牛麗麗畢力格巴圖牧仁肖瑞王憶霄姜麗麗溫建勛王秀娟邊艷超

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)分子病理學(xué)重點實驗室;2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)雜志社; 3.內(nèi)蒙古師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院

肌源性干細胞研究進展

牛麗麗1畢力格巴圖2牧仁3肖瑞1王憶霄1姜麗麗1溫建勛1王秀娟1邊艷超1

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)分子病理學(xué)重點實驗室;2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)雜志社; 3.內(nèi)蒙古師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院

近年來，具有巨大臨床應(yīng)用潛能的成體干細胞已經(jīng)成為生命科學(xué)研究的熱點之一。肌源性干細胞具有強大的自我更新和多項分化潛能，能分化為神經(jīng)細胞、胰島細胞、成骨細胞等不同胚層的細胞，并能參與多種組織的損傷修復(fù)過程，在脊髓損傷修復(fù)及治療壓力性尿失禁中發(fā)揮巨大作用，因此，在基因治療和組織工程領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用前景。

肌源性干細胞 更新 分化 損傷修復(fù)

近年來，具有巨大臨床應(yīng)用潛能的成體干細胞已經(jīng)成為生命科學(xué)研究的熱點之一。肌源性干細胞（muscle-derived stem cells,MDSCs），是肌肉來源的多能干細胞的一個通稱，它的具體組分、不同組分之間的確切關(guān)系尚未確定，具有強大的自我更新和多項分化潛能，在適當(dāng)?shù)臈l件下不僅能分化為中胚層細胞類型，如：成肌細胞、成骨細胞、軟骨細胞、內(nèi)皮細胞和造血譜系，還可以打破胚層的限制分化為外胚層和內(nèi)胚層的細胞類型[1-2]，并參與多種組織的損傷修復(fù)過程，在基因治療和組織工程領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用前景。

一、肌源性干細胞的分離純化

1999年Jackson等[3]報道，利用Hoechst/流式細胞儀法從小鼠骨骼肌中分離到一群與衛(wèi)星細胞明顯不同的干細胞,這些細胞表達造血干細胞的表面標(biāo)志,能有效重建造血功能,說明這種具有分化多能性的肌源干細胞與肌肉干細胞或衛(wèi)星細胞是兩種不同的細胞。Gussoni E等在Nature雜志上也報道了用Hoechst/FACS方法純化MDSCs的方法，即3～5周齡小鼠骨骼肌中消化分離出的細胞，經(jīng)Hoechst33342染色，用FACS方法富集到MDSCs，移植到致死照射處理的小鼠體內(nèi)能有效重建造血系統(tǒng)。Lee等[4]（2000）、Jankowski等[5](2001)、Qu-Petersen等[6]（2002）用差速貼壁法從正常的骨骼肌中分離出三個細胞亞群：成纖維細胞很快在PP1和PP2培養(yǎng)板中貼壁，稱之為早期貼壁細胞群；PP3和PP4細胞貼壁稍慢，其主要成分為肌衛(wèi)星細胞，稱之為晚貼壁細胞群；PP5和PP6貼壁速度很慢，稱為慢貼壁細胞群，此細胞群為一種新的細胞群，其具有很高的分化潛能，稱之為肌源性干細胞。

國內(nèi)也有相關(guān)的報道，張金明等[7]（2006）采用差速貼壁分離技術(shù)，分別用Ⅺ型膠原酶、dispase蛋白酶及胰蛋白酶分步消化肌肉，得到了兔的MDSCs；遲猛等[8]（2008）采用消化法和差速貼壁法分離純化得到了人的MDSCs；韓穎等[9]（2008）使用膠原酶消化牛骨骼肌，然后采用差速貼壁分離技術(shù)純化獲得牛的MDSCs。

二、肌源性干細胞的表面標(biāo)志

干細胞表面特異性分子標(biāo)志，是區(qū)分不同干細胞的主要依據(jù)，肌源性干細胞的表面標(biāo)志已被初步認識，但其結(jié)果具有很大差異，這些不同的結(jié)果可能是由于各實驗室的條件、細胞分離培養(yǎng)方法及分析方法不同所造成。Lee[4-10]等通過免疫組化、PT-PCR和流式細胞術(shù)等方法分析MDSCs表達標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)其表達肌源標(biāo)志Desmin、Bcl-2、C-met，和干細胞標(biāo)志Sca-1、CD34，但不表達C-kit、CD45。Torrente[11]等報道MDSCs雖然也表達Sca-1、CD34，但不表達Desmin。Zhuqing Qu[12]等發(fā)現(xiàn)60%的原代MDSCs不表達Desmin，而傳代培養(yǎng)時Desmin陽性細胞逐漸增加。我們注意到造血干細胞的表達標(biāo)志如Sca-1、CD34也在MDSCs表達，而有些肌細胞的標(biāo)記卻不被MDSCs表達，這種現(xiàn)象說明當(dāng)干細胞的全能性增加，其組織特異性標(biāo)志減少,而不同組織來源的干細胞共有的標(biāo)志增多。

pax7是一個促進MDSCs向衛(wèi)星細胞分化的重要因子[13]。Olguin和Zammit等發(fā)現(xiàn)Pax7可以調(diào)節(jié)衛(wèi)星細胞的繁殖和自我更新[14-15],對衛(wèi)星細胞的功能起重要作用[16]。Pax7在MDSCs與衛(wèi)星細胞表達有所不同[17-18]，pax7-/-的小鼠中完全缺乏衛(wèi)星細胞而MDSCs數(shù)不受影響，說明MDSCs與衛(wèi)星細胞是兩種不同的細胞。

三、肌源性干細胞的分化潛能

MDSC具有多向分化潛能，在適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)素和生長因子的作用下能分化為不同胚層的細胞，如造血細胞、平滑肌細胞、成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、神經(jīng)細胞等。但MDSCs的分化機制尚不清楚，可能與細胞融合有關(guān)，因此也是目前研究的熱點。

1.MDSCs向神經(jīng)細胞分化

睫狀神經(jīng)因子作為一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，通過細胞表面的受體可以使得成肌細胞去分化而轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗄芨杉毎坏⒁簿哂姓T導(dǎo)多能干細胞向神經(jīng)細胞分化的功能，但具體機制尚不明確。曾祥一等（2009）應(yīng)用差速貼壁法和酶消化法獲得MDSCs后接種于6孔板內(nèi)，誘導(dǎo)組用含有睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的DMED預(yù)誘導(dǎo)24h，更換培養(yǎng)液，洗滌3次，再加入含丹參注射液的無血清DMEM誘導(dǎo)5h；對照組使用無血清DMEM培養(yǎng)基處理。結(jié)果顯示誘導(dǎo)前MDSCs未見神經(jīng)絲蛋白表達，誘導(dǎo)后的神經(jīng)元樣細胞神經(jīng)絲蛋白呈陽性表達；凝膠電泳及Western blot檢測結(jié)果顯示，與誘導(dǎo)前比較，誘導(dǎo)后對照組核因子kB抑制蛋白的表達無明顯變化，誘導(dǎo)組核因子kB抑制蛋白的表達明顯下降[19]。

李進等[20]（2008）從成年SD大鼠骨骼肌組織中培養(yǎng)出肌源性干細胞，采用bFGF、EGF誘導(dǎo)出神經(jīng)球樣細胞團，并檢測nestin免疫組化染色示強陽性。在再貼壁培養(yǎng)下，用RA、BDGF誘導(dǎo)分化，部分細胞表現(xiàn)出神經(jīng)元樣或膠質(zhì)細胞樣形態(tài)，并表達NSE、GFAP。為治療臂叢神經(jīng)根性撕脫傷及其它中樞神經(jīng)損傷提供了一種新方法。

2.MDSCs向胰島素分泌細胞分化

劉福強等用大鼠胰腺提取液（RPE）誘導(dǎo)MDSCs向胰島素分泌細胞分化，通過形態(tài)學(xué)觀察、雙硫腙（DTZ）染色、免疫細胞化學(xué)顯色、葡萄糖刺激實驗和RT-PCR對誘導(dǎo)細胞進行體外結(jié)構(gòu)和功能鑒定，結(jié)果顯示RPE誘導(dǎo)后第5日有胰島樣結(jié)構(gòu)出現(xiàn)；免疫細胞化學(xué)顯示，誘導(dǎo)后第12日細胞團表達胰島素、胰高血糖素，而未誘導(dǎo)組細胞不表達上述蛋白；RT-PCR結(jié)果表明，誘導(dǎo)后第6日檢測到PDX-1的表達，誘導(dǎo)后第12日檢測到胰島素1、胰島素2、胰高血糖素和葡萄糖轉(zhuǎn)運體2基因的表達。說明大鼠MDSCs可定向分化為胰島素分泌細胞[21]。

3.MDSCs向成骨細胞分化

肌肉中骨祖細胞的存在和MDSCs分化為成骨細胞的能力有效地促進了骨的愈合。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic proteins,BMPs）是TGF-β超家族的成員，廣泛分布于動物骨組織的酸性蛋白質(zhì)，在人類基因組中發(fā)現(xiàn)的BMP家族有20多個成員。BMP-2是已知的所有生長因子中對骨的形成最強的生長因子，對骨組織形成、生長和修復(fù)有促進作用[22]。經(jīng)BMP-2誘導(dǎo)的人MDSCs形態(tài)發(fā)生顯著變化，出現(xiàn)了胞體肥大并呈圓形的細胞，這些肥大的圓形細胞經(jīng)檢測證實，其胞體內(nèi)有ALP、骨鈣素的表達，說明MDSCs能向成骨細胞轉(zhuǎn)化，且隨著BMP-2劑量的增加，ALP、骨鈣素含量相應(yīng)增加[23]。Kuroda等[24]的研究表明由MDSCs的BMP-4的局部傳遞增強了小鼠的軟骨形成并促進了關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)。Peng等[25]研究發(fā)現(xiàn)VEGF與BMP-4能協(xié)同作用促進骨的愈合，但如果兩種因子的比例不當(dāng)，將對骨愈合產(chǎn)生有害的結(jié)果。W right等[26]用編碼BMP-4的反轉(zhuǎn)錄病毒體外轉(zhuǎn)染人MDSCs，移植到免疫力正常的小鼠后，成骨量少于SCID小鼠。Alden等[27]認為，表達BMP-2的腺病毒轉(zhuǎn)染MDSCs異體移植成骨存在免疫反應(yīng)。避免或減輕免疫反應(yīng)，改進并簡化MDSCs的分離和純化方法，過渡到自體細胞移植是尚待解決的重要問題。

四、肌源性干細胞在基因治療與組織工程中的應(yīng)用

1.在脊髓損傷修復(fù)中的應(yīng)用

常用于脊髓損傷修復(fù)的種子有胚胎神經(jīng)干細胞、嗅鞘細胞、骨髓基質(zhì)干細胞等，這些細胞移植至脊髓損傷區(qū)均能使損傷再生或修復(fù)，但都有其各自的缺點和不足。MDSCs具有誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細胞的潛能，并能向神經(jīng)干細胞一樣在中樞神經(jīng)組織里遷移和整合；自體移植又克服了倫理學(xué)爭議和排斥反應(yīng)等問題，是組織工程臨床用于脊髓損傷修復(fù)的理想種子細胞。

目前，干細胞移植治療脊髓損傷的機制尚不清楚，一般認為：①干細胞在適合的環(huán)境條件下具有分化為神經(jīng)細胞的潛能，神經(jīng)細胞從結(jié)構(gòu)上修復(fù)脊髓損傷。②植入的干細胞與定居部位神經(jīng)組織間相互作用，并產(chǎn)生某些細胞因子，這些細胞因子不僅能促進神經(jīng)功能的修復(fù)，也能保障植入干細胞的存活、增殖，并誘導(dǎo)神經(jīng)細胞向受損部位遷移。③干細胞本身也可以作為填充物填補損傷部位，定向再生為神經(jīng)細胞錨靠周圍組織完成上行下傳功能的重建，移植時創(chuàng)造抑制膠質(zhì)細胞再生、保護神經(jīng)細胞體存活、促進自體神經(jīng)細胞再生的微環(huán)境。④干細胞具有向血管內(nèi)皮祖細胞和神經(jīng)細胞方向分化的作用，有利于受損區(qū)神經(jīng)和血管組織的修復(fù)[28]。⑤減少損傷區(qū)的細胞凋亡。⑥抑制T細胞的增殖等[29-30]。

2.在治療壓力性尿失禁中的應(yīng)用

全世界約有20億人患有尿失禁，其嚴重影響了人們的生活質(zhì)量。壓力性尿失禁是尿失禁中最常見的一種類型，且發(fā)病率越來越高[31]。發(fā)生壓力性尿失禁的機制主要是尿道括約肌結(jié)構(gòu)及功能缺陷和膀胱頸支撐功能障礙。傳統(tǒng)的治療方法只能取得短期的療效，不能從本質(zhì)上糾正成肌功能障礙，而且還會引起慢性炎癥反應(yīng)，尿道周圍膿腫、糜爛，及尿道阻塞而引起尿潴留，內(nèi)臟器官偏移和肺栓塞等不良反應(yīng)[32]。

目前，治療壓力性尿失禁的最新方法就是應(yīng)用干細胞移植技術(shù)。在干細胞移植術(shù)中，所應(yīng)用的干細胞必須具有較強的增殖能力。MDSCs是肌肉內(nèi)高度未分化的多潛能干細胞，增殖快、融合慢、分化能力強存活率高等優(yōu)點，是治療壓力性尿失禁的一種理想的種子細胞。

Atalad等[33]最早報道了在一豬模型應(yīng)用培養(yǎng)的自體軟骨細胞治療壓力性尿失禁，他們還研究了使用人膀胱平滑肌細胞和尿道細胞在生殖泌尿重建中作組織替代[34]。Lee JY等[35]報道在一尿失禁模型注射肌肉干細胞和膠原，在注射后第四周肌肉干細胞和膠原具有相似的改善LPP和逼尿肌壓力的作用，但在移植后12周，膠原的作用明顯減弱而肌肉干細胞的作用持續(xù)。Peyromaur M等[36]研究了正常大鼠尿道肌源性細胞移植的存活和分化，發(fā)現(xiàn)移植后細胞可長期存在和分化。研究表明用人的肌源性干細胞治療婦女的壓力性尿失禁，與傳統(tǒng)的治療方法相比較取得了良好治療效果，但其具體的細胞移植數(shù)量和試驗中存在的隨機性還有待進一步研究[37]。

五、展望

近年來，隨著高新技術(shù)的發(fā)展、分子生物學(xué)的應(yīng)用和學(xué)科間的相互滲透，使基因治療和組織工程修復(fù)等的研究獲得了迅猛發(fā)展，特別是成體干細胞在組織修復(fù)中的應(yīng)用得到高度重視。肌源性干細胞取自自體，具有較強的自我更新能力和高度的可塑性，且不需要免疫抑制劑，也不存在倫理問題，因此在臨床上具有廣泛的應(yīng)用前景。

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