陳麗娟　石　琦　陳建琴　王秀秀　劉　暢　王渠源

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，吉林　長(zhǎng)春　130041)

?

子宮內(nèi)膜癌組織和血清中E盒結(jié)合鋅指蛋白表達(dá)及臨床意義

陳麗娟石琦1陳建琴2王秀秀劉暢王渠源

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，吉林長(zhǎng)春130041)

摘要〔〕目的研究E盒結(jié)合鋅指蛋白(ZEB)1在子宮內(nèi)膜癌、子宮內(nèi)膜不典型增生和正常子宮內(nèi)膜組織中的陽(yáng)性表達(dá)程度和血清蛋白濃度，探討其與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。方法隨機(jī)選擇116例子宮內(nèi)膜組織，其中正常內(nèi)膜組織20例，不典型增生內(nèi)膜15例，內(nèi)膜癌組織81例，應(yīng)用免疫組織化學(xué)發(fā)進(jìn)行標(biāo)記染色，以檢測(cè)在三種組織中ZEB1蛋白的表達(dá)情況。其次應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)20例正常內(nèi)膜、15例不典型增生、61例內(nèi)膜腺癌、12例特殊類(lèi)型癌(共108例)患者血清中ZEB1蛋白表達(dá)水平。結(jié)果ZEB1蛋白在子宮內(nèi)膜癌、不典型增生及正常內(nèi)膜中陽(yáng)性率逐漸下降(P=0.000)。ZEB1蛋白在子宮內(nèi)膜癌、不典型增生、正常內(nèi)膜血清中表達(dá)水平逐漸下降，其表達(dá)水平與組織表達(dá)水平呈正相關(guān)。結(jié)論ZEB1蛋白與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，有可能成為子宮內(nèi)膜癌早期診斷及判斷預(yù)后的一個(gè)客觀依據(jù)。

關(guān)鍵詞〔〕子宮內(nèi)膜癌；E盒結(jié)合鋅指蛋白(ZEB)1；浸潤(rùn)；轉(zhuǎn)移

1長(zhǎng)春市婦產(chǎn)醫(yī)院2成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院

第一作者：陳麗娟(1989-)，女，碩士，主要從事婦科腫瘤研究。

子宮內(nèi)膜癌是一組上皮性惡性腫瘤，近年來(lái)其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)且出現(xiàn)年輕化。子宮內(nèi)膜腺癌約占子宮內(nèi)膜癌的60%〔1〕。子宮內(nèi)膜癌常見(jiàn)的癥狀為絕經(jīng)后陰道不規(guī)則出血，易早期發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜病變，但Ⅰ～Ⅱ期死亡率仍在 5%～15%〔2〕。但是現(xiàn)在對(duì)于子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制尚不十分明確。E盒結(jié)合鋅指蛋白(ZEB)1是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移關(guān)系密切的蛋白，已在多種腫瘤中報(bào)道過(guò)，如：前列腺癌、肝癌、乳腺癌等，本研究探討ZEB1蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織及血清中的表達(dá)及臨床意義。

1資料與方法

1.1一般資料2013年10月至2014年10月我醫(yī)院婦科行子宮切除、診斷性刮宮及宮腔鏡檢查獲得的正常子宮內(nèi)膜、不典型子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜癌組織的蠟塊116例。其中正常子宮內(nèi)膜組織20例(增生期8例，分泌期12例)，年齡32～63歲，平均49.62歲；子宮內(nèi)膜不典型增生組織蠟塊15例，年齡28～53歲，平均41.23歲，子宮內(nèi)膜癌組織81例(其中特殊類(lèi)型12例：癌肉瘤、漿液性癌、透明細(xì)胞癌各2例，鱗癌6例，由于特殊類(lèi)型病例較少，故不做分期及分級(jí)統(tǒng)計(jì))；年齡35～72歲，平均52.41歲。子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞分化程度是根據(jù)國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)在1988年提出高中低三級(jí)分化即：G1:23例，G2:27例，G3:19例，臨床分期是根據(jù)FIGO在2009年制訂的手術(shù)-病理分期標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定進(jìn)行的：Ⅰ期和Ⅱ期56例，Ⅲ期及Ⅳ期13例；子宮肌層浸潤(rùn)，超過(guò)1/2為21例，未超過(guò)1/2為48例；出現(xiàn)盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移9例，未出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的60例。經(jīng)術(shù)后石蠟切片確定標(biāo)本的病理診斷。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑一抗ZEB1抗體北京博奧森生物技術(shù)有限公司研發(fā)的，SP-9710試劑盒和DAB試劑盒是由福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司研發(fā)的。ELISA試劑盒購(gòu)于南京建成生物有限公司(96T)，其他試劑為進(jìn)口或活產(chǎn)分裝試劑。

1.3免疫組化學(xué)法檢測(cè)ZEB1蛋白表達(dá)子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋切片，先用10%甲醛固定，再連續(xù)將每個(gè)蠟塊切除三張平均4 μm厚的片子，行HE染色后，在涂有多聚賴(lài)氨酸的玻片上將切片貼附以備用下一步的免疫組化染色，采用免疫組化SP法檢測(cè)ZEB1抗體(鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶)，檢測(cè)步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。石蠟切片HE染色法：細(xì)胞核呈藍(lán)色，胞質(zhì)呈紅色，紅細(xì)胞呈橘紅色，其他成分呈深淺不同紅色。免疫組化法：陽(yáng)性表發(fā)為棕黃色，細(xì)胞和用蘇木精復(fù)染為藍(lán)色。嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)流程操作免疫組化步驟。以淡黃色、中度黃色、棕黃色顆粒出現(xiàn)在細(xì)胞核中為陽(yáng)性表達(dá)。結(jié)果判定實(shí)在200倍鏡下觀察全片的陽(yáng)性細(xì)胞百分比和著色度。判定按陽(yáng)性細(xì)胞百分比：<10%為1分，10%～50%為2分，>50%為3分。判定按染色程度：陰性為0分，淡黃色為1分，中度黃色2分，棕黃色3分?？偡钟?jì)分=陽(yáng)性細(xì)胞得分×染色程度，總分<3分為陰性，≥3分為陽(yáng)性。

1.4ELISA方法檢測(cè)血清中ZEB1蛋白濃度所有入選對(duì)象均于入院后空腹抽取肘靜脈4 ml，置入不含熱源和內(nèi)毒素的試管中，操作過(guò)程中避免任何細(xì)胞刺激，3 500 r/5 min后將血清和紅細(xì)胞迅速分離，去上清液分裝入EP管中，置于-80℃冰箱保存，ELISA方法測(cè)定ZEB1蛋白濃度，試劑盒為南京建成生物有限公司，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。采用圖像分析系統(tǒng)測(cè)定圖片吸光度值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)和Pearson相關(guān)分析。

2結(jié)果

2.1ZEB1表達(dá)在正常子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜不典型增生和子宮內(nèi)腺癌組織的情況分析ZEB1蛋白在三種組織中的陽(yáng)性率逐漸下降(P=0.000)。ZEB1蛋白在腺癌組中的陽(yáng)性率高于不典型增生組(P=0.003)；ZEB1蛋白在腺癌組陽(yáng)性率明顯高于正常組(P=0.000)。見(jiàn)表1。

表1　ZEB1 在各組組織中的表達(dá)(n)

與不典型增生組比較：1)P<0.01；與正常組比較：2)P<0.001

2.2ZEB1蛋白表達(dá)與子宮內(nèi)膜腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系ZEB1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率在手術(shù)病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肌層浸潤(rùn)程度有明顯差異(P<0.05)，高分化與中分化差異不顯著(P>0.05)，中分化組與低分化組差異顯著(P<0.05)；ZEB1表達(dá)與年齡(P>0.05)及病理類(lèi)型〔腺癌組43例(62.32%)vs特殊類(lèi)型組7例(58.33%)，P=0.793〕無(wú)關(guān)。見(jiàn)表2。

表2　ZEB1陽(yáng)性表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌臨床病理

2.3ZEB1在血清及子宮組織中的表達(dá)的相關(guān)性ZEB1蛋白在正常子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜不典型增生和子宮內(nèi)膜腺癌的細(xì)胞核中均有表達(dá)，根據(jù)回歸曲線(xiàn)方程得出：正常組〔n=20,(0.07±0.03)pg/ml〕，不典型增生組〔n=15,(0.62±0.07)pg/ml〕，腺癌組〔n=61,(4.52±0.16)pg/ml〕。與腺癌組比較，正常組ZEB1濃度低(P<0.05)；不典型增生組與腺癌組比較，前者濃度低(P<0.05)。血清中ZEB1蛋白濃度與組織總吸光度呈線(xiàn)性相關(guān)，即表達(dá)量有差異(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖1　ELISA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.4血清 ZEB1 在子宮內(nèi)膜癌不同組織學(xué)分級(jí)中比較高分化(n=26)血清ZEB1表達(dá)水平(3.41±0.18 )pg/ml，中分化(n=23)(4.31±0.22)pg/ml，低分化(n=12)(5.84±0.42)pg/ml。ZEB1在子宮內(nèi)膜癌血清中隨著病理分級(jí)級(jí)別升高表達(dá)水平升高(P<0.05)。

2.5血清 ZEB1 在子宮內(nèi)膜癌病理分期中比較Ⅰ～Ⅱ期(n=52)血清 ZEB1 表達(dá)水平(4.13±0.37)pg/ml，Ⅲ～Ⅳ期(n=9)(5.49±0.46)pg/ml。ZEB1在子宮內(nèi)膜癌血清中隨著臨床分期級(jí)別升高表達(dá)水平升高(P<0.05)。

2.6血清 ZEB1 與子宮內(nèi)膜癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(n=54)(3.98±0.41)pg/ml，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(n=7)(5.76±0.51)pg/ml。ZEB1在子宮內(nèi)膜癌有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達(dá)濃度高(P<0.05)。

2.7ZEB1在不同類(lèi)型子宮內(nèi)膜癌血清中的表達(dá)情況子宮內(nèi)膜腺癌組(n=61)血清ZEB1表達(dá)水平(4.52±0.16)pg/ml，特殊類(lèi)型組(n=12)(4.75±0.25)pg/ml。兩者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.8ZEB1在血清中濃度與組織總表達(dá)情況的相關(guān)性所搜集的子宮內(nèi)膜腺癌標(biāo)本中有56例組織與血清是來(lái)自同一個(gè)人，是匹配進(jìn)行的，分析ZEB1蛋白在組織與血清中的表達(dá)趨勢(shì)大致相同，血清中ZEB1蛋白的濃度與組織中陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān)〔R=0.913，R=0.000(雙側(cè))〕。

3討論

惡性腫瘤預(yù)后較差就是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，ZEB1是最近較受重視的癌基因之一，發(fā)現(xiàn)其對(duì)腫瘤細(xì)胞作用的各個(gè)階段都有參與。近年來(lái)，在對(duì)于ZEB1中的研究中，發(fā)現(xiàn)下調(diào)ZEB1存在于骨肉瘤MG-63細(xì)胞中的表達(dá)水平，基因轉(zhuǎn)染未轉(zhuǎn)染組侵襲轉(zhuǎn)移能力明顯高于轉(zhuǎn)染組〔3〕，下調(diào)ZEB1存在于胃癌AGS細(xì)胞中的表達(dá)水平，可以改善腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移特性〔4〕。腫瘤的形成及發(fā)展可能與ZEB1的不平衡表達(dá)有一定的關(guān)系。ZEB1蛋白在宮頸癌組織中是高表達(dá)的，且其表達(dá)率與宮頸癌的臨床分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)宮旁組織及腫瘤分化程度有一定的聯(lián)系〔5〕，研究發(fā)現(xiàn)，ZEB1的表達(dá)與宮頸癌瘤體的大小無(wú)關(guān)〔6〕。ZEB1蛋白在上皮性卵巢癌中的表達(dá)明顯高于正常卵巢組織，且分化程度越高，ZEB1的表達(dá)越低，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者高于無(wú)轉(zhuǎn)移者，晚期卵巢癌明顯高于早期卵巢癌，而且，ZEB1蛋白的表達(dá)與卵巢癌患者年齡及病理分類(lèi)無(wú)關(guān)〔7〕，證實(shí)了ZEB1蛋白與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后有一定的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)提示ZEB1可能促進(jìn)正常細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化，因而促進(jìn)子宮內(nèi)膜病變。ZEB1蛋白與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展有一定的相關(guān)性。血清中的ZEB1蛋白高表達(dá)與腫瘤的低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、晚期的患者中更有意義。通過(guò)檢測(cè)血清中的ZEB1蛋白濃度有可能成為子宮內(nèi)膜癌相關(guān)的腫瘤標(biāo)記物之一。

參考文獻(xiàn)4

1Brosens LA.The role of the uterine junctional zone in the pathogenesis of pre-eclampsia〔J〕.Eur J Obetet Gynecol Reprod Biol,1995;63(2)：199.

2蔡樂(lè)，楊清，畢芳芳.煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及臨床意義〔J〕.現(xiàn)代腫瘤學(xué),2015;23(8)：1108-12.

3Shen A,Zhang Y,Yang H,etal.Overexpression of ZEB1 relates to metastasis and invasion in osteosarcoma〔J〕.J Surg Oncol,2012;105(8):803-34.

4Jia B,Liu H,Kong Q,etal.Overexpression of zeb1 associated with metastasis and invasion in patients with gastric carcinoma〔J〕.Mol Cell Biochem,2012;366(1-2):223-9.

5夏玉紅，張占莉，姚麗，等.宮頸癌組織中ZEB1表達(dá)及其臨床意義〔J〕.中國(guó)實(shí)用婦科與產(chǎn)科雜志,2013;7(9):599-61.

6湯雅玲，冉靜，趙巖.宮頸癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)因子ZEB1與micro-RNA200c的關(guān)系〔J〕.中國(guó)生化藥學(xué)雜志,2015;6(35):95-7.

7陳枝嵐，王晶，宋成文，等.卵巢上皮性癌中ZEB1的表達(dá)及其臨床意義〔J〕.中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué),2013;13(7):863-5.

〔2014-09-23修回〕

(編輯苑云杰)

通訊作者：王渠源(1965-)，男，碩士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，教授，主要從事婦科腫瘤研究。

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕R739〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號(hào)〕1005-9202(2016)01-0117-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.01.053