王冬芽　周　青

(井岡山大學(xué)附屬醫(yī)院普外科，江西　吉安　343000)

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大腸癌中heregulin、表皮生長因子受體-2及基質(zhì)金屬蛋白酶-7表達(dá)及相關(guān)性

王冬芽周青1

(井岡山大學(xué)附屬醫(yī)院普外科，江西吉安343000)

摘要〔〕目的探討heregulin、表皮生長因子受體(ErbB)-2及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-7在大腸癌中蛋白和基因的表達(dá)及其相關(guān)性。方法收集47例大腸癌根治術(shù)后新鮮標(biāo)本為研究對象，用Western印跡法檢測heregulin、ErbB-2及MMP-7在腸癌組織、癌旁組織及遠(yuǎn)癌組織的蛋白表達(dá),用RT-PCR法檢測ErbB-2及MMP-7在三組的mRNA表達(dá)；比較分析三者與大腸癌臨床病理特征的關(guān)系。 結(jié)果heregulin和ErbB-2在腸癌組織的蛋白表達(dá)較癌旁組織顯著增多(P<0.01)，而癌旁組織比遠(yuǎn)癌組織的表達(dá)也有所增加(P<0.05)。MMP-7在腸癌組織的表達(dá)較癌旁組織增多，差異顯著(P<0.01)，遠(yuǎn)癌組織未見表達(dá)；腸癌組織中heregulin、ErbB-2及MMP-7的蛋白表達(dá)兩兩之間存在正相關(guān)關(guān)系。ErbB-2在腸癌組織的mRNA表達(dá)顯著高于遠(yuǎn)癌組織(P<0.05)；MMP-7的mRNA表達(dá)在腸癌組織顯著高于癌旁組織(P<0.01)，遠(yuǎn)癌組織未見表達(dá)。heregulin、ErbB-2及MMP-7的蛋白表達(dá)與大腸癌的分級、Dukes分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性。 結(jié)論heregulin、ErbB-2及MMP-7在大腸癌中過度表達(dá)；heregulin磷酸化激活ErbB-2后可能通過復(fù)雜的下游信號通路介導(dǎo)MMP-7表達(dá)上調(diào)，三者共同在大腸癌的浸潤侵襲中發(fā)揮重要作用；heregulin及ErbB-2 有望成為判斷大腸癌惡性進(jìn)展的重要指標(biāo)。

關(guān)鍵詞〔〕大腸癌；heregulin；表皮生長因子受體2；基質(zhì)金屬蛋白酶-7

1井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理教研室

在我國，隨著人口老齡化、飲食結(jié)構(gòu)及生活習(xí)慣的改變，大腸癌的發(fā)病率逐年上升〔1〕。眾多研究表明，表皮生長因子及其受體家族在大腸癌進(jìn)展中發(fā)揮著極其重要的作用。表皮生長因子受體2(ErbB-2)是表皮生長因子受體(EGFR)家族的中心成員，在多種惡性腫瘤進(jìn)展中起到關(guān)鍵作用〔2～7〕。heregulin是新近發(fā)現(xiàn)的表皮生長因子(EGF)家族成員〔8〕，它能專一激活乳腺癌中ErbB-2酪氨酸殘基的磷酸化，啟動系列細(xì)胞應(yīng)答，促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和浸潤〔9～12〕。然而heregulin與ErbB-2在大腸癌中表達(dá)的相關(guān)性及其意義目前研究甚少?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-7具有強(qiáng)大的基質(zhì)降解功能，是腫瘤惡性侵襲行為的關(guān)鍵因素之一〔13，14〕。本研究heregulin、ErbB-2及MMP-7在大腸癌中的蛋白和基因表達(dá)，探討三者表達(dá)的相關(guān)性，同時(shí)分析三者大腸癌組織學(xué)類型、分化程度及Dukes分期等病理學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系，以探討大腸癌浸潤和轉(zhuǎn)移的發(fā)生機(jī)制。

1材料與方法

1.1一般資料選取我院大腸癌根治術(shù)后的新鮮大腸癌組織標(biāo)本，分為：①大腸癌組47例，男25例，女22例，年齡30～79歲，中位年齡53歲。同時(shí)收集患者的臨床資料，包括組織學(xué)分型、分化程度、Dukes分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等。②癌旁組織組20例，取上述癌腫患者毗鄰腫瘤旁的腸黏膜組織。③遠(yuǎn)癌組織組12例，取上述癌腫患者腫瘤旁10 cm以外的腸黏膜組織。后二組經(jīng)病理證實(shí)均無腫瘤浸潤。

1.2Western印跡法檢測蛋白質(zhì)表達(dá)取樣品與5×上樣緩沖液混合煮沸5 min 后上樣進(jìn)行SDS- PAGE電泳；電泳后以穩(wěn)定18V電壓,半干法電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜,用含5%脫脂奶粉TBS/T 緩沖液封閉1 h，加入一抗,4℃過夜,洗膜,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗孵育1 h,暗室中ECL發(fā)光液覆蓋膜5 min,X 光膠片曝光,顯影,定影，PVDF膜上特異性條帶經(jīng)Olympus BX41凝膠成像儀掃描進(jìn)行相對定量。

1.3逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測基因表達(dá)按EZ Spin Column RNA Purification Kit說明提取總RNA。核酸蛋白分析儀鑒定RNA樣品的濃度和純度，正常RNA的吸光度(A)260 nm/280 nm比值均在1.9-2.0。以提取的RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)結(jié)束后取出cDNA按1∶1稀釋，4℃保存。用于real time PCR的兩對引物序列由上海生工生物工程公司合成。其中ErbB-2的引物序列為：上游引物：CCTCTGACGTCCATCATCTC，下游引物：ATCTTCTGCTGCCGTCGCTT；MMP-7的引物序列為：上游引物：TCTTTGGCCTACCTATAACTGG，下游引物：CTAGACTGCTACCATCCGTC。經(jīng)由40個(gè)循環(huán)的變性、退火和延伸，生成的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析，結(jié)果用靶基因/β-actin比值表示。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)分析軟件行方差分析和Pearson相關(guān)分析。

2結(jié)果

2.1heregulin、ErbB-2及MMP-7在各組的蛋白表達(dá)heregulin和ErbB-2在腸癌組織組的表達(dá)比癌旁組織組顯著增強(qiáng)，癌旁組織組又比遠(yuǎn)癌組織組明顯增多(圖1、表1、表2)。MMP-7在腸癌組織組表達(dá)較癌旁組織組顯著增加，遠(yuǎn)癌組織未見表達(dá)(圖1、表3)。

2.2ErbB-2及MMP-7在各組的mRNA表達(dá) ErbB-2在腸癌組織組的mRNA表達(dá)顯著高于遠(yuǎn)癌組織組，此外癌旁組織組比遠(yuǎn)癌組織組的表達(dá)有所增多，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2,表4)；MMP-7的mRNA表達(dá)在腸癌組織顯著高于癌旁組織(圖3,表4)，遠(yuǎn)癌組織未見表達(dá)。

圖1　heregulin、ErbB-2及MMP-7蛋白在各組的表達(dá)

2.3大腸癌組織中ErbB-2及MMP-7各自的mRNA表達(dá)與蛋白表達(dá)的相關(guān)性ErbB-2 mRNA表達(dá)及蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.78，P<0.01)，前者表達(dá)較高的標(biāo)本，后者表達(dá)也高。MMP-7在大腸癌組織中的mRNA表達(dá)及蛋白表達(dá)也呈顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.83，P<0.01)。

2.4大腸癌組織中heregulin、ErbB-2及MMP-7蛋白表達(dá)的相關(guān)性大腸癌組織中heregulin、ErbB-2及MMP-7蛋白表達(dá)兩兩之間呈正相關(guān)(P均<0.05)(表5)。

2.5heregulin、ErbB-2及MMP-7的蛋白表達(dá)與大腸癌臨床病理特征的關(guān)系在47例免疫印跡檢測的大腸癌組織中，heregulin、ErbB-2及MMP-7的蛋白表達(dá)與腫瘤組織學(xué)分級、Dukes分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有顯著相關(guān)性(P均<0.05)，而與患者年齡、性別及腫瘤的組織學(xué)類型無明顯相關(guān)(表6)。

表1　heregulin分別在腸癌組織組、癌旁組織組及遠(yuǎn)癌組織組的蛋白表達(dá)±s)

與遠(yuǎn)癌組織組比較：1)P<0.01，2)P<0.05；與癌旁組織組比較：3)P<0.05，下表同

表2　ErbB-2分別在腸癌組織組、癌旁組織組及遠(yuǎn)癌組織組的蛋白表達(dá)±s)

表3　MMP-7分別在腸癌組織組、癌旁組織組的蛋白表達(dá)±s)

與癌旁組織組比較：1)P<0.01

圖3　ErbB-2、MMP-7 mRNA在各組的表達(dá)

組別nErbBmRNAMMP-7mRNA大腸癌組4753.09±11.131)83.29±10.202)癌旁組織組2038.21±6.2037.78±5.91遠(yuǎn)癌組織組1230.29±10.20-

與遠(yuǎn)癌組織組比較：1)P<0.05；與癌旁組織組比較：2)P<0.01；-:未表達(dá)

表5　大腸癌組織中heregulin、ErbB-2及

1)P<0.01，2)P<0.05

表6　heregulin、ErbB-2及MMP-7的蛋白表達(dá)條帶強(qiáng)度與大腸癌臨床病理特征的關(guān)系

與低分化組比較：1)P<0.05；與C+D期比較：2)P<0.05；與有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組比較：3)P<0.05

3討論

大腸癌是一種常見的惡性腫瘤，近年來發(fā)病率有升高趨勢。癌基因ErbB-2，是表皮生長因子受體家族(EGFR家族)的中心成員，可在多種惡性腫瘤進(jìn)展中起到關(guān)鍵作用，為近年來腫瘤診治研究熱點(diǎn)〔15，16〕。當(dāng)前較多資料表明，ErbB-2參與大腸癌的發(fā)病機(jī)制，但具體觀點(diǎn)不盡相同。Li等〔17〕用熒光免疫雜交法及免疫組化法檢測結(jié)直腸癌中ErbB-2表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論在腫瘤早期基因擴(kuò)增獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄激活作用中，還是在腫瘤進(jìn)展后期基因擴(kuò)增依賴的過表達(dá)中，ErbB-2對CRC腫瘤發(fā)生都起著至關(guān)重要的作用。 李文婷等〔18，19〕報(bào)道ErbB-2蛋白在大腸癌組織過表達(dá)，并且其表達(dá)與大腸癌臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，可作為判定大腸癌生物學(xué)行為和預(yù)后的重要參考指標(biāo)。然而曾瑄等〔20〕觀點(diǎn)差異較大，研究采用熒光原位雜交法(FISH)和免疫組化法檢測了我國42例結(jié)直腸癌患者ErbB-2的蛋白表達(dá)和基因狀態(tài)，其研究顯示ErbB-2蛋白表達(dá)和基因拷貝數(shù)增加的效率均較低，推測不同的抗體和方法學(xué)以及標(biāo)本的儲存時(shí)間(影響染色強(qiáng)度)都可能是造成研究結(jié)果迥異的原因，因此提出有待于評分系統(tǒng)的統(tǒng)一和更大研究數(shù)據(jù)的積累。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，ErbB-2無論是基因水平還是蛋白水平的表達(dá)都與大腸癌的進(jìn)展及惡性程度密切相關(guān)。這與Li等〔17,18〕的研究結(jié)果比較一致。

heregulin是Holmes等于1992年在生長人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的培養(yǎng)基中分離得到，分子量為45 kD，它是表皮生長因子家族(EGF家族)的分支，具有表皮生長因子(EGF)樣結(jié)構(gòu)〔8〕。雖然資料報(bào)道heregulin在很多癌組織中表達(dá)，但有關(guān)大腸癌中heregulin表達(dá)及其作用的報(bào)道甚少。本研究提示heregulin與大腸癌的發(fā)生發(fā)展和惡性程度密切相關(guān)。

在對人乳腺癌的體內(nèi)外大量研究中發(fā)現(xiàn)，heregulin在人乳腺癌上皮細(xì)胞中具有促有絲分裂作用，heregulin與受體ErbB-3/4結(jié)合后，ErbB-2同ErbB-3/4之間形成異二聚體，隨之發(fā)生ErbB-2的磷酸化作用，自身磷酸化的ErbB-2緊接著磷酸化ErbB-3/4，進(jìn)而磷酸化激活下游信號蛋白，通過復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)誘導(dǎo)ErbB-2過表達(dá)細(xì)胞的增殖、黏附和運(yùn)動〔21，22〕。而有關(guān)大腸癌中heregulin與ErbB-2的相關(guān)性鮮見報(bào)道。本研究推測大腸癌中，heregulin可能磷酸化激活ErbB-2/3/4后，再進(jìn)一步增強(qiáng)其下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過復(fù)雜的分子機(jī)制誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲。

大量研究表明，腫瘤細(xì)胞侵襲浸潤的關(guān)鍵因素之一是腫瘤細(xì)胞周圍細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的降解〔23〕。ECM的降解又主要是依賴基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)來完成。MMPs是一組Zn2+依賴性蛋白酶，目前已發(fā)現(xiàn)至少25種MMP。MMP-7是MMPs家族分子量最小的成員，屬于基質(zhì)分解素一類，具有強(qiáng)大的基質(zhì)降解活性和廣泛的底物特異性〔24，25〕。眾多研究表明，MMP-7在結(jié)腸癌等腫瘤的侵襲浸潤中起重要作用，是腫瘤惡性進(jìn)展的標(biāo)志，可作為判斷惡性程度的指標(biāo)〔26～30〕。

依據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，推測在大腸癌組織中，很可能過表達(dá)的heregulin磷酸化激活過表達(dá)的ErbB-2，再激活一系列下游信號通路，應(yīng)答效應(yīng)之一是在核內(nèi)促進(jìn)MMP-7基因過表達(dá)，進(jìn)而促使MMP-7蛋白過表達(dá)，MMP-7再發(fā)揮強(qiáng)大的降解腫瘤細(xì)胞周圍ECM的作用，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對周圍組織的浸潤侵襲，最終影響大腸癌的惡性進(jìn)展及其預(yù)后。據(jù)此分析，heregulin及ErbB-2 可能成為大腸癌惡性程度及進(jìn)展的新分子標(biāo)記物。至于heregulin磷酸化ErbB-2后，其下游調(diào)節(jié)MMP-7表達(dá)的具體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，以及可能存在的與之交織的其他信號網(wǎng)絡(luò)等問題尚待進(jìn)一步研究。

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〔2014-06-30修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

通訊作者：周青(1981-)，女，碩士，講師，主要從事腫瘤病理學(xué)研究。第一作者：王冬芽(1981-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事腫瘤基礎(chǔ)與臨床研究。

中圖分類號〔〕R735.34〔

文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2016)01-0046-05；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.01.021