劉明明　劉永俠　付子毅

(東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院，江蘇　南京　210000)

?

miR-34a逆轉(zhuǎn)非小細(xì)胞肺癌A549/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性及其機(jī)制

劉明明劉永俠付子毅1

(東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院，江蘇南京210000)

摘要〔〕目的探討過(guò)表達(dá)miR-34a對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549/DDP細(xì)胞順鉑(DDP)耐藥性的影響及可能機(jī)制。方法成功構(gòu)建過(guò)表達(dá)miR-34a的真核載體pCDNA3.1+miR-34a后，將A549/DDP細(xì)胞分為對(duì)照組(無(wú)轉(zhuǎn)染)、空轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒)和過(guò)表達(dá)組(轉(zhuǎn)染pCDNA3.1+miR-34a)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)法檢測(cè)轉(zhuǎn)染24、48、72及96 h后各組miR-34a水平；給予不同濃度DDP(2、4、8、16、32和64 μg/ml)處理48 h后采用CCK-8法比較各組對(duì)DDP的敏感性，流式細(xì)胞儀PI/Annexin V雙染法檢測(cè)各組轉(zhuǎn)染48、96 h后的凋亡率，分別采用Western印跡檢測(cè)各組轉(zhuǎn)染48、96 h后常見耐藥基因的表達(dá)情況。結(jié)果A549/DDP細(xì)胞的miR-34a水平均低于其親本細(xì)胞A549和正常支氣管上皮細(xì)胞系HBE(P<0.05)；與其余兩組相比，過(guò)表達(dá)組轉(zhuǎn)染后的miR-34a水平升高，且對(duì)A549/DDP細(xì)胞的增殖抑制率升高(P<0.05)；過(guò)表達(dá)組的半數(shù)抑制濃度均低于其余兩組，過(guò)表達(dá)組轉(zhuǎn)染48、96 h后的凋亡率高于其余兩組，而轉(zhuǎn)染48 h后的P-糖蛋白、多藥耐藥相關(guān)蛋白1及肺耐藥相關(guān)蛋白的水平低于其余兩組(P<0.05)；對(duì)照組和空轉(zhuǎn)染組以上指標(biāo)的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論A549/DDP細(xì)胞中miR-34a水平較低，通過(guò)真核載體將其過(guò)表達(dá)后可抑制增殖率并提高其對(duì)DDP的敏感性，可能與其誘導(dǎo)凋亡及降低耐藥基因的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕miR-34a；非小細(xì)胞肺癌；順鉑；耐藥性

1南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京市婦幼保健院醫(yī)學(xué)研究中心

第一作者：劉明明(1984-)，女，藥師，主要從事藥物分析等藥學(xué)方面的研究。

由于肺癌癥狀不明顯，發(fā)病較為隱匿，多數(shù)確診時(shí)已為晚期，故系統(tǒng)化療仍為主要治療手段，但目前較為常見的化療耐藥限制了其效果，尋找逆轉(zhuǎn)化療耐藥的潛在策略已成為肺癌防治的熱點(diǎn)〔1～3〕。多項(xiàng)研究指出miRNA表達(dá)異常介導(dǎo)了腫瘤化療耐藥過(guò)程，提示篩選在化療耐藥過(guò)程中異常表達(dá)的miRNA可能有一定參考價(jià)值〔4,5〕。miR-34a在多種腫瘤組織中低表達(dá)，且參與了多種腫瘤的化療耐藥〔6，7〕，但目前其在肺癌化療耐藥中的作用尚不清楚。本研究選用A549細(xì)胞的順鉑(DDP)耐藥肺腺癌細(xì)胞系株A549/DDP進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)，通過(guò)目前常用的真核過(guò)表達(dá)體系pCDNA3.1+miR-34a上調(diào)其表達(dá)，進(jìn)一步觀察對(duì)其DDP敏感性的影響。

1資料與方法

1.1主要試劑A549及A549/DDP細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清及RNA快速抽提純化(Trizol)試劑盒購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司，脂質(zhì)體Lipofectamine 2000TM購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，CCK-8試劑盒購(gòu)自日本同仁公司，Power SYBR Green PCR Master Min購(gòu)于美國(guó)LifeTechnologies公司，miR-34a引物及過(guò)表達(dá)miR-34a的真核重組質(zhì)粒pCDNA3.1+miR-34a由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司構(gòu)建，小鼠抗人肺耐藥相關(guān)蛋白(LRP)單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司，山羊抗人P-糖蛋白(P-gp)單克隆抗體、多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)1單克隆抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，抗山羊和抗小鼠辣根過(guò)氧化物酶耦聯(lián)的二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)將凍存于液氮中的細(xì)胞復(fù)蘇后采用RPMI 1640培養(yǎng)液進(jìn)行常規(guī)條件培養(yǎng)(溫度保持在37℃、CO2濃度為5%及100%濕度)，A549、A549/DDP細(xì)胞均用含10%滅活胎牛血清、100 μg/ml鏈霉素和100 U/ml青霉素的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。此外，用于A549/DDP細(xì)胞培養(yǎng)的RPMI 1640培養(yǎng)液中添加DDP并調(diào)整終濃度至1 μg/ml。待以上兩種細(xì)胞達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)時(shí)，進(jìn)行傳代及后續(xù)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的A549/DDP細(xì)胞分為對(duì)照組、空轉(zhuǎn)染組和過(guò)表達(dá)組，對(duì)照組不行轉(zhuǎn)染處理，過(guò)表達(dá)組通過(guò)脂質(zhì)體 lipofectamine 2000將pCDNA3.1+miR-34a過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至A549/DDP細(xì)胞，空轉(zhuǎn)染組則轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒；分別于轉(zhuǎn)染24、48、72和96 h后提取各組RNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)法檢測(cè)各組miR-34a水平。

1.3qPCR檢測(cè)收集各組轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞，采用Trizol提取總RNA，并按照試劑盒說(shuō)明書依次進(jìn)行cDNA合成及qPCR反應(yīng)。(1)cDNA合成的逆轉(zhuǎn)錄體系體積為20 μl：總RNA 1 μg、5×逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液4 μl、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶200 U、隨機(jī)引物200 ng、10 mmol/L dNTP 1 μl及RNasin 20 U，采用ddH2O 補(bǔ)齊至20 μl。反應(yīng)條件：42℃ 60 min；70℃ 10 min。(2)取5.0 μl cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為95 ℃ 預(yù)變性30 s，94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。采用U6作為內(nèi)參。采用Ct值法(2-△△CT)進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.4CCK-8法(1)采用CCK-8試劑盒檢測(cè)轉(zhuǎn)染pCDNA3.1+miR-34a對(duì)A549/DDP細(xì)胞增殖的影響，分別于轉(zhuǎn)染24、48、72、96 h后，經(jīng)0.25%胰酶消化并制備單細(xì)胞懸液，每孔加入10 μl CCK-8試劑，培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h后，采用酶標(biāo)儀比色法檢測(cè)各組細(xì)胞在450 nm波長(zhǎng)下的吸光值(A)，根據(jù)公式計(jì)算增殖抑制率：抑制率=(1-A其余處理組)/A對(duì)照組×100%。(2)采用CCK-8試劑盒檢測(cè)A549/DDP細(xì)胞對(duì)DDP敏感性變化，向單細(xì)胞懸液加入濃度梯度的DDP(2、4、8、16、32和64 μg/ml)，轉(zhuǎn)染48 h后加入CCK-8并檢測(cè)A，根據(jù)增殖抑制率公式計(jì)算DDP的半數(shù)抑制濃度(IC50)。每組設(shè)5個(gè)平行孔。

1.6流式細(xì)胞術(shù)采用RPMI1640培養(yǎng)液將A549/DDP細(xì)胞調(diào)整至1×105個(gè)/ml，接種于96孔培養(yǎng)板中，分別于轉(zhuǎn)染48、96 h后收集各組細(xì)胞，采用75%冷乙醇于4℃固定過(guò)夜后，加入終濃度200 μg/ml RNase A，向各組細(xì)胞中加入Annexin V/FITC和PI進(jìn)行雙標(biāo)染色，染色15 min后采用FAC SAria流式細(xì)胞儀測(cè)定早、晚期凋亡率。

1.7Western印跡轉(zhuǎn)染48 h后收集各組細(xì)胞 5×106個(gè)，采用RIPA細(xì)胞裂解液裂解A549/DDP細(xì)胞，提取總蛋白并采用Lowry法檢測(cè)蛋白濃度。每孔取40 μg蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白分離后采用半干轉(zhuǎn)法將蛋白印跡轉(zhuǎn)移至PVDF膜上(孔徑為0.45 μm)，經(jīng)5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，分別加入P-gp、MRP1及LRP的一抗，覆蓋PVDF膜后4℃冰箱過(guò)夜，稀釋度依次為1∶200、1∶300和1∶200，TBST緩沖液洗膜3次，加二抗(1∶3 000稀釋)，37℃孵育1 h，TBST洗膜后采用ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光，曝光、顯影、定影后進(jìn)行目的條帶光密度分析，最終結(jié)果為目的條帶光密度與內(nèi)參GAPDH的比值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS15.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1A549/DDP細(xì)胞的miR-34a水平A549/DDP細(xì)胞的miR-34a水平(0.45±0.06)低于其親本細(xì)胞A549(0.75±0.11)和正常支氣管上皮細(xì)胞系HBE(1.03±0.09)，且A549的miR-34a水平亦低于HBE(P<0.05)。轉(zhuǎn)染24、48、72及96 h后，過(guò)表達(dá)組的miR-34a水平均高于對(duì)照組和空轉(zhuǎn)染組(P<0.05)，轉(zhuǎn)染96 h后過(guò)表達(dá)組的miR-34a水平分別升高至對(duì)照組的(6.21±0.74)倍和空轉(zhuǎn)染組的(6.34±0.90)倍，且對(duì)照組和空轉(zhuǎn)染組不同轉(zhuǎn)染時(shí)間點(diǎn)miR-34a水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見圖1。

圖1　轉(zhuǎn)染后A549/DDP細(xì)胞的miR-34a水平變化

2.2過(guò)表達(dá)miR-34a對(duì)A549/DDP細(xì)胞增殖的影響與其余兩組比較，過(guò)表達(dá)組的增殖抑制率升高(P<0.05)，且對(duì)照組和空轉(zhuǎn)染組各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；過(guò)表達(dá)組中隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長(zhǎng)，增殖抑制率升高，且轉(zhuǎn)染96 h后的增殖抑制率為(55.69±4.05)%，均高于其余時(shí)間點(diǎn)(P<0.05)。見表1。

表1　過(guò)表達(dá)miR-34a對(duì)A549/DDP細(xì)胞增殖率的影響

與空轉(zhuǎn)染組比較：1)P<0.05

2.3過(guò)表達(dá)miR-34a對(duì)A549/DDP細(xì)胞DDP耐藥的影響轉(zhuǎn)染48 h后，對(duì)照組、空轉(zhuǎn)染組和過(guò)表達(dá)組的IC50值依次為(36.02±2.93)、(34.66±2.70)和(14.52±1.78)μg/ml，過(guò)表達(dá)組的IC50值均低于其余兩組(P<0.05)，且對(duì)照組和空轉(zhuǎn)染組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

2.4過(guò)表達(dá)miR-34a對(duì)A549/DDP細(xì)胞凋亡的影響過(guò)表達(dá)組轉(zhuǎn)染48、96 h后的凋亡率均高于對(duì)照組和空轉(zhuǎn)染組，且過(guò)表達(dá)96 h后的早、晚期凋亡率高于48 h(P<0.05)；對(duì)照組和空轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染48、96 h后凋亡率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見表2。

表2　過(guò)表達(dá)miR-34a對(duì)A549/DDP細(xì)胞凋亡率的

對(duì)照組比較：1)P<0.05；與空轉(zhuǎn)染組比較：2)P<0.05；與48 h比較：3)P<0.05

2.5過(guò)表達(dá)miR-34a對(duì)A549/DDP細(xì)胞耐藥相關(guān)蛋白的影響過(guò)表達(dá)組轉(zhuǎn)染48 h后的P-gp、MRP1及LRP蛋白水平均低于對(duì)照組和空轉(zhuǎn)染組(P<0.05)；對(duì)照組和空轉(zhuǎn)染組耐藥相關(guān)蛋白無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見表3，圖2。

表3　過(guò)表達(dá)miR-34a對(duì)A549/DDP細(xì)胞耐藥相關(guān)蛋白的

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與空轉(zhuǎn)染組比較：2)P<0.05

圖2　過(guò)表達(dá)miR-34a對(duì)A549/DDP細(xì)胞耐藥相關(guān)蛋白的影響

3討論

近期研究發(fā)現(xiàn)miR-34a介導(dǎo)了多種腫瘤的耐藥，通過(guò)外源模擬物或質(zhì)粒載體上調(diào)其水平可起到逆轉(zhuǎn)耐藥或重建對(duì)化療藥物敏感性的效果〔8，9〕，提示上調(diào)miR-34a水平可能為一種潛在的逆轉(zhuǎn)策略。何靜等〔8〕發(fā)現(xiàn)miR-34a在乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和耐藥株MCF7/ADR中存在表達(dá)差異，而在耐藥細(xì)胞株中呈下調(diào)趨勢(shì)，本研究亦發(fā)現(xiàn)A549/DDP中的miR-34a水平低于其親本A549，與何靜等〔8〕的結(jié)果一致，表明miR-34a參與了多種腫瘤的化療耐藥過(guò)程。此外，miR-34a在胰腺癌細(xì)胞獲得性耐藥中發(fā)揮一定作用，如劉林〔7〕發(fā)現(xiàn)miR-34a表達(dá)減少參與了胰腺癌細(xì)胞株SW1990細(xì)胞對(duì)5氟尿嘧啶獲得性耐藥。以上結(jié)果進(jìn)一步提示miR-34a表達(dá)減少在腫瘤化療耐藥中發(fā)揮正向促進(jìn)作用。通過(guò)轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)miR-34a的質(zhì)粒載體或其模擬物miR-34a mimics可增強(qiáng)某些腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，如MCF-7/ADR對(duì)于多柔比星的敏感性〔8〕和SW1990細(xì)胞對(duì)5氟尿嘧啶的敏感性〔9〕。同時(shí)，miR-34重建對(duì)p53缺陷腫瘤的化療耐藥性亦有一定逆轉(zhuǎn)效果〔10〕。

本研究發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染24 h后即可發(fā)現(xiàn)miR-34a水平升高，且上調(diào)效果可持續(xù)至96 h，表明載體構(gòu)建較為成功，而空轉(zhuǎn)染組miR-34a水平與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明該載體安全可靠，避免了對(duì)研究的影響。將轉(zhuǎn)染成功的A549/DDP細(xì)胞暴露在濃度梯度的DDP中發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)后的細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性增強(qiáng)，主要表現(xiàn)在DDP對(duì)A549/DDP細(xì)胞的IC50降低，證實(shí)過(guò)表達(dá)miR-34a有助于逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞的化療耐藥，驗(yàn)證了本研究之前的假設(shè)，與相關(guān)報(bào)道的結(jié)論〔9，10〕一致。此外，本研究亦發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-34a A549/DDP細(xì)胞的增殖抑制率升高，提示過(guò)表達(dá)miR-34a可影響腫瘤細(xì)胞的增殖，并且過(guò)表達(dá)組細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞體積變小、核固縮等凋亡表現(xiàn)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果提示miR-34a本身具有抑癌基因的效果，總體上miR-34a增加A549/DDP細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性，有逆轉(zhuǎn)耐藥的潛能。

多項(xiàng)研究指出逆轉(zhuǎn)耐藥的潛在策略同樣可影響耐藥蛋白的相關(guān)表達(dá)〔11〕。本研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-34a后，3種在肺癌中常見的耐藥蛋白(LRP、P-gp和MRP1)水平均降低，且MRP1的降低幅度最大，推測(cè)可能為miR-34a發(fā)揮逆轉(zhuǎn)潛在的途徑。此外，有研究發(fā)現(xiàn)miR-34a還可通過(guò)多種途徑逆轉(zhuǎn)耐藥，如Wu等〔12〕發(fā)現(xiàn)miR-34a可通過(guò)靶向 HDAC1和 HDAC7 來(lái)調(diào)控乳腺癌化療中的耐藥過(guò)程。綜上所述，A549/DDP細(xì)胞中miR-34a水平較低，通過(guò)真核載體將其過(guò)表達(dá)后可提高其對(duì)DDP的敏感性從而達(dá)到逆轉(zhuǎn)耐藥的效果，可能與其抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡及降低耐藥基因的表達(dá)有關(guān)，上調(diào)miR-34a可能在逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞化療耐藥中有一定價(jià)值。

參考文獻(xiàn)4

1劉金，尤濤，黃京子，等.聯(lián)合應(yīng)用自噬抑制劑增加雷帕霉素引起的肺癌細(xì)胞凋亡〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2014；34(22)：6428-30.

2張彩霞，王成，郝立群，等.晚期非小細(xì)胞肺癌TKI耐藥后治療進(jìn)展〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2014；34(22)：6535-8.

3Gong Z，Yang J，Li J，etal.Novel insights into the role of microRNA in lung cancer resistance to treatment and targeted therapy 〔J〕.Curr Cancer Drug Targets，2014；14(3)：241-58.

4Wei J，Qi X，Zhan Q，etal.miR-20a mediates temozolomide-resistance in glioblastoma cells via negatively regulating LRIG1 expression 〔J〕.Biomed Pharmacother，2015；71(1)：112-8.

5Shi L，Wu L，Chen Z，etal.MiR-141 activates Nrf2-dependent antioxidant pathway via down-regulating the expression of Keap1 conferring the resistance of hepatocellular carcinoma cells to 5-fluorouracil 〔J〕.Cell Physiol Biochem，2015；35(6)：2333-48.

6蔣勝高，李秀娟，李文靜，等.miR-34a與人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7多柔比星耐藥的關(guān)系〔J〕.臨床檢驗(yàn)雜志，2014；32(1)：15-9.

7劉林.miR-34a在胰腺癌細(xì)胞獲得性耐藥中的作用研究〔D〕.武漢：華中科技大學(xué)，2012.

8何靜，楊洋.MiR-34a對(duì)乳腺癌Mcf-7/ADR細(xì)胞株多柔比星敏感性影響研究〔J〕.中華腫瘤防治雜志，2013；20(24)：1888-91.

9Fan YN，Meley D，Pizer B，etal.Mir-34a mimics are potential therapeutic agents for p53-mutated and chemo-resistant brain tumour cells 〔J〕.PLoS One，2014；9(9)：e108514.

10吉清.miR-34重建對(duì)p53缺陷腫瘤生長(zhǎng)及耐藥性的影響〔D〕.西安：第四軍醫(yī)大學(xué)，2008.

11Celestino AT，Levy D，Maria Ruiz JL，etal.ABCB1，ABCC1，and LRP gene expressions are altered by LDL，HDL，and serum deprivation in a human doxorubicin-resistant uterine sarcoma cell line 〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2015；457(4)：664-8.

12Wu MY，F(xiàn)u J，Xiao X，etal.MiR-34a regulates therapy resistance by targeting HDAC1 and HDAC7 in breast cancer 〔J〕.Cancer Lett，2014；354(2)：311-9.

〔2015-04-19修回〕

(編輯徐杰)

中圖分類號(hào)〔〕R735〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號(hào)〕1005-9202(2016)01-0052-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.01.023