林仁敬，譚 蕊

白術(shù)七物顆粒對氣陰兩虛型結(jié)腸慢傳輸型便秘大鼠結(jié)腸組織血管活性腸肽及P物質(zhì)的影響

林仁敬，譚 蕊

【摘要】目的研究白術(shù)七物顆粒對氣陰兩虛型結(jié)腸慢傳輸型便秘(STC)大鼠結(jié)腸組織血管活性腸肽(VIP)及P物質(zhì)(SP)的影響，初步探討白術(shù)七物顆粒對氣陰兩虛型STC的治療作用及其作用機(jī)制。方法2014年10—12月，采用隨機(jī)數(shù)字表法將60只SD大鼠分為正常組、模型組、治療組，各20只。模型組、治療組予以皮下注射鹽酸嗎啡注射液，同時(shí)灌服青皮、枳殼、附子配方顆粒，建立氣陰兩虛型STC模型；正常組皮下注射等量等滲0.9%氯化鈉注射液。記錄造模期間大鼠的一般狀況，造模前、后24 h各組大鼠糞便干重，腸道炭末推進(jìn)率。造模成功后，治療組大鼠灌服白術(shù)七物顆粒水溶液，其余兩組灌服等量等滲0.9%氯化鈉溶液。給藥14 d后檢測各組大鼠結(jié)腸組織VIP、SP水平。結(jié)果正常組大鼠運(yùn)動(dòng)靈活，飲食、飲水、大小便正常；其余兩組大鼠造模后出現(xiàn)懶動(dòng)、毛色枯黃、大便次數(shù)減少、顆粒變大且質(zhì)硬等情況。造模前3組大鼠糞便干重比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。造模后模型組、治療組大鼠糞便干重低于正常組(P<0.05)。模型組、治療組大鼠腸道炭末推進(jìn)率小于正常組(P<0.05)。模型組、治療組大鼠VIP水平高于正常組(P<0.05)；治療組大鼠VIP水平低于模型組(P<0.05)。模型組、治療組大鼠SP水平低于正常組(P<0.05)；治療組SP水平高于模型組(P<0.05)。結(jié)論白術(shù)七物顆粒能有效治療氣陰兩虛型STC，其作用可能與下調(diào)VIP水平、升高SP水平有關(guān)。

結(jié)腸慢傳輸型便秘(slow transit constipation，STC)是一類主要以胃腸動(dòng)力明顯減弱為特點(diǎn)的頑固性便秘，迄今為止，其病因仍不完全明確[1]。臨床上常以大便次數(shù)減少、無便意、排便困難、排便不盡感為主要表現(xiàn)，癥狀頑固，治療困難[2]。目前，其發(fā)病率有逐年上升的趨勢，且有年輕化趨向[3]。本研究主要通過觀察白術(shù)七物顆粒對氣陰兩虛型STC大鼠結(jié)腸組織血管活性腸肽(VIP)、P物質(zhì)(SP)水平的影響，初步探討白術(shù)七物顆粒對氣陰兩虛型STC的治療作用及其作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用白術(shù)七物顆粒治療氣陰兩虛型STC提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物2014年10—12月選取無特定病原體(SPF)級SD大鼠60只，清潔級，雌雄各30只，體質(zhì)量200～220 g，均為湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司代為購買，動(dòng)物來源證號為：NO.43004700009363。于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)，室內(nèi)自然光照明，溫度(22±3)℃，相對濕度40%～70%。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為正常組、模型組、治療組，各20只，各組大鼠每天自由適量飲水?dāng)z食。

1.2主要試劑及藥物白術(shù)七物顆粒劑(專利號：201210057943.9)：購買于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科，每次用開水沖泡攪勻，制成含生藥24 g/kg的水溶液；青皮、枳殼、附子配方顆粒：購買于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科，每次用開水沖泡攪勻，制成含生藥13 g/kg的水溶液；鹽酸嗎啡注射液：沈陽第一制藥廠生產(chǎn)，10 mg/支，購買于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科；0.9%氯化鈉注射液：湖南金健藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，購買于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科；炭末混懸液：購買于長沙來弗曼生物科技有限公司；VIP、SP抗體：美國Abcam生產(chǎn)(VIP批號201311，SP批號201310)，購買于長沙來弗曼生物科技有限公司。

本研究創(chuàng)新點(diǎn)：

本研究探討中藥復(fù)方制劑白術(shù)七物顆粒多環(huán)節(jié)治療氣陰兩虛型結(jié)腸慢傳輸便秘(STC)的作用機(jī)制，初步論證了白術(shù)七物顆粒具有多藥理機(jī)制協(xié)同治療氣陰兩虛型STC的假說，其機(jī)制可能與下調(diào)血管活性腸肽(VIP)水平、提升P物質(zhì)(SP)水平有關(guān)，為中藥復(fù)方治療氣陰兩虛型STC的研究提供了一種新的模式或方向。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器電子精密天平(上海光學(xué)儀器廠)，眼科手術(shù)器械(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院提供)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1模型制備造模前將60只大鼠置于實(shí)驗(yàn)籠內(nèi)3 d，使其適應(yīng)環(huán)境。模型組、治療組參照文獻(xiàn)[4]的方法予以皮下注射鹽酸嗎啡注射液2.5 mg·kg-1·d-1，并參照文獻(xiàn)[5]中的方法同時(shí)灌服青皮、枳殼、附子配方顆粒(包括青皮18 g、枳殼18 g、附子15 g)13 g/kg；正常組皮下注射等量等滲0.9%氯化鈉注射液。連續(xù)45 d，1次/d。觀察造模期間大鼠的一般狀況，并予以電子精密天平稱取造模前、后24 h各組大鼠糞便干重。末次造模給藥24 h后，各組隨機(jī)抽取5只大鼠分別經(jīng)口灌入炭末混懸液1 ml/100 g，30 min后處死，運(yùn)用眼科手術(shù)器械立即解剖大鼠，截取直腸末端至幽門之間腸管，測量腸道全長及炭末推進(jìn)距離，再計(jì)算其占腸道全長百分比，即腸道炭末推進(jìn)率。

1.4.2給藥方法造模成功后，治療組大鼠按照體表面積[6]換算成成人等效劑量，即灌服含生藥量24 g·kg-1·d-1的白術(shù)七物顆粒水溶液；其余兩組灌服等量等滲0.9%氯化鈉溶液，連續(xù)14 d。實(shí)驗(yàn)期間，每隔2 d稱重1次，并根據(jù)體質(zhì)量變化情況調(diào)整給藥劑量，并給予所有大鼠自由飲水、攝食，每3～5 d清洗實(shí)驗(yàn)籠。

1.5觀察指標(biāo)給藥14 d后處死大鼠，切取部分結(jié)腸，縱向剪開，用0.9%氯化鈉溶液清洗并去除內(nèi)容物，經(jīng)液氮研磨制成質(zhì)量體積比為1∶10的勻漿，2 500 r/min低溫離心20 min(離心半徑13.5 cm)，留取上清液，-70 ℃保存待測。用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)法檢測VIP、SP水平。

2結(jié)果

2.1模型的評價(jià)

2.1.1一般狀況正常組大鼠運(yùn)動(dòng)靈活，飲食、飲水正常，大小便正常。其余兩組大鼠造模后出現(xiàn)懶動(dòng)、毛色枯黃、抵抗微弱、舌質(zhì)淡略胖大、少津、無苔、尾巴暗、大便次數(shù)減少、顆粒變大且質(zhì)硬等情況，解剖見糞便集中在結(jié)腸段，呈串珠狀或球狀，質(zhì)干硬。

2.1.2糞便干重比較造模前3組大鼠糞便干重比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；造模后3組大鼠糞便干重比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。造模后模型組、治療組糞便干重低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

Table 1Comparison of the number of rats having dry weight feces among the three groups

組別只數(shù)造模前造模后24h正常組205.55±0.225.51±0.24模型組205.54±0.234.06±0.33a治療組205.45±0.283.88±0.49aF值1.05118.58P值0.331<0.001

注：與正常組比較，aP<0.05

2.1.3腸道炭末推進(jìn)率比較正常組大鼠腸道炭末推進(jìn)率為(77.19±8.00)%，模型組為(31.93±3.30)%，治療組為(30.53±1.25)%。3組大鼠腸道炭末推進(jìn)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=378.46，P<0.05)；模型組、治療組大鼠腸道炭末推進(jìn)率小于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=32.95、33.97，P<0.05)。

根據(jù)對各組大鼠的一般狀況、糞便干重、腸道炭末推進(jìn)率的比較，證明氣陰兩虛型STC大鼠模型制備成功。

2.2VIP、SP水平比較3組大鼠VIP水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組、治療組大鼠VIP水平高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療組大鼠VIP水平低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3組大鼠SP水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組、治療組大鼠SP水平低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療組SP水平高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

Table 2Comparison of the VIP and SP expression levels in colon tissue of rats among the three groups

組別只數(shù)VIPSP正常組1588.20±14.21144.29±13.97模型組15120.93±16.29a98.00±19.79a治療組15100.45±17.09ab116.62±16.36abF值16.2134.71P值<0.001<0.001

注：與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；VIP=血管活性腸肽，SP=P物質(zhì)

3討論

STC是因結(jié)腸傳輸功能減弱致使腸內(nèi)容物滯留于結(jié)腸而引起的頑固性便秘。目前臨床上通常將功能性便秘分為3類：慢傳輸型便秘、出口梗阻型便秘、混合型便秘[7]。STC占便秘的16%～40%，約占功能性便秘的45.5%，是臨床上比較常見的一種類型[8]。長期慢性便秘不僅會(huì)給患者帶來許多苦惱，并且還在結(jié)腸癌、肝性腦病、乳腺疾病、早老性阿爾茨海默病等的發(fā)病中起著推波助瀾的作用[9]。便秘甚至可以因誘發(fā)急性心肌梗死或腦血管意外而直接危及患者生命[10]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)采用內(nèi)科治STC療效果常不甚滿意，手術(shù)治療有嚴(yán)格的手術(shù)適應(yīng)證且以后仍有一定的便秘復(fù)發(fā)率，并可能出現(xiàn)腹瀉等并發(fā)癥[11]。與西醫(yī)、西藥相比，中醫(yī)藥治療STC 不但在通便方面有優(yōu)勢，同時(shí)，對紊亂的胃腸功能也進(jìn)行了調(diào)整，使患者的體質(zhì)情況得到改善，提高了患者的生活質(zhì)量，在治療便秘方面有廣闊的發(fā)展前景[2]。本研究通過建立氣陰兩虛型STC大鼠模型，造模成功后治療組予以白術(shù)七物顆粒水溶液灌胃治療，通過ELISA法檢測各組STC大鼠結(jié)腸組織VIP、SP水平，旨在初步探討白術(shù)七物顆粒對氣陰兩虛型STC的治療作用及其作用機(jī)制。

VIP屬肽能神經(jīng)遞質(zhì)，是腸神經(jīng)系統(tǒng)中一種主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，能夠松弛胃腸道平滑肌，增強(qiáng)胃腸黏膜腺體分泌，抑制胃腸蠕動(dòng)。若其水平增高，則可減少胃腸黏膜的分泌活動(dòng)，抑制胃腸平滑肌收縮，從而抑制腸蠕動(dòng)而最終導(dǎo)致慢性便秘[12]。SP能神經(jīng)元存在于消化道管壁各層組織中，能夠促進(jìn)胃腸道肌肉收縮，屬于速激肽能神經(jīng)元。近年來有研究表明，STC患者結(jié)腸肌間神經(jīng)叢SP水平明顯降低，SP神經(jīng)病理改變和功能障礙與結(jié)腸傳輸功能障礙密切相關(guān)[13]。白術(shù)七物顆粒是由沉香四磨湯加生白術(shù)、生地黃化裁而來，方中重用生白術(shù)益氣健脾，為君藥；生地黃為臣藥，生津養(yǎng)血、滋陰清熱；木香善行胃腸之氣，且能助白術(shù)使脾氣得運(yùn)；檳榔尤擅行胃腸之氣，消積導(dǎo)滯，兼能緩瀉通便，為臣藥；沉香擅降氣溫中；烏藥擅行氣溫中；佐以升麻，升舉陽氣，諸藥合用，益氣養(yǎng)陰，行氣運(yùn)下，便秘自除[14]。

本研究結(jié)果顯示，模型組、治療組大鼠VIP水平高于正常組，治療組大鼠VIP水平低于模型組，提示白術(shù)七物顆粒灌胃治療能降低結(jié)腸組織中VIP水平。VIP是腸神經(jīng)系統(tǒng)中具代表性和研究較深入的神經(jīng)肽，也是重要的肽類神經(jīng)遞質(zhì)之一，許多研究已證明，VIP在胃腸運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)中主要起抑制效應(yīng)[15]。因此，上述結(jié)果的可能機(jī)制是，白術(shù)七物顆粒通過降低VIP對胃腸道的抑制作用促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng)。以往實(shí)驗(yàn)研究證明，SP是胃腸運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)中主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，對胃腸道的興奮作用表現(xiàn)為對胃腸縱行肌和環(huán)行肌有雙重的收縮效應(yīng)，包括直接的短時(shí)作用和緊隨的由膽堿能神經(jīng)釋放乙酰膽堿起的長時(shí)作用[16]。本研究結(jié)果顯示，模型組、治療組大鼠SP水平低于正常組，治療組SP水平高于模型組，提示白術(shù)七物顆粒能增加結(jié)腸組織中SP水平，其可能通過腸道局部SP來提高腸壁內(nèi)神經(jīng)元的興奮性，促進(jìn)腸運(yùn)動(dòng)，進(jìn)而達(dá)到有效治療STC的目的。

本研究仍存在不足之處，并未對白術(shù)七物顆粒降低VIP水平、升高SP水平的具體機(jī)制做進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，白術(shù)七物顆粒具有治療氣陰兩虛型STC的作用，其可通過下調(diào)結(jié)腸組織內(nèi)VIP水平、升高SP水平而達(dá)到治療作用，這為臨床使用白術(shù)七物顆粒治療氣陰兩虛型STC提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

作者貢獻(xiàn)：林仁敬進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負(fù)責(zé)；譚蕊進(jìn)行實(shí)驗(yàn)實(shí)施、評估、資料收集；林仁敬進(jìn)行質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：崔麗紅)

【關(guān)鍵詞】便秘；白術(shù)七物顆粒；氣陰兩虛；血管活性腸肽；P物質(zhì)

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Effect of Baizhu Qiwu Granules on VIP and SP of Colon Tissue of Rats With Colonic Slow Transit Constipation of Qi and Yin Deficiency TypeLINRen-jing,TANRui.DepartmentofAnorectal,theSecondAffiliatedHospitalofHunanUniversityofChineseMedieine,Changsha410005,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the influence of Baizhu Qiwu granules on vasoactive intestinal peptide (VIP) and substance P (SP) of colon tissue of rats with colonic slow transit constipation (STC) of qi and yin deficiency,and to preliminarily investigate the efficacy and mechanism of Baizhu Qiwu granules in the treatment of STC of qi and yin deficiency.MethodsFrom October to December in 2014,60 SD rats were divided into normal group (n=20),model group (n=20) and treatment group (n=20) by random number table method.Model group and treatment group were administrated with morphine hydrochloride injection by subcutaneous injection and were also administrated with formula granules composed of pericarpium citri reticulatae viride,fructus aurantii and aconitum carmichaelii to build STC models of qi and yin deficiency;normal group was administrated with the same amount of 0.9% sodium chloride injection by isotonic subcutaneous injection.The general condition of the rats was recorded;before model building and 24 hours after model building,the condition of dry weight faeces and the rate of charcoal propulsion in intestinal tract were observed.After successful model building,the treatment group was administrated with water solution of Baizhu Qiwu granules by drench.The other two groups were administrated with the same amount of 0.9% sodium chloride injection by isotonic subcutaneous injection.The VIP and SP levels in colon tissues of the rats were detected 14 days after drug administration.ResultsThe rats of the normal group had flexible motion and normal diet,drinking and defecation;the rats of the other two groups behaved sluggish in moving,with their hair dry and yellow,the amount of stool decreasing and the stool particle being smaller and harder.Before model building,the three groups were not significantly different in the number of rats having dry weight feces (P>0.05).After model building,the model group and the treatment group were lower than normal group in the number of rats having dry weight feces (P<0.05).The model group and treatment group were lower than normal group in the rate of charcoal propulsion in intestinal tract (P<0.05).The model group and treatment group were higher than normal group in VIP level (P<0.05);the treatment group was lower than the model group in VIP level (P<0.05).The model group and treatment group were lower than normal group in SP level (P<0.05);the treatment group was higher than model group in SP level (P<0.05).ConclusionBaizhu Qiwu granules are effective in the treatment of STC of qi and yin deficiency,and the mechanism may be related with the reduction of VIP level and the increase of SP level.

【Key words】Constipation;Baizhu Qiwu granule;Qi-yin deficiency;Vasoactive intestinal peptide;Substance P

(收稿日期：2015-05-09；修回日期：2015-10-14)

【中圖分類號】R 256.35

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.03.020

通信作者：譚蕊，410007 湖南省長沙市，湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床學(xué)院；E-mail：758577856@qq.com

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81302977)；湖南省教育廳重點(diǎn)學(xué)科中醫(yī)外科學(xué)資助項(xiàng)目(湘教發(fā)[2011]76號)
作者單位：410005 湖南省長沙市，湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院肛腸科(林仁敬)；湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床學(xué)院(譚蕊)

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