×6.5～10μm，crossbar diaphragm ,and its perfect stage was Ascomycete.

Key words:morphological characters; ITS sequence analysis; symptom; pathogen; occurrence characteristics；Alternariaalternate；Ascomycete

作者簡介：第一劉彩云(1975-)，女，講師，博士，主要從事植物病理學(xué)研究。E-mail:changyj2004@126.com

基金項目：濰坊學(xué)院博士基金項目(2012BS17)，山東省教育廳科技發(fā)展計劃項目(J11LC62)，濰坊市科技發(fā)展計劃項目(201301013)。

*收稿日期：2015-06-10

中圖分類號：S 763

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1672-8246(2016)01-0037-05