陳丹朔，薛振華，張振南，王曉東，張楨妮，王書敏，安　磊，云　鵬，田見(jiàn)暉*，李樹(shù)靜，4*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，河北 保定 071001；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，北京 100094；

3.北京市畜牧總站，北京 100107；4.北京安伯胚胎生物技術(shù)中心，北京 100107)

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靚精對(duì)豬精子、卵母細(xì)胞和胚胎的影響

陳丹朔1，2，薛振華3，張振南1，王曉東2，張楨妮2，王書敏2，安磊2，云鵬3，田見(jiàn)暉2*，李樹(shù)靜1，4*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，河北 保定 071001；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，北京 100094；

3.北京市畜牧總站，北京 100107；4.北京安伯胚胎生物技術(shù)中心，北京 100107)

摘要：靚精是一個(gè)消毒劑的新產(chǎn)品，可用于精液常溫保存過(guò)程的微生物污染的預(yù)防。為了確認(rèn)靚精對(duì)精子、卵子以及早期胚胎的影響，本實(shí)驗(yàn)利用病原抑制實(shí)驗(yàn)篩選出的三個(gè)靚精濃度，0.5%(v/v)、0.75%和1%，并分別添加至精液稀釋液、卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液、胚胎的培養(yǎng)液中，觀察靚精對(duì)豬卵母細(xì)胞的成熟、胚胎發(fā)育、精子活力以及受精能力等的影響。結(jié)果表明，三個(gè)處理濃度的靚精對(duì)卵母細(xì)胞的成熟質(zhì)量、體外發(fā)育能力，精子的運(yùn)動(dòng)和受精能力均無(wú)顯著影響。因此，靚精作為廣譜消毒劑，可以在豬精液常溫保存過(guò)程中添加，以改善精液保存品質(zhì)。

關(guān)鍵詞：靚精；豬；精子；卵母細(xì)胞；胚胎

資助項(xiàng)目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系北京市生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(25015015)

李樹(shù)靜(1963-)，男，博士，教授。

E-mail:lshujing@hotmail.com

豬人工授精技術(shù)是集約化養(yǎng)豬的關(guān)鍵技術(shù)，可大幅提高優(yōu)良種公豬利用效率。精液在常溫保存過(guò)程中有可能受到微生物的污染，從而影響輸精效果。因此，在精液中添加對(duì)精子、卵子以及胚胎沒(méi)有毒性，而對(duì)微生物具有抑制作用的消毒劑，可以通過(guò)提高精液品質(zhì)來(lái)改善人工輸精效果[1]。聚維酮碘為碘伏的一種，是表面活性劑聚乙烯吡咯烷酮(PVP)與碘的復(fù)合物[2]。聚維酮碘對(duì)真菌、病毒和革蘭氏陰陽(yáng)性菌都具有殺滅作用[3，4]。靚精是一個(gè)消毒劑的新產(chǎn)品，其主要成分為聚維酮碘(PVP-I)，可用于精液常溫保存過(guò)程的微生物污染的預(yù)防。

1材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1卵巢的采集

豬的卵巢取自位于北京郊區(qū)的屠宰場(chǎng)。將離體的卵巢及時(shí)放入裝有含雙抗(青霉素和鏈霉素，各1 000單位/mL)的37℃生理鹽水的保溫瓶中，3 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2豬的精液

豬的精液取自北京中順景盛種豬改良有限公司。

1.2　主要化學(xué)試劑

本研究用于精液保存、卵母細(xì)胞成熟、受精、激活以及胚胎發(fā)育所涉及的生化試劑除標(biāo)注外均購(gòu)自Sigma公司。配制各種液體所用的水均為經(jīng)MilliQ過(guò)濾的超純水。

1.3　實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1卵母細(xì)胞體外成熟

將取回的卵巢用含雙抗的滅菌生理鹽水清洗3次，放入38℃的水浴鍋中，使用20 mL的注射器從卵巢表面上直徑為3~6 mm的卵泡中抽取卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)，將抽取液放于15 mL離心管中，38℃水浴靜置至完全沉淀，洗卵液TL清洗兩次，顯微鏡下?lián)烊“?層以上卵丘細(xì)胞的COCs。

將挑選好的卵母細(xì)胞移入覆蓋有礦物油且預(yù)先平衡2 h以上的M199中洗3次，再移入覆蓋礦物油且平衡好的M199滴中，每滴60 μl，放入20~15個(gè)卵母細(xì)胞，培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)條件為5% CO2的空氣，38.5℃及100%相對(duì)飽和濕度。

1.3.2卵母細(xì)胞孤雌激活及體外培養(yǎng)

將脫去卵丘的成熟卵母細(xì)胞，先用事先預(yù)熱的融合/激活液洗滌3遍，之后將其轉(zhuǎn)移到已經(jīng)鋪滿激活液的融合槽中，施加電脈沖進(jìn)行電激活，之后放入平衡2 h以上含CB和CHX的PZM-3培養(yǎng)滴中洗3次，再放入相同溶液的培養(yǎng)滴中進(jìn)行化學(xué)輔助激活，4 h后移出并用PZM3 培養(yǎng)液洗滌3遍，轉(zhuǎn)移到礦物油覆蓋并預(yù)先在 5% CO2培養(yǎng)箱中平衡至少2 h以上的PZM3 發(fā)育液滴中繼續(xù)培養(yǎng)。38.5℃，5% CO2，飽和濕度下培養(yǎng)48 h和168 h分別記錄卵裂和囊胚形成結(jié)果。

1.3.3精液的處理

實(shí)驗(yàn)前一天取回精液后，首先取出2 mL放入管中，并置于37℃水浴鍋中，20~30 min后檢測(cè)精子活力和密度，精液于17℃恒溫箱中保存。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，取10 mL精液加入離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入預(yù)熱的PBS-BSA洗一次，1 000 r/min離心5 min，棄上清，將沉淀吸出放入含有獲能液的離心管中，呈45°放入培養(yǎng)箱獲能，30 min后取出檢測(cè)精子活力及密度。

1.3.4體外受精

將成熟好的COCs脫去顆粒后放入受精液滴中，每滴50 μl，放入15~20個(gè)卵母細(xì)胞，然后放入50 μl獲能的精液。放入5% CO2，38.5℃及100%相對(duì)飽和濕度的培養(yǎng)箱中受精，6 h后將卵母細(xì)胞移入平衡4 h以上的胚胎培養(yǎng)液中洗去精子，再換入新的胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)。38.5℃，5%CO2，飽和濕度下培養(yǎng)48 h和168 h分別記錄卵裂和囊胚形成結(jié)果。

1.3.5卵母細(xì)胞染色(DAPI)

成熟44 h的卵母細(xì)胞在透明質(zhì)酸酶中脫去顆粒細(xì)胞，放入4%PFA中固定45 min，然后在含0.1%PVA的PBS中洗3次，每次5 min，接著使用DAPI染色，5 min后壓片，觀察結(jié)果，以排出第一極體認(rèn)為成熟。

1.3.6囊胚細(xì)胞計(jì)數(shù)及凋亡染色

使用TUNEL試劑盒染色。囊胚先于含0.5%Triton的4%PFA中固定通透，37℃，45 min；染色液為試劑一(Label)和試劑二(Enzyme)以9：1的體積比混合，固定好的囊胚在含0.1%PVA的PBS中洗3次，每次5 min，接著在染色液中染色1 h，PBS-PVA洗3次，最后DAPI染色5~10 min。

1.3.7精子檢測(cè)方法

使用計(jì)算機(jī)輔助精液分析(CASA)進(jìn)行精液檢測(cè)。采精后6 h進(jìn)行首次檢測(cè)，之后每12 h檢測(cè)一次。

1.3.8統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用 SPSS 20.0 中 One Way-ANOVA過(guò)程對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2結(jié)果

2.1　靚精預(yù)處理對(duì)卵母細(xì)胞成熟的影響

實(shí)驗(yàn)共分4組：處理組成熟液分別添加濃度0.5%(v/v)、0.75%和1%的靚精，正常成熟液作為對(duì)照組。卵母細(xì)胞在不同成熟液中預(yù)處理1 h后全部移入正常成熟液，對(duì)成熟44 h卵母細(xì)胞分別通過(guò)DAPI染色和孤雌激活評(píng)價(jià)其成熟率及卵母細(xì)胞后期發(fā)育能力。

結(jié)果如表1和表2所示，不同濃度靚精處理后，卵母細(xì)胞成熟率與對(duì)照組間沒(méi)有顯著差異；對(duì)后期發(fā)育結(jié)果統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，所有組間卵裂率和囊胚率都沒(méi)有顯著差異，然后對(duì)囊胚進(jìn)行TUNEL染色統(tǒng)計(jì)囊胚總細(xì)胞數(shù)和凋亡細(xì)胞數(shù)，均未發(fā)現(xiàn)顯著差異。

表1M199中添加靚精對(duì)卵母細(xì)胞成熟率的影響

組別培養(yǎng)卵/枚成熟卵/枚成熟率/%對(duì)照1138676.11±3.730.5%1199478.99±5.010.75%1138877.88±3.641%1179076.92±3.44

注：組間沒(méi)有顯著差異(P>0.05)，表中成熟率數(shù)據(jù)為平均數(shù)±SD。

表2M199中添加靚精對(duì)卵母細(xì)胞孤雌后發(fā)育能力的影響

組別孤雌卵/枚卵裂率/%囊胚率/%囊胚細(xì)胞/個(gè)凋亡細(xì)胞/個(gè)對(duì)照249168(67.46±2.21)85(34.08±3.1)69±1.732.37±0.190.5%243157(64.61±1.62)79(32.62±0.8)68.09±1.262.56±0.240.75%264173(65.53±1.82)97(36.81±1.4)67.72±1.252.69±0.171%264164(62.12±2.12)79(29.86±1.3)66.25±1.372.5±0.14

注：組間沒(méi)有顯著差異(P>0.05)

2.2　靚精預(yù)處理對(duì)孤雌胚胎發(fā)育的影響

卵母細(xì)胞電激活后，放入含有靚精和正常的化學(xué)輔助激活藥物的培養(yǎng)液滴中，4 h后全部換至正常胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

結(jié)果顯示對(duì)照組的卵裂率(61.22%)和囊胚率(35.54%)與添加靚精的實(shí)驗(yàn)組間均無(wú)顯著差異，4組囊胚染色后總細(xì)胞數(shù)和凋亡細(xì)胞數(shù)間同樣沒(méi)有顯著差異(表3)。

表3PZM-3中添加靚精對(duì)卵母細(xì)胞孤雌后期發(fā)育的影響

組別孤雌卵/枚卵裂率/%囊胚率/%囊胚細(xì)胞/個(gè)凋亡細(xì)胞/個(gè)對(duì)照228139(61.22±2.4)81(35.54±1.1)67.08±2.31.78±0.10.5%244146(59.95±2.1)80(33.02±1.2)65.23±1.12.29±0.140.75%237140(59.19±1.9)88(36.98±0.8)68.39±1.62.03±0.161%241135(56.15±0.4)75(31.34±2.6)64.08±0.82.38±0.13

注：組間沒(méi)有顯著差異(P>0.05)

2.3　精液稀釋液中添加靚精對(duì)精子的影響

利用添加不同濃度靚精的精液稀釋液對(duì)采集到的公豬原精液進(jìn)行稀釋，借助CASA系統(tǒng)對(duì)精子運(yùn)動(dòng)特性進(jìn)行評(píng)價(jià)，6 h進(jìn)行首次檢測(cè)，之后間隔12 h檢測(cè)一次。從表4中可以發(fā)現(xiàn)在30 h時(shí)0.75%靚精處理組的直線運(yùn)動(dòng)精子活率顯著高于1%組，而與其他兩組間無(wú)顯著差異。42 h時(shí)0.75%靚精處理組的精子活率顯著高于對(duì)照組，而與0.5%及1%兩組間沒(méi)有顯著差異；并且0.75%靚精處理組的A+B級(jí)精子比例顯著高于對(duì)照組和0.5%組；而0.75%組的直線運(yùn)動(dòng)精子活率顯著高于其他3組。

2.4　精液稀釋液中添加靚精對(duì)體外受精的影響

精子經(jīng)添加不同濃度靚精的精液稀釋液稀釋后放置一天，用于體外受精。卵母細(xì)胞未經(jīng)靚精處理，用于評(píng)價(jià)靚精處理對(duì)精子受精能力的影響。

結(jié)果如表5所示，含不同濃度靚精的精液稀釋液稀釋的精液用于體外受精后，觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照組卵裂率(61.08%)和囊胚率(21.62%)與其他3組間沒(méi)有顯著差異；進(jìn)一步進(jìn)行囊胚凋亡染色，發(fā)現(xiàn)囊胚細(xì)胞數(shù)和凋亡細(xì)胞數(shù)間也都沒(méi)有顯著差異。

3討論

靚精的主要成分為聚維酮碘，而聚維酮碘屬鹵素類消毒劑對(duì)革蘭氏陰性、陽(yáng)性菌、真菌和病毒具有廣譜殺滅作用。研究表明，PVP-I對(duì)于常見(jiàn)的腸道桿菌、革蘭氏陰性桿菌、芽孢、病毒、螺旋體、革蘭陽(yáng)性球菌等微生物均有良好的殺滅效果，且很少出現(xiàn)耐藥性反應(yīng)[3，4]。每毫升豬鮮精中通常含有104~105個(gè)細(xì)菌，而鮮精中微生物指標(biāo)往往是影響精液的保存時(shí)間和品質(zhì)的關(guān)鍵[6]，在被感染的豬精液中發(fā)現(xiàn)的許多病毒被報(bào)道與不孕或降低繁殖力相關(guān)[7]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)不同濃度靚精處理對(duì)精子活力、卵母細(xì)胞成熟、胚胎發(fā)育等指標(biāo)的評(píng)價(jià)，系統(tǒng)地評(píng)估靚精是否會(huì)對(duì)精子的運(yùn)動(dòng)及受精能力產(chǎn)生不利影響，以及精液稀釋液中的靚精殘留是否會(huì)對(duì)卵母細(xì)胞及胚胎的發(fā)育能力產(chǎn)生影響。

表4精液稀釋液中添加靚精對(duì)精子的影響

時(shí)間組別重復(fù)次數(shù)檢測(cè)項(xiàng)目精子活率/%A+B/%直線運(yùn)動(dòng)精子活率/%VCL(μm/s)VSL(μm/s)ALH(μm/s)LIN/%6hC683.52±3.3478.90±5.1145.99±10.2936.30±3.0224.92±2.434.15±0.0568.76±5.420.5%685.50±5.8879.18±10.3052.74±4.0534.82±6.4623.38±4.854.14±0.0467.07±4.650.75%684.83±4.9579.43±9.9552.70±5.2236.34±4.1822.97±5.214.10±0.0862.70±8.621%680.91±3.6874.17±6.2350.12±3.9039.03±4.6225.10±3.154.11±0.0364.31±3.6318hC672.86±4.1662.64±9.8737.20±7.2335.84±4.4821.95±4.174.08±0.0861.12±8.480.5%677.12±5.9567.82±11.8940.56±8.2240.68±4.8623.94±4.174.06±0.0558.69±6.030.75%676.32±3.9370.82±6.0242.19±6.3538.48±7.3922.86±7.584.06±0.0758.22±8.151%677.34±5.3969.15±8.4638.61±5.4234.06±5.9722.43±6.134.07±0.1359.15±14.9930hC665.61±10.4956.23±9.7429.06±6.55ab37.59±3.8822.24±3.614.06±0.0559.01±5.830.5%673.41±6.1665.77±10.7929.69±3.13ab37.86±3.4523.08±5.004.08±0.1060.65±10.840.75%673.42±2.2964.87±5.4033.20±6.47a37.05±7.3022.42±6.144.07±0.0559.78±5.701%667.99±6.4460.70±8.4725.30±2.84b35.96±4.2521.98±4.604.08±0.1060.35±11.0842hC660.62±6.47a49.67±9.23a21.95±5.37a32.85±2.9918.85±2.974.05±0.0657.29±6.650.5%664.47±5.48ab50.67±6.61a24.35±5.32a32.58±3.3620.82±3.214.11±0.0563.71±5.610.75%671.05±2.08b62.63±7.93b30.21±4.82b31.40±4.6617.77±4.804.04±0.0855.94±8.921%664.51±1.94ab56.45±6.40ab20.85±3.63a34.01±5.1619.53±3.574.05±0.0757.60±8.26

注：同時(shí)間同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)的不同字母表示差異顯著(P<0.05)，表中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±SD。A+B表示根據(jù)精子運(yùn)動(dòng)速度所得快速前向運(yùn)動(dòng)精子(A級(jí))和慢速或呆滯前向運(yùn)動(dòng)精子(B級(jí))的比例之和。平均曲線運(yùn)動(dòng)速度(Curvilinear velocity，VCL)：即精子頭部沿其實(shí)際行走曲線運(yùn)動(dòng)的速度。平均直線運(yùn)動(dòng)速度(Straight line velocity，VSL)：也稱前向運(yùn)動(dòng)速度，即精子頭部直線移動(dòng)距離的速度。精子平均側(cè)擺幅度(Amplitude of lateral head displacement，ALH)：精子頭實(shí)際運(yùn)動(dòng)軌跡對(duì)平均路徑的側(cè)擺幅度。運(yùn)動(dòng)的直線性(Linearity，LIN)：也稱線性度，即精子運(yùn)動(dòng)曲線的直線分離度，即 VSL/VCL。

表5精液稀釋液中添加靚精對(duì)IVF的影響

組別重復(fù)次數(shù)受精卵/枚卵裂率/%囊胚率/%囊胚細(xì)胞/個(gè)凋亡細(xì)胞/個(gè)對(duì)照4167102(61.08±2.9)36(21.62±1.3)55.06±1.11.86±0.080.5%4165102(61.82±1.4)38(22.89±0.9)50.90±1.91.80±0.130.75%4165105(63.64±0.9)38(23.12±1.5)56.56±2.02.09±0.111%416498(59.76±1.4)33(20.12±1.8)48.99±1.22.33±0.17

注：組間沒(méi)有顯著差異(P>0.05)，表中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±SD。

研究表明豬卵母細(xì)胞的成熟質(zhì)量會(huì)影響到其受精或孤雌后的胚胎發(fā)育能力，而排出第一極體可作為豬卵母細(xì)胞成熟的標(biāo)志[8]。本實(shí)驗(yàn)中成熟率的統(tǒng)計(jì)就是通過(guò)對(duì)成熟培養(yǎng)44 h后的卵母細(xì)胞進(jìn)行DAPI染色觀察第一極體的排出率而得出的。結(jié)果顯示，卵母細(xì)胞在含不同濃度靚精的成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)1 h后，再恢復(fù)正常成熟液進(jìn)行體外成熟后的成熟率與對(duì)照組間沒(méi)有顯著差異。這提示在實(shí)際應(yīng)用中，精液稀釋液中少量的靚精殘留不會(huì)對(duì)卵母細(xì)胞產(chǎn)生不良影響。同時(shí)觀察到無(wú)論是在成熟培養(yǎng)液中還是在胚胎培養(yǎng)液中添加靚精，胚胎的卵裂率、囊胚率及囊胚總細(xì)胞數(shù)、凋亡細(xì)胞數(shù)在各組間都沒(méi)有顯著差異。結(jié)合這些結(jié)果表明靚精不會(huì)危害卵母細(xì)胞的成熟及其后續(xù)發(fā)育能力。

影響精液質(zhì)量及精子活率的因素很多，包括溫度、稀釋液pH值和化學(xué)成分等[9]。本實(shí)驗(yàn)中添加靚精至精液稀釋液中，使用計(jì)算機(jī)輔助精液分析系統(tǒng)(CASA)檢測(cè)精子指標(biāo)[10]。結(jié)果顯示，添加0.75%的靚精可以延長(zhǎng)精子的保持較高活率的時(shí)間，這可能是靚精通過(guò)抑制微生物的繁殖，降低了微生物對(duì)精子保存的不利影響。更重要地是，通過(guò)體外受精實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了靚精處理不會(huì)影響精子的受精能力和受精后胚胎的發(fā)育能力。

在本實(shí)驗(yàn)中，0.75%的靚精對(duì)豬卵母細(xì)胞的成熟及后期發(fā)育，以及精液保存無(wú)不良影響。上述結(jié)果初步提示，在實(shí)際生產(chǎn)中使用靚精不會(huì)對(duì)精子和卵母細(xì)胞受精及胚胎發(fā)育能力產(chǎn)生不良影響。但在實(shí)際生產(chǎn)中，其最佳處理濃度及相關(guān)影響，仍需要通過(guò)人工授精試驗(yàn)來(lái)確認(rèn)。

參考文獻(xiàn)4

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通訊作者：田見(jiàn)暉(1968-)，男，土家族，博士，教授。E-mail:tianjh@cau.edu.cn

作者簡(jiǎn)介：陳丹朔(1988-)，女，碩士，胚胎工程。E-mail:chdsh0412@163.com

收稿日期：2015-11-20

中圖分類號(hào)：S828.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1005-2739(2016)01-0003-05