陳丹朔，薛振華，張振南，王曉東，張楨妮，王書敏，安　磊，云　鵬，田見暉*，李樹靜，4*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，河北 保定 071001；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，北京 100094；

3.北京市畜牧總站，北京 100107；4.北京安伯胚胎生物技術(shù)中心，北京 100107)

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靚精對豬精子、卵母細胞和胚胎的影響

陳丹朔1，2，薛振華3，張振南1，王曉東2，張楨妮2，王書敏2，安磊2，云鵬3，田見暉2*，李樹靜1，4*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，河北 保定 071001；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，北京 100094；

3.北京市畜牧總站，北京 100107；4.北京安伯胚胎生物技術(shù)中心，北京 100107)

摘要：靚精是一個消毒劑的新產(chǎn)品，可用于精液常溫保存過程的微生物污染的預(yù)防。為了確認靚精對精子、卵子以及早期胚胎的影響，本實驗利用病原抑制實驗篩選出的三個靚精濃度，0.5%(v/v)、0.75%和1%，并分別添加至精液稀釋液、卵母細胞成熟培養(yǎng)液、胚胎的培養(yǎng)液中，觀察靚精對豬卵母細胞的成熟、胚胎發(fā)育、精子活力以及受精能力等的影響。結(jié)果表明，三個處理濃度的靚精對卵母細胞的成熟質(zhì)量、體外發(fā)育能力，精子的運動和受精能力均無顯著影響。因此，靚精作為廣譜消毒劑，可以在豬精液常溫保存過程中添加，以改善精液保存品質(zhì)。

關(guān)鍵詞：靚精；豬；精子；卵母細胞；胚胎

資助項目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系北京市生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團隊項目(25015015)

李樹靜(1963-)，男，博士，教授。

E-mail:lshujing@hotmail.com

豬人工授精技術(shù)是集約化養(yǎng)豬的關(guān)鍵技術(shù)，可大幅提高優(yōu)良種公豬利用效率。精液在常溫保存過程中有可能受到微生物的污染，從而影響輸精效果。因此，在精液中添加對精子、卵子以及胚胎沒有毒性，而對微生物具有抑制作用的消毒劑，可以通過提高精液品質(zhì)來改善人工輸精效果[1]。聚維酮碘為碘伏的一種，是表面活性劑聚乙烯吡咯烷酮(PVP)與碘的復(fù)合物[2]。聚維酮碘對真菌、病毒和革蘭氏陰陽性菌都具有殺滅作用[3，4]。靚精是一個消毒劑的新產(chǎn)品，其主要成分為聚維酮碘(PVP-I)，可用于精液常溫保存過程的微生物污染的預(yù)防。

1材料與方法

1.1　實驗材料

1.1.1卵巢的采集

豬的卵巢取自位于北京郊區(qū)的屠宰場。將離體的卵巢及時放入裝有含雙抗(青霉素和鏈霉素，各1 000單位/mL)的37℃生理鹽水的保溫瓶中，3 h內(nèi)運回實驗室。

1.1.2豬的精液

豬的精液取自北京中順景盛種豬改良有限公司。

1.2　主要化學(xué)試劑

本研究用于精液保存、卵母細胞成熟、受精、激活以及胚胎發(fā)育所涉及的生化試劑除標注外均購自Sigma公司。配制各種液體所用的水均為經(jīng)MilliQ過濾的超純水。

1.3　實驗方法

1.3.1卵母細胞體外成熟

將取回的卵巢用含雙抗的滅菌生理鹽水清洗3次，放入38℃的水浴鍋中，使用20 mL的注射器從卵巢表面上直徑為3~6 mm的卵泡中抽取卵丘卵母細胞復(fù)合體(COCs)，將抽取液放于15 mL離心管中，38℃水浴靜置至完全沉淀，洗卵液TL清洗兩次，顯微鏡下?lián)烊“?層以上卵丘細胞的COCs。

將挑選好的卵母細胞移入覆蓋有礦物油且預(yù)先平衡2 h以上的M199中洗3次，再移入覆蓋礦物油且平衡好的M199滴中，每滴60 μl，放入20~15個卵母細胞，培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)條件為5% CO2的空氣，38.5℃及100%相對飽和濕度。

1.3.2卵母細胞孤雌激活及體外培養(yǎng)

將脫去卵丘的成熟卵母細胞，先用事先預(yù)熱的融合/激活液洗滌3遍，之后將其轉(zhuǎn)移到已經(jīng)鋪滿激活液的融合槽中，施加電脈沖進行電激活，之后放入平衡2 h以上含CB和CHX的PZM-3培養(yǎng)滴中洗3次，再放入相同溶液的培養(yǎng)滴中進行化學(xué)輔助激活，4 h后移出并用PZM3 培養(yǎng)液洗滌3遍，轉(zhuǎn)移到礦物油覆蓋并預(yù)先在 5% CO2培養(yǎng)箱中平衡至少2 h以上的PZM3 發(fā)育液滴中繼續(xù)培養(yǎng)。38.5℃，5% CO2，飽和濕度下培養(yǎng)48 h和168 h分別記錄卵裂和囊胚形成結(jié)果。

1.3.3精液的處理

實驗前一天取回精液后，首先取出2 mL放入管中，并置于37℃水浴鍋中，20~30 min后檢測精子活力和密度，精液于17℃恒溫箱中保存。實驗當天，取10 mL精液加入離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入預(yù)熱的PBS-BSA洗一次，1 000 r/min離心5 min，棄上清，將沉淀吸出放入含有獲能液的離心管中，呈45°放入培養(yǎng)箱獲能，30 min后取出檢測精子活力及密度。

1.3.4體外受精

將成熟好的COCs脫去顆粒后放入受精液滴中，每滴50 μl，放入15~20個卵母細胞，然后放入50 μl獲能的精液。放入5% CO2，38.5℃及100%相對飽和濕度的培養(yǎng)箱中受精，6 h后將卵母細胞移入平衡4 h以上的胚胎培養(yǎng)液中洗去精子，再換入新的胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)。38.5℃，5%CO2，飽和濕度下培養(yǎng)48 h和168 h分別記錄卵裂和囊胚形成結(jié)果。

1.3.5卵母細胞染色(DAPI)

成熟44 h的卵母細胞在透明質(zhì)酸酶中脫去顆粒細胞，放入4%PFA中固定45 min，然后在含0.1%PVA的PBS中洗3次，每次5 min，接著使用DAPI染色，5 min后壓片，觀察結(jié)果，以排出第一極體認為成熟。

1.3.6囊胚細胞計數(shù)及凋亡染色

使用TUNEL試劑盒染色。囊胚先于含0.5%Triton的4%PFA中固定通透，37℃，45 min；染色液為試劑一(Label)和試劑二(Enzyme)以9：1的體積比混合，固定好的囊胚在含0.1%PVA的PBS中洗3次，每次5 min，接著在染色液中染色1 h，PBS-PVA洗3次，最后DAPI染色5~10 min。

1.3.7精子檢測方法

使用計算機輔助精液分析(CASA)進行精液檢測。采精后6 h進行首次檢測，之后每12 h檢測一次。

1.3.8統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)結(jié)果用平均數(shù)±標準差表示，利用 SPSS 20.0 中 One Way-ANOVA過程對數(shù)據(jù)進行分析處理。

2結(jié)果

2.1　靚精預(yù)處理對卵母細胞成熟的影響

實驗共分4組：處理組成熟液分別添加濃度0.5%(v/v)、0.75%和1%的靚精，正常成熟液作為對照組。卵母細胞在不同成熟液中預(yù)處理1 h后全部移入正常成熟液，對成熟44 h卵母細胞分別通過DAPI染色和孤雌激活評價其成熟率及卵母細胞后期發(fā)育能力。

結(jié)果如表1和表2所示，不同濃度靚精處理后，卵母細胞成熟率與對照組間沒有顯著差異；對后期發(fā)育結(jié)果統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，所有組間卵裂率和囊胚率都沒有顯著差異，然后對囊胚進行TUNEL染色統(tǒng)計囊胚總細胞數(shù)和凋亡細胞數(shù)，均未發(fā)現(xiàn)顯著差異。

表1M199中添加靚精對卵母細胞成熟率的影響

組別培養(yǎng)卵/枚成熟卵/枚成熟率/%對照1138676.11±3.730.5%1199478.99±5.010.75%1138877.88±3.641%1179076.92±3.44

注：組間沒有顯著差異(P>0.05)，表中成熟率數(shù)據(jù)為平均數(shù)±SD。

表2M199中添加靚精對卵母細胞孤雌后發(fā)育能力的影響

組別孤雌卵/枚卵裂率/%囊胚率/%囊胚細胞/個凋亡細胞/個對照249168(67.46±2.21)85(34.08±3.1)69±1.732.37±0.190.5%243157(64.61±1.62)79(32.62±0.8)68.09±1.262.56±0.240.75%264173(65.53±1.82)97(36.81±1.4)67.72±1.252.69±0.171%264164(62.12±2.12)79(29.86±1.3)66.25±1.372.5±0.14

注：組間沒有顯著差異(P>0.05)

2.2　靚精預(yù)處理對孤雌胚胎發(fā)育的影響

卵母細胞電激活后，放入含有靚精和正常的化學(xué)輔助激活藥物的培養(yǎng)液滴中，4 h后全部換至正常胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

結(jié)果顯示對照組的卵裂率(61.22%)和囊胚率(35.54%)與添加靚精的實驗組間均無顯著差異，4組囊胚染色后總細胞數(shù)和凋亡細胞數(shù)間同樣沒有顯著差異(表3)。

表3PZM-3中添加靚精對卵母細胞孤雌后期發(fā)育的影響

組別孤雌卵/枚卵裂率/%囊胚率/%囊胚細胞/個凋亡細胞/個對照228139(61.22±2.4)81(35.54±1.1)67.08±2.31.78±0.10.5%244146(59.95±2.1)80(33.02±1.2)65.23±1.12.29±0.140.75%237140(59.19±1.9)88(36.98±0.8)68.39±1.62.03±0.161%241135(56.15±0.4)75(31.34±2.6)64.08±0.82.38±0.13

注：組間沒有顯著差異(P>0.05)

2.3　精液稀釋液中添加靚精對精子的影響

利用添加不同濃度靚精的精液稀釋液對采集到的公豬原精液進行稀釋，借助CASA系統(tǒng)對精子運動特性進行評價，6 h進行首次檢測，之后間隔12 h檢測一次。從表4中可以發(fā)現(xiàn)在30 h時0.75%靚精處理組的直線運動精子活率顯著高于1%組，而與其他兩組間無顯著差異。42 h時0.75%靚精處理組的精子活率顯著高于對照組，而與0.5%及1%兩組間沒有顯著差異；并且0.75%靚精處理組的A+B級精子比例顯著高于對照組和0.5%組；而0.75%組的直線運動精子活率顯著高于其他3組。

2.4　精液稀釋液中添加靚精對體外受精的影響

精子經(jīng)添加不同濃度靚精的精液稀釋液稀釋后放置一天，用于體外受精。卵母細胞未經(jīng)靚精處理，用于評價靚精處理對精子受精能力的影響。

結(jié)果如表5所示，含不同濃度靚精的精液稀釋液稀釋的精液用于體外受精后，觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照組卵裂率(61.08%)和囊胚率(21.62%)與其他3組間沒有顯著差異；進一步進行囊胚凋亡染色，發(fā)現(xiàn)囊胚細胞數(shù)和凋亡細胞數(shù)間也都沒有顯著差異。

3討論

靚精的主要成分為聚維酮碘，而聚維酮碘屬鹵素類消毒劑對革蘭氏陰性、陽性菌、真菌和病毒具有廣譜殺滅作用。研究表明，PVP-I對于常見的腸道桿菌、革蘭氏陰性桿菌、芽孢、病毒、螺旋體、革蘭陽性球菌等微生物均有良好的殺滅效果，且很少出現(xiàn)耐藥性反應(yīng)[3，4]。每毫升豬鮮精中通常含有104~105個細菌，而鮮精中微生物指標往往是影響精液的保存時間和品質(zhì)的關(guān)鍵[6]，在被感染的豬精液中發(fā)現(xiàn)的許多病毒被報道與不孕或降低繁殖力相關(guān)[7]。

本實驗通過不同濃度靚精處理對精子活力、卵母細胞成熟、胚胎發(fā)育等指標的評價，系統(tǒng)地評估靚精是否會對精子的運動及受精能力產(chǎn)生不利影響，以及精液稀釋液中的靚精殘留是否會對卵母細胞及胚胎的發(fā)育能力產(chǎn)生影響。

表4精液稀釋液中添加靚精對精子的影響

時間組別重復(fù)次數(shù)檢測項目精子活率/%A+B/%直線運動精子活率/%VCL(μm/s)VSL(μm/s)ALH(μm/s)LIN/%6hC683.52±3.3478.90±5.1145.99±10.2936.30±3.0224.92±2.434.15±0.0568.76±5.420.5%685.50±5.8879.18±10.3052.74±4.0534.82±6.4623.38±4.854.14±0.0467.07±4.650.75%684.83±4.9579.43±9.9552.70±5.2236.34±4.1822.97±5.214.10±0.0862.70±8.621%680.91±3.6874.17±6.2350.12±3.9039.03±4.6225.10±3.154.11±0.0364.31±3.6318hC672.86±4.1662.64±9.8737.20±7.2335.84±4.4821.95±4.174.08±0.0861.12±8.480.5%677.12±5.9567.82±11.8940.56±8.2240.68±4.8623.94±4.174.06±0.0558.69±6.030.75%676.32±3.9370.82±6.0242.19±6.3538.48±7.3922.86±7.584.06±0.0758.22±8.151%677.34±5.3969.15±8.4638.61±5.4234.06±5.9722.43±6.134.07±0.1359.15±14.9930hC665.61±10.4956.23±9.7429.06±6.55ab37.59±3.8822.24±3.614.06±0.0559.01±5.830.5%673.41±6.1665.77±10.7929.69±3.13ab37.86±3.4523.08±5.004.08±0.1060.65±10.840.75%673.42±2.2964.87±5.4033.20±6.47a37.05±7.3022.42±6.144.07±0.0559.78±5.701%667.99±6.4460.70±8.4725.30±2.84b35.96±4.2521.98±4.604.08±0.1060.35±11.0842hC660.62±6.47a49.67±9.23a21.95±5.37a32.85±2.9918.85±2.974.05±0.0657.29±6.650.5%664.47±5.48ab50.67±6.61a24.35±5.32a32.58±3.3620.82±3.214.11±0.0563.71±5.610.75%671.05±2.08b62.63±7.93b30.21±4.82b31.40±4.6617.77±4.804.04±0.0855.94±8.921%664.51±1.94ab56.45±6.40ab20.85±3.63a34.01±5.1619.53±3.574.05±0.0757.60±8.26

注：同時間同列數(shù)據(jù)肩標的不同字母表示差異顯著(P<0.05)，表中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±SD。A+B表示根據(jù)精子運動速度所得快速前向運動精子(A級)和慢速或呆滯前向運動精子(B級)的比例之和。平均曲線運動速度(Curvilinear velocity，VCL)：即精子頭部沿其實際行走曲線運動的速度。平均直線運動速度(Straight line velocity，VSL)：也稱前向運動速度，即精子頭部直線移動距離的速度。精子平均側(cè)擺幅度(Amplitude of lateral head displacement，ALH)：精子頭實際運動軌跡對平均路徑的側(cè)擺幅度。運動的直線性(Linearity，LIN)：也稱線性度，即精子運動曲線的直線分離度，即 VSL/VCL。

表5精液稀釋液中添加靚精對IVF的影響

組別重復(fù)次數(shù)受精卵/枚卵裂率/%囊胚率/%囊胚細胞/個凋亡細胞/個對照4167102(61.08±2.9)36(21.62±1.3)55.06±1.11.86±0.080.5%4165102(61.82±1.4)38(22.89±0.9)50.90±1.91.80±0.130.75%4165105(63.64±0.9)38(23.12±1.5)56.56±2.02.09±0.111%416498(59.76±1.4)33(20.12±1.8)48.99±1.22.33±0.17

注：組間沒有顯著差異(P>0.05)，表中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±SD。

研究表明豬卵母細胞的成熟質(zhì)量會影響到其受精或孤雌后的胚胎發(fā)育能力，而排出第一極體可作為豬卵母細胞成熟的標志[8]。本實驗中成熟率的統(tǒng)計就是通過對成熟培養(yǎng)44 h后的卵母細胞進行DAPI染色觀察第一極體的排出率而得出的。結(jié)果顯示，卵母細胞在含不同濃度靚精的成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)1 h后，再恢復(fù)正常成熟液進行體外成熟后的成熟率與對照組間沒有顯著差異。這提示在實際應(yīng)用中，精液稀釋液中少量的靚精殘留不會對卵母細胞產(chǎn)生不良影響。同時觀察到無論是在成熟培養(yǎng)液中還是在胚胎培養(yǎng)液中添加靚精，胚胎的卵裂率、囊胚率及囊胚總細胞數(shù)、凋亡細胞數(shù)在各組間都沒有顯著差異。結(jié)合這些結(jié)果表明靚精不會危害卵母細胞的成熟及其后續(xù)發(fā)育能力。

影響精液質(zhì)量及精子活率的因素很多，包括溫度、稀釋液pH值和化學(xué)成分等[9]。本實驗中添加靚精至精液稀釋液中，使用計算機輔助精液分析系統(tǒng)(CASA)檢測精子指標[10]。結(jié)果顯示，添加0.75%的靚精可以延長精子的保持較高活率的時間，這可能是靚精通過抑制微生物的繁殖，降低了微生物對精子保存的不利影響。更重要地是，通過體外受精實驗，證實了靚精處理不會影響精子的受精能力和受精后胚胎的發(fā)育能力。

在本實驗中，0.75%的靚精對豬卵母細胞的成熟及后期發(fā)育，以及精液保存無不良影響。上述結(jié)果初步提示，在實際生產(chǎn)中使用靚精不會對精子和卵母細胞受精及胚胎發(fā)育能力產(chǎn)生不良影響。但在實際生產(chǎn)中，其最佳處理濃度及相關(guān)影響，仍需要通過人工授精試驗來確認。

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通訊作者：田見暉(1968-)，男，土家族，博士，教授。E-mail:tianjh@cau.edu.cn

作者簡介：陳丹朔(1988-)，女，碩士，胚胎工程。E-mail:chdsh0412@163.com

收稿日期：2015-11-20

中圖分類號：S828.3

文獻標識碼：A

文章編號：1005-2739(2016)01-0003-05