包晴忠，王娟，畢瑋，陳芳

(1.西雙版納州林業(yè)局，云南　景洪666100；2.云南省林業(yè)科學(xué)院，云南　昆明650201；

3.國(guó)家林業(yè)局云南珍稀瀕特森林植物保護(hù)和繁育實(shí)驗(yàn)室；云南省森林植物培育與開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南　昆明650201)

?

滇越金線蘭離體快繁及植株再生*

包晴忠1，王娟2,3，畢瑋2,3，陳芳2,3

(1.西雙版納州林業(yè)局，云南景洪666100；2.云南省林業(yè)科學(xué)院，云南昆明650201；

3.國(guó)家林業(yè)局云南珍稀瀕特森林植物保護(hù)和繁育實(shí)驗(yàn)室；云南省森林植物培育與開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650201)

摘要：以滇越金線蘭野生植株莖段為外植體，分別對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)、增殖和生根培養(yǎng)基的篩選試驗(yàn)。結(jié)果表明，以3/2 MS為基本培養(yǎng)基誘導(dǎo)效果較好；3/2 MS+0.1 mg/L BA+KT 0.5 mg/L KT+0.1 mg/L NAA能有效增殖，增殖倍數(shù)在5倍；在1/2 MS+0.5 mg/L IBA+0.5 mg/L NAA的培養(yǎng)基上生根率達(dá)96.4 %以上；在透光度70 %左右的林下開(kāi)展了組培苗移栽試驗(yàn)，以腐殖土︰珍珠巖︰沙=2︰1︰1配比為組培苗移栽較適宜基質(zhì)，成活率達(dá)85.6 %。

關(guān)鍵詞：滇越金線蘭；誘導(dǎo);增殖；生根培養(yǎng)基；莖段；活性炭;透光度；組培苗

滇越金線蘭(Anoectochiluschapaensis)是蘭科開(kāi)唇蘭屬多年生珍稀中草藥，植株粗壯(莖粗0.25~0.8 cm)，葉片寬大(長(zhǎng)2~5 cm，寬2.5~3.5 cm)，葉片較厚，單株重平均2.5 g以上。金色葉脈清晰，葉面紅褐色，4 000 Lx光照強(qiáng)度下呈紫紅色，基部鞘狀抱莖[1～2]；具有清熱涼血、祛風(fēng)利濕、固腎平肝等功效，近年發(fā)現(xiàn)對(duì)調(diào)節(jié)血糖、血脂、血壓及尿酸有較好的作用，用于治療糖尿病、腎炎、急慢性肝病等有顯著療效。最近研究發(fā)現(xiàn)，從滇越金線蘭中分離鑒定了2個(gè)糖苷化的丁酸衍生物，用胰島素抵抗細(xì)胞模型進(jìn)一步證實(shí)，這2個(gè)丁酸糖苷化的活性化合物對(duì)胰島素有良好的增敏作用，促進(jìn)葡萄糖的吸收，有望作為治療Ⅱ型糖尿病胰島素抵抗的候選化合物加以研究與開(kāi)發(fā)利用[3～5]。由于其較好的藥用和觀賞價(jià)值，野生資源日漸稀少；種子沒(méi)有胚乳，發(fā)芽需有特定真菌，且發(fā)芽率在自然條件下只有千分之一[6]。為保護(hù)和開(kāi)發(fā)這一寶貴資源，本研究在文山采集野生滇越金線蘭進(jìn)行離體組織培養(yǎng)，建立其無(wú)性快繁體系，培育優(yōu)質(zhì)種苗，為保護(hù)、開(kāi)發(fā)和合理利用資源提供技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1　試驗(yàn)材料

野生滇越金線蘭材料于2012年9月采自云南文山富寧縣田蓬鄉(xiāng)大壩子山，以其帶節(jié)莖段為外植體進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2　試驗(yàn)方法

(1)材料處理外植體剪去葉片和葉柄，中性洗潔精稀釋10倍，用軟毛刷輕輕刷洗干凈，流水沖洗10 min，剪成1~2 cm長(zhǎng)的帶節(jié)莖段，在超凈工作臺(tái)上，先用次氯酸鈉消毒20 s，用無(wú)菌水沖洗1次，再用0.1 %的HgCl2滅菌10-15 min，用無(wú)菌水沖洗3~4次后，用無(wú)菌濾紙吸干水分，切去莖段基部，接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。

(2)誘導(dǎo)基本培養(yǎng)基篩選選用3/2 MS、White、Knudson C進(jìn)行試驗(yàn)(表1)，添加BA 0.1 mg/L+KT 0.5 mg/L +NAA 0.1 mg/L，每種培養(yǎng)基接種30個(gè)莖段，重復(fù)3次，30天后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)果。

表1　不同基本培養(yǎng)基芽誘導(dǎo)結(jié)果

表2　不同激素配比對(duì)滇越金線蘭增殖的影響

表3　不同培養(yǎng)基上滇越金線蘭生根效果

(3)增殖培養(yǎng)基篩選以3/2 MS 為基本培養(yǎng)基，添加BA、KT、NAA 3種激素不同濃度及配比進(jìn)行試驗(yàn)，共設(shè)計(jì)了9組培養(yǎng)基(表2)。

(4)生根培養(yǎng)基篩選當(dāng)增殖苗生長(zhǎng)到3~4 cm，2~3節(jié)時(shí)，即可切斷進(jìn)行生根誘導(dǎo)培養(yǎng)，生根培養(yǎng)基設(shè)計(jì)見(jiàn)表3。

以上培養(yǎng)基加6.0 g/L的瓊脂，25 g/L的蔗糖，pH 5.8，在增殖和生根培養(yǎng)基中均添加0.5 %的活性碳，培養(yǎng)溫度22~25 ℃，光照強(qiáng)度 3 000 Lx，光照時(shí)間 8 h/d。增殖及生根培養(yǎng)基的每個(gè)處理接種50瓶，每瓶接種10芽， 50天后統(tǒng)計(jì)結(jié)果(表2和表3)。

(5)移栽試驗(yàn)移栽滇越金線蘭根肉質(zhì)，根系不發(fā)達(dá)，無(wú)須根，每節(jié)一般僅生長(zhǎng)1條根，每苗2~3條根，根據(jù)以上特點(diǎn)選擇以下3種基質(zhì)進(jìn)行試驗(yàn)：①腐質(zhì)土︰珍珠巖︰蛭石=1︰1︰1；②泥土︰珍珠巖=3︰1；③腐質(zhì)土︰珍珠巖︰沙=2︰1︰1。移栽設(shè)在常綠闊葉林下，郁閉度約70 %，林間做床，移栽基質(zhì)用多菌靈500倍稀釋噴灑消毒，把經(jīng)煉苗處理的試管生根苗揭開(kāi)封口膜放置3-5天，取出小苗用清水洗凈，移栽到備好的托盤(pán)中，每種基質(zhì)移栽500株小苗，定根水淋透后，視天氣及基質(zhì)情況，適時(shí)澆水，60天后統(tǒng)計(jì)移栽成活情況。

1.3　結(jié)果觀察及統(tǒng)計(jì)

誘導(dǎo)、增殖及生根培養(yǎng)均在接種30-50天后，觀察芽及出根情況，芽及根長(zhǎng)到0.5 cm以上的進(jìn)行計(jì)數(shù)，與接入總數(shù)進(jìn)行百分比計(jì)算，分別計(jì)算誘導(dǎo)、增殖及生根率。

2結(jié)果與分析

2.1　誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選

通過(guò)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)滇越金線蘭外植體在添加BA 0.1 mg/L +KT 0.5 mg/L +NAA 0.1 mg/L的3/2 MS、White、Knudson C這3種基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)，均誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽，誘導(dǎo)率在48 %以上，誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間在20-28天之間。但不同基本培養(yǎng)基其誘導(dǎo)結(jié)果和后續(xù)生長(zhǎng)情況存在一定差異，其中3/2 MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)時(shí)間最短(20天)，誘導(dǎo)率(83.3 %)最高，誘導(dǎo)出的側(cè)芽生長(zhǎng)健壯，葉色紫褐，金色葉脈明顯；White培養(yǎng)基的誘導(dǎo)結(jié)果次之；Knudson C培養(yǎng)基的誘導(dǎo)結(jié)果較差，雖然Knudson C對(duì)其他蘭科植物誘導(dǎo)效果較好[7]，但對(duì)滇越金線蘭不太適宜。結(jié)果表明，莖段作為外植體誘導(dǎo)建立無(wú)菌快繁體系以3/2 MS培養(yǎng)基為宜。

2.2　增殖培養(yǎng)

植物激素是啟動(dòng)組培芽增殖最靈敏的“鑰匙”，添加不同激素和濃度的篩選試驗(yàn)，繼代3次，其增殖和生長(zhǎng)情況見(jiàn)表2。由表2可知，僅添加BA或KT和NAA 配比的培養(yǎng)基的增殖系數(shù)較低，但苗健壯，隨其濃度的增加，芽增殖系數(shù)逐漸提高，可達(dá)6~10倍，但苗纖細(xì)；而B(niǎo)A和生長(zhǎng)素NAA組合的培養(yǎng)基，比用KT與NAA的培養(yǎng)基的增殖及苗長(zhǎng)勢(shì)較好些，處理4，即0.1 mg/L BA+0.5 mg/L KT+0.1 mg/L NAA培養(yǎng)基配比效果最優(yōu)，芽增殖達(dá)5倍，芽20天萌動(dòng)，形成毛狀須根，葉片呈紅褐色，金黃色葉脈明顯；滇越金線蘭繼代周期約為70天左右，應(yīng)及時(shí)轉(zhuǎn)接，培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，芽太長(zhǎng)，生長(zhǎng)空間不夠，營(yíng)養(yǎng)耗盡，影響長(zhǎng)勢(shì)，繼代后需較長(zhǎng)時(shí)間恢復(fù)，影響整個(gè)繁育體系的擴(kuò)增。

2.3　生根培養(yǎng)

生長(zhǎng)素IBA及NAA能有效促進(jìn)植物組織生根，以1/2 MS為基本培養(yǎng)基添加不同濃度和配比的IBA及NAA進(jìn)行生根篩選試驗(yàn)。

9種培養(yǎng)基均能誘導(dǎo)滇越金線蘭生根(表3)，根萌發(fā)時(shí)間在15-30天，單一生長(zhǎng)素對(duì)根的誘導(dǎo)培養(yǎng)效果不理想，生根率在36 %~65 %；NAA與IBA的配比效果較好，其最佳濃度及配比為處理4，即1/2 MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA誘導(dǎo)時(shí)間最短(15天)，生根率達(dá)96.4 %，基部3～4節(jié)均生根，植株健壯，根每節(jié)1條根，偶見(jiàn)2條根，密被根毛，具有典型的蘭科植物氣生肉質(zhì)根系特征。

表4　不同移栽基質(zhì)下滇越金線蘭生長(zhǎng)效果

2.4　煉苗移栽

本試驗(yàn)采用了3種移栽基質(zhì)進(jìn)行滇越金線蘭組培苗的移栽試驗(yàn)(表4)，結(jié)果表明，在腐殖土︰珍珠巖︰沙=2︰1︰1配比的基質(zhì)，移栽成活率達(dá)85.6 %，植株生長(zhǎng)健壯，葉片寬大，增重明顯；而在其他2種基質(zhì)中移栽成活率在51.2 %~73.2 %，植株增重不明顯，葉片偏小，特別是泥土和珍珠巖配比的基質(zhì)，由于通透性較差，根容易腐爛。

3討論

滇越金線蘭喜在陰涼、濕潤(rùn)地方生長(zhǎng)，莖干粗壯，葉片寬大，單株生物量平均2.5 g以上。適宜的人工栽培條件下密植有利于提高其單位面積產(chǎn)量，但野生植株體在野外陰濕地區(qū)生長(zhǎng)，攜帶大量細(xì)菌、真菌等微生物，以致在組培初代培養(yǎng)時(shí)，污染率偏高。本試驗(yàn)采用次氯酸鈉和HgCl22次滅菌處理外植體，能有效地降低污染率，提高誘導(dǎo)率，無(wú)菌體系一旦建立，即可轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，可快速建立無(wú)菌繁育體系。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，滇越金線蘭對(duì)細(xì)胞分裂素比較敏感，添加的 0.5 mg/L BA，即可誘導(dǎo)叢生不定芽，細(xì)胞分裂素添加過(guò)多，會(huì)刺激金線蘭基部莖萌蘗大量芽，通過(guò)調(diào)節(jié)激素，誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)側(cè)芽，切割側(cè)芽，誘導(dǎo)萌發(fā)下一級(jí)側(cè)芽，從而快速有效地建立起快繁體系，但激素添加過(guò)多，叢芽太細(xì)，種植后單株產(chǎn)量太低，植株抗逆性差，易得病，應(yīng)適當(dāng)控制激素的添加比例，保持適當(dāng)合理的增殖率。

滇越金線蘭很容易生根，添加吲哚丁酸或萘乙酸即可生根，但兩者適當(dāng)比例配比，生根率會(huì)得到極大提高；移栽時(shí)選疏松、透氣、富含有機(jī)質(zhì)的腐質(zhì)土，能有效地提高其成活率及單位面積生長(zhǎng)量。

參考文獻(xiàn)：

[1] 中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編委.中國(guó)植物志(第17卷)[M].北京：科學(xué)出版社，2006:224-225.

[2] 張鐵，萬(wàn)京，沐建華.文山地區(qū)金線蓮種質(zhì)資源初步調(diào)查[J].文山師范高等?？茖W(xué)校學(xué)報(bào), 2005，18(1):26-28.

[3]趙林，朱恩，蔡金艷.滇越金線蘭中2個(gè)丁酸衍生物對(duì)HepG2 細(xì)胞胰島素抵抗改善作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中藥新藥與臨床藥理, 2014,25(7):393-396.

[4]蔡金艷，王義娜，朱恩，等.滇越金線蘭對(duì)高脂飲食聯(lián)合STZ誘導(dǎo)的大鼠血糖、血脂和腎功能的影響[J].中藥新藥與臨床藥理，2012，28(2):116-119.

[5] 王義娜，蔡金艷，趙林，等.滇越金線蘭化學(xué)成分研究[J].中藥材，2012，35(6):911-913.

[6] 蔡文燕，肖華山，范秀珍.金線蓮研究進(jìn)展[J].亞熱帶植物科學(xué)，2003，32(3):68-72.

[7] 劉慶昌，吳國(guó)良.植物細(xì)胞組織培養(yǎng)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2002:240.

[上接第20頁(yè)]

[21]王晗,王永,紀(jì)燕玲,等. 分離自黑茶的散囊菌屬真菌中的NRPS基因的檢測(cè)和分布[J].微生物學(xué)通報(bào),2013,40(3):464-475.

[22]朱鵬,鄭立,林晶,等. 抗菌和細(xì)胞毒活性海洋細(xì)菌的篩選及其次生代謝基因證據(jù)[J].微生物學(xué)報(bào),2007,47(2):228-234.

[23]陸勝利,祁超. 海洋放線菌S.areniocolaCNS-205 腺苷化結(jié)構(gòu)域基因的克隆、表達(dá)和純化[J].華中師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2014,48(6):876-884.

[24]彭玉嬌,李敬龍,林學(xué)政. 極地抗植物病原真菌活性菌株P(guān)KS和NRPS基因的克隆與分析[J].海洋科學(xué)進(jìn)展,2014,32(3):396-404.

[25]王毅,周旭,許宰銑,等. 長(zhǎng)松蘿中一個(gè)聚酮合酶基因簇的克隆和鑒定[J].微生物學(xué)報(bào),2014,54(7):770-777.

[26]薛慶中. DNA和蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)分析工具[M].北京: 科學(xué)出版社,2010:75-106.

[27]靳菊情,石娟,葛萍,等. 長(zhǎng)松蘿多糖對(duì)小鼠免疫功能的影響[J].中國(guó)藥學(xué)雜志,2003,38(6):431-432.

[28]拉喜那木吉拉,包海鷹,圖力古爾.松蘿屬地衣類化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展[J].中國(guó)中藥雜志,2013,38(4):539-545.

[29]葉嘉,張浩,張寧.不同海拔高度黃梅衣屬地衣松蘿酸含量的測(cè)定[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,53(6):1415-1417.

[30]Torsten S,Henning D M,Marahiel M A.The specificity-conferring code of adenylation domains in nonribosomal peptide synthetases[J].Chemistry & Biology,1999,6:493-505.

[31]Barbara B.U,Philippe E.R,Dario C.Draft genome sequence of the grapevine dieback fungusEutypalataUCR-EL1[J].GenomeAnnounce,2013,1(3):e00228-13.

[32]Valarmathi R,Hariharan GN,VenkataramanG,etal.Characterization of a non-reducing polyketide synthasegene from lichenDirinariaapplanata[J].Phytochemistry，2009，70(6):721-729.

[33]許靈波,申屠旭萍,陳宵峰,等. 銀杏內(nèi)生真菌No.1028的培養(yǎng)條件及其代謝產(chǎn)物對(duì)作物真菌病害的抑制作用[J].菌物研究,2006,4(2):25-29.

[34]朱鵬.珍珠膜海綿共附生微生物PKS與NRPS的篩選與模塊結(jié)構(gòu)研究[D].杭州：浙江大學(xué),2008.

Rapid Propagation and Regeneration of Anoectochilus chapaensis in vitro

BAO Qing-zhong1，WAN Juan2,3,BI Wei2,3, CHEN Fang2,3

(1.Forestry Bureau of Xishangbanna, Jinghong Yunnan 666100, P.R.China;2.Yunnan Academy of Forestry,Kunming Yunnan 650201,P.R.China;

3.Yunnan Laboratory for Conservation of Rare, Endangered & Endemic Forest Plants,Public Key Laboratory of the State Forestry Administration;

Yunnan Provincial Key Laboratory of Cultivation and Exploitation of Forest Plants,Kunming Yunnan 650201,P.R.China)

Abstract:With the stem segments of wildAnoectochiluschapaensisplants as explants, the experiments on the selection of suitable medium for induction, proliferation and rooting were conducted.The results showed that the suitable induction medium was 3/2MS.When the rooting medium was 3/2 MS+ 0.1 mg/L BA +0.5 mg/L KT+0.1 mg/L NAA,it could proliferate 5 times,and when the rooting medium was 1/2 MS +0.5 IBA+0.5 NAA,the rooting rate could reach 96.4 %.Meanwhile, the tests of tissue cultural plantlets transplanting were developed,and it demonstrated that the suitable ratio for mixed material transplanted in forest with 70 % transmittance was peat︰muck︰vermiculite =2︰1︰1, and the survival rate could reach to 85.6 %.

Key words:Anoectochiluschapaensis;induction;rooting medium;stem segment；activated carbon;transmittance;tissue cultural plantlet

通訊作者簡(jiǎn)介：陳芳(1965-)，女，正高級(jí)工程師，主要從事林木組培研究。E-mail:chenfang658@126.com

作者簡(jiǎn)介：第一包晴忠(1964-)，男，高級(jí)工程師，主要從事野生植物保護(hù)研究。E-mail:356764757@qq.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家林業(yè)局公益性項(xiàng)目201104060。

*收稿日期：2015-04-12

中圖分類號(hào)：S 567.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1672-8246(2016)01-0021-04